Abstract
Til tross for fremgang i lokoregionalt og systemisk behandling, pasientens overlevelse av lungekreft er fortsatt en utfordring. Reseptor-tyrosin-kinaser ofte er implisert i patogenesen lungekreft, og noen av tyrosin-kinase-inhiberende strategier har vært effektive klinisk. Den EphB4 reseptortyrosinkinasehemming har nylig dukket opp som et potensielt mål i flere andre kreftformer. Vi søkte systematisk studere rollen til EphB4 i lungekreft. Her viser vi at EphB4 er overuttrykt tre ganger i lungesvulster sammenlignet med sammenkoblede normalt vev og ofte viser genkopitallet økning i lungekreft. Vi viser også at overekspresjon av EphB4 fremmer celleproliferasjon, kolonidannelse, og bevegelighet, mens EphB4 hemming reduserer mobilnettet levedyktighet
in vitro
, stopper veksten av etablerte tumorer i mus xenograft modeller når det brukes som en single-target strategi , og fører til nesten fullstendig regresjon av etablerte tumorer når de brukes i kombinasjon med paklitaxel. Samlet utgjør disse dataene antyder en viktig rolle for EphB4 som en potensiell ny terapeutisk mål i lungekreft. Kliniske studier som undersøker effekten av anti-EphB4 behandlinger samt kombinasjonsbehandling involverer EphB4 hemming kan være berettiget
Citation. Ferguson BD, Liu R, Rolle CE, Tan Y-HC, Krasnoperov V, Kanteti R, et al. (2013) The EphB4 reseptortyrosinkinasehemming Fremmer Lung Cancer Vekst: En Potensielle nye terapeutiske mål. PLoS ONE 8 (7): e67668. doi: 10,1371 /journal.pone.0067668
Redaktør: Todd W. Miller, Dartmouth, USA
mottatt: 19 februar 2013; Godkjent: 21 mai 2013; Publisert: 02.07.2013
Copyright: © 2013 Ferguson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen har vært støttet delvis av NIH /NICHD T32HD009007, «Graduate Training i vekst og utvikling» (BDF), ASCO translasjonell Award (EEV), NIH /NCI R01 CA 129501 05 (RS), og Janice Lamb McArdle Cancer Research Foundation (RS ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. PSG er co-grunnlegger og direktør for Vasgene Therapeutics, Inc. VK en ansatt i Vasgene Therapeutics, Inc. Det er patenter og produkter i utvikling, men ingen markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfattere. De øvrige forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Selv om mange narkotika mål har blitt studert, har total overlevelse av lungekreft forbedret bare minimalt i løpet av de siste fire tiårene [1 ]. En hyppig karakteristisk for lungekreft er et avvik i hvilken en eller flere av reseptor-tyrosin-kinaser (RTK), for eksempel MET, EGFR, og ALK, blir ofte overuttrykt, forsterket, eller mutert [2] – [4]. Den Ef familie er den største familien av RTK, bestående av fjorten pattedyr reseptorer som samhandler med åtte pattedyr ligander eller ephrins. Ef reseptorer og ligander Efrin er organisert funksjonelt og strukturelt inn i A- og B-klasser [5]. Ef reseptorer er relativt lik på tvers av klasser; imidlertid, membranbundne Efrin-B-ligander er unike ved at de har ekstracellulære domener som aktiverer reseptorer, så vel som intracellulære domener som er tenkt å signalisere nedstrøms innenfor en tilstøtende celle [6]. Det er noen promiskuitet blant reseptor og ligand interaksjoner; en av de mest spesifikke reseptor-ligand interaksjoner, derimot, er mellom EphB4 og Efrin-B2 [7].
Klassisk, har Ef reseptorer vært store aktører i utviklingsbiologi gitt sine roller i axon veiledning, vaskulogenese, og neural utvikling [8]. Imidlertid har flere Ef-reseptor familiemedlemmer også vist seg å spille en rolle i kreft. Vi har nylig vist at EphA2 er overuttrykt i lungekreft og havner en gevinst-of-funksjon punktmutasjon i noen plateepitelkarsinom, og EphA2 hemming i tillegg til rapamycin eksponering i lungekreftceller redusert spredning
in vitro
[9]. EphB4 har også blitt rapportert å spille en onkogen rolle i kreft i hode og hals, [10], [11], prostata [12], [13], andre urin organer [14] – [19], bryst [20], mesothelium [21], spiserør [22], skin [23], og i tykktarmen [24], [25]. EphB4 mutasjoner er også nylig blitt rapportert i lungekreft [26], [27], selv om deres betydning er for tiden ukjent. Men det er ikke systematisk undersøkt i lungekreft og dens potensielle rolle i denne sykdommen forblir derfor et viktig spørsmål.
Her viser vi at EphB4 er en viktig terapeutisk mål i lungekreft, som det er overuttrykt og viser ofte økt genet kopiantall. Videre knockdown eller inhibering av EphB4 svekker veksten av kreftceller
in vitro
og
in vivo
, mens innføring av vill-type EphB4 gir en forsterkning av funksjon i tumorceller. Samlet utgjør disse dataene identifisere EphB4 som en potensielt viktig driver i patogenesen av lungekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
tumorvev ble dokumentert sammen med pasientkarakteristika når det er tilgjengelig med skriftlig informert samtykke og i samsvar med University of Chicago Institutional Review Board godkjent protokollen. Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Southern California og utføres i samsvar med dyrevernlovens bestemmelser.
Reagenser og antistoffer
Alle primere ble utformet ved hjelp Primer3Plus [28] og kjøpt fra Integrerte DNA Technologies (Coral IA). Anti-EphB4 antistoffer (# 265 for IB og # 131 for IHC), anti-Efrin-B2 antistoff (# 2B5) og humant serum albumin-konjugert løselig EphB4 (sEphB4-HSA), ble sjenerøst gitt av Gill Laboratory, Universitetet of Southern California. Efrin-B2 /Fc kimære protein ble kjøpt fra R D (Minneapolis MN). Anti-ß-aktin antistoff ble kjøpt fra Sigma (St. Louis MO). AZ12489875-002 var en sjenerøs gave fra Astrazeneca. SN-38 ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (Bristol UK).
Cell Culture
A549, H358, H522, H661, H1703, H1993, H2170, SW1573, BEAS-2B, H69, H82 ble H184, H249, H345, H446, H526, H2171, og PC3 cellelinjer kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas VA. celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP ble godkjent av ATCC og blir rutinemessig testet for tilstedeværelse av mycoplasma. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO2 i RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin, 2% natrium-bikarbonat, 1% natriumpyruvat, 1% HEPES-buffer, og 1% L-glutamin .
vev anskaffelser
Menneskelig lungekreftpasientarkiv vev ble hentet fra University of Chicago menneskelig vev Resource Center.
Immunohistochemistry
Parafin lungekreft vevet seksjonene ble deparaffinized i xylen, rehydrert gjennom graderte etanolløsninger til destillert vann, og vasket i Tris-bufret saltvann (TBS). Antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming seksjoner i citrat-buffer (pH 6) i 15 minutter i en mikrobølgeovn. Endogen peroksidaseaktivitet ble stoppet ved inkubering i 3% H
2o
2 i metanol i 5 minutter. Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved hjelp av protein blokk (Dako, Carpinteria, CA) i 20 minutter. Seksjoner ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med anti-EphB4 primære antistoff (anti-mus; # 131) ved en konsentrasjon på 40 ug /ml, og deretter inkubert i 30 minutter med geit-anti-mus-IgG konjugert med et HRP-merket polymer (Bio SB, Santa Barbara CA). Slides ble deretter utviklet i 5 minutter med 3,3′-diaminobenzidin kromogen, kontra med hematoksylin og coverslipped. Negative kontroller ble gjennomført ved å erstatte primære antistoff med ikke-immune mus immunoglobuliner. Colon kreft og hjerne vevssnitt tjente som positive kontroller for EphB4 farging [25], [29].
Tissue uttrykk for hver prøve ble kvantifisert ved manuell scoring på et 0/1 + /2 + /3 + skala , samt av en automatisert Cellular Imaging System (ACIS; Clarient, Aliso Viejo, CA), som quantitates fargeintensitet basert på forholdet mellom brunt til blått piksler per arealenhet. ACIS programvare beregner gjennomsnittsintensiteten for hver region analysert og beregner integrert optisk tetthet (IOD), som er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av antistoff-bundet EphB4 molekyler i henhold til Beer-Lambert loven [30]. Derfor er IOD en proxy for antigen-innhold, og det var normalisert til hele målte området ved å beregne IOD /10 um
2. Totalt sett, manuell scoring og ACIS analyse ble anvendt som parallelle ekspresjon kvantifisering metoder og ble funnet å ha en korrelasjon av r
2 = 0,75 (Spearman korrelasjon, s 0,0001, figur S1). Som uttrykk trender var lik med begge metodene, er først og fremst ACIS data rapportert her. Expression mønstre ved hjelp av den samme anti-EphB4 antistoff var lik i Dypfryst vevsprøver (figur S2).
Immunoblotting
Hel-cellelysater ble samlet inn ved hjelp M-PER pattedyr protein utvinning reagens (Pierce , Rockford IL) supplert med 1,8 × proteasehemmer (Pierce) og 1,8 × Halt fosfatase inhibitor (Pierce). Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved bruk av et Nanodrop spektrofotometer (Thermo, Wilmington DE) og 100 ug protein ble anbragt i en 7,5% gel og underkastet SDS-PAGE ved 80-120V i 1-2 timer. Proteiner ble overført på polyvinyliden-fluorid-membraner i en semi-tørr overføring apparat ved 25V i 1 time, vasket en kort stund, og membranene ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i en time ved romtemperatur. Etter en 5 minutters vask ble membranene eksponert i 1 time ved romtemperatur til anti-EphB4 primære antistoff (anti-mus; # 265) eller anti-Efrin-B2 primære antistoff (anti-mus; # 2B5) ved en konsentrasjon 0,5 ug /ml i 2,5% BSA /0,05% Tween-20. Membraner ble deretter vasket tre ganger i 10 minutter og inkubert som ovenfor i anti-muse-sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) ved en 1:5000 fortynning i 1 time. Etter en annen vask, ble membranene inkubert i forbedret chemiluminescence løsning (Bio-Rad, Hercules CA) og fotografert ved hjelp av en Bio-Rad QuantityOne imaging system. β-actin ble undersøkt på samme måte som en lasting kontroll. Prostatakreft-cellelinjen PC3 ble anvendt som en positiv kontroll for EphB4 uttrykk [19].
Flow Cytometry
Cellene ble vasket en gang med fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter dissosiert med PBS /0,2% EDTA ved 37 ° C i ca. 5 minutter. Etter nøytralisering av EDTA med kulturmedium, ble cellene sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. Cellene ble deretter vasket med kald PBS /0,5% BSA, etterfulgt av inkubering med 10% normalt geiteserum på is i 30 m, og deretter med primære antistoffer fortynnet i normalt geiteserum på is i 1 time. Celler ble deretter vasket med kald PBS og inkubert med fluorokromkonjugerte konjugerte sekundære antistoffer på is i 30 minutter. Etter en endelig vask med kald PBS, ble cellekjerner farvet med DAPI og analysert med et strømningscytometer (LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ).
Kvantitativ PCR
For å kunne bestemme EPHB4 genkopitallet i vevet DNA, ble real-time kvantitativ PCR utføres ved hjelp av en Applied Biosystems StepOne Plus instrument (Foster City CA). Reaksjonsblandinger inneholdt Fast SYBR Grønn Master Mix (2X, Applied Biosystems), genomisk DNA, forover og bakover qPCR primere (vist i tabell S1), og molekylærbiologi-klasse vann til totalt 25 mL per reaksjon. qPCR ved hjelp av line-1 primere ble utført i parallell for å tjene som et genkopitallet referanse mot hvilken for å normalisere rå fluorescens-verdier, og reaksjoner inneholdende forskjellige fortynninger av kontroll genomisk DNA (Promega, Madison WI) ble anvendt for å konstruere en standardkurve for å ekstrapolere vev DNA-konsentrasjoner og kontrollere at disse konsentrasjonene falt innenfor det lineære rekkevidden av instrumentet.
siRNA knockdown
for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer ble cellene belagt bruker antibiotika -fri medium i 96-brønners plater i en tetthet på 2,0 x 10
4 celler per brønn (for cellelevedyktighetsanalyser, åtte eller flere replikater per eksperiment) eller seks-brønns plater ved en tetthet på 5,0 x 10
5 celler per brønn (for hel-celle-lysat samling) og tillatt å vokse til 30-50% konfluens. Cellene ble transfektert hjelp Oligofectamine transfeksjon reagens (Life Technologies, Carlsbad CA) i henhold til sin standard protokoll. FBS ble tilsatt til 10% endelig konsentrasjon etter 4 timer. Utransfekterte og mock transfekterte celler fungerte som kontroller. Protein knockdown ble bekreftet ved immunblotting (fig S3).
For småcellet lungekreft (SCLC) cellelinjer, ble cellene sådd ut ved hjelp av Opti-MEM media i 6-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
5 celler per brønn (tre gjentak per tilstand). Cellene ble transfektert med 100 nM ikke-måls kontroll siRNA eller EPHB4 målretting siRNA (Santa Cruz) med Oligofectamine transfeksjon reagens i henhold til sin standard protokoll. Etter inkubering over natten, ble cellene samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i fullstendig medium. Mock-transfektert og kontroll siRNA-transfekterte celler fungerte som kontroller. Protein knockdown ble bekreftet av immunoblotting.
Expression of EPHB4 konstruksjoner i cellelinjer
En villtype EPHB4 cDNA-klon i pCMV6-XL6 vektor (Origene, Rockville MD) ble brukt som en pattedyr ekspresjonsvektor. For transient transfeksjon ble cellene sådd ut i antibiotika-fritt medium i enten 96-brønners plater i en tetthet på 2,0 x 10
4 celler per brønn (for cellelevedyktighetsanalyser, åtte replikater per eksperiment) eller 10 cm skåler ved en tetthet på 3,0 x 10
6-celler per plate (for hel-celle-lysat samling) og fikk vokse til tilnærmet 50-75% konfluens (for å tillate eksponensiell vekst i løpet av de følgende 72 timer). Cellene ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Life Technologies) i henhold til sin standard protokoll. Kompleksene ble fjernet etter 4-6 timer og erstattet med frisk antibiotika-fritt medium etter vasking med PBS. Utransfekterte og mock-transfektert (bare transfeksjon reagenvolumer) celler fungerte som kontroller. Protein uttrykket ble bekreftet av immunoblotting (figur S4)
etablering av stabile EphB4-uttrykke cellelinjer
Wild-type helaftens EPHB4 cDNA (GenBank tiltredelse antall NM_004444; OriGene, Rockville MD). ble klonet inn i pcDNA3.1 med en C-terminal Myc tag i rammen. Denne vektoren og styre pcDNA3.1 tom vektor ble individuelt transfektert inn i H661-celler ved bruk av Biot (Bioland, Paramount CA) ifølge produsentens protokoll. Etter transfeksjon, ble kulturmediet skiftet til den endelige vekstmedium (RPMI1640 supplementert med 10% FBS) inneholdende 300 ug /mL G418. En uke senere ble overlevende celler trypsinert og sådd ut på 96-brønners plater med graderte fortynninger. Konsentrasjonen av G418 i kulturmediet ble redusert til 200 pg /ml fra dette punktet. Enkeltkolonier fremkom to uker senere og ble screenet ved immunoblotting ved bruk av et anti-myc antistoff (klon 9E10, ATCC). Kolonier med eksogene EphB4-Myc uttrykket ble så utvidet.
Celleviabilitet Analyser
For NSCLC cellelinjer, etter transfeksjon av siRNA eller plasmider inn i cellene eller behandling av celler med sEphB4-HSA i 96- brønners plater som beskrevet ovenfor, ble cellene får vokse inntil det ønskede tidspunkt, ved hvilket tidspunkt mediet ble fjernet, cellene ble vasket en gang med PBS, og 100 ul friskt vekstmedium ble tilsatt til hver brønn. Etter tilsetning av 5 ul av en 0,028% resazurin-natriumsalt-løsning (vekt /volum; Sigma), ble platene inkubert ved 37 ° C beskyttet mot lys i 2-5 timer, og fluorescensen ble målt ved bruk av en fluorescens plateleser (530 /590nm avleses eksitasjon /emisjon). For Efrin-B2 /Fc stimuleringsanalyser, 5 x 10
4 celler /brønn ble sådd ut i 24-brønners plater, sultet over natten, og stimulert med 1 ug /ml Efrin-B2 /Fc, 0, 24, 48 eller 72 timer. Cellene ble vasket to ganger med 1 x PBS, farget med trypanblått-oppløsning (0,4%; Sigma)., Og manuelt telles ved lysmikroskopi
For SCLC-cellelinjer, ble cellene sådd ut i triplikat ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn og ble behandlet med 0,5 ug /ml av Efrin-B2 /Fc eller de angitte konsentrasjoner av AZ12489875-002. For siRNA-transfekterte celler, ble cellene høstet 24 timer etter transfeksjon, resuspendert i komplett medium, platet i triplikat ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn, og den forblir ubehandlet eller behandlet med 200 nm av SN-38 i 72 timer ved 37 ° C. For Efrin-B2 /Fc stimuleringsanalyser, 5 x 10
4 celler /brønn ble sådd ut i 24-brønners plater, sultet over natten, og stimulert med 0,5 ug /ml Efrin-B2 /Fc i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved tilsetning av 10 ul 5 ng /ml MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma) i de siste 2-4 timer av kulturen. Uløselige formazanfremstilling salter ble oppløst ved tilsetning av 50 ul av en surgjort isopropanol oppløsning. Absorbansen ble avlest ved 570 nm innen 15 minutter etter at reaksjonen er stoppet ved hjelp av en absorbans plateleser.
Topoisomerase I aktivitetsanalyse
H446 og H526 celler ble forlatt unstimulated eller stimulert i 15 minutter med 50 ng /ml HGF eller Efrin-B2 /Fc, deretter vasket to ganger med iskald PBS. Nukleære ekstrakter ble fremstilt som tidligere beskrevet [31]. I korthet ble cellene oppsamlet ved sentrifugering og vasket en gang med iskald TEMP (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 4 mM MgCl
2, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)). Celler ble deretter suspendert i 1 ml kald TEMP i 10 minutter og deretter sentrifugert ved 1500 x
g
i 10 minutter. Nukleære pellet ble resuspendert i 20 ul TEP (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF) pluss 20 pl 1 M NaCl, plassert på is i minst 30 m, og deretter sentrifugert ved 15.000 x
g
i 15 minutter.
Top1
enzymatisk aktivitet i kjerneekstrakter ble målt ved hjelp av en DNA avslapping assay (TopoGen, Port Orange FL) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble 100 ng av supercoil plasmid-DNA i en 20 pl reaksjonsblanding (10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,1 mM spermidin, 5% glycerol) ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter med pene og serielt fortynnet (1:4) nukleære ekstrakter, renset rekombinant human
Top1 product: (positiv kontroll), eller assayfortynning (negativ kontroll). Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av 5 ul 5 x lastebuffer (5% SDS, 0,3% bromfenolblått). Prøvene ble løst på en 1% agarosegel og avbildes som ovenfor.
Soft Agar Colony Forming analyse
For å evaluere karsinogent potensial av de villtype EphB4 celler, 1 × 10
4 levedyktige celler pr brønn ble sådd ut i bløt agar på 6-brønners plater. I korthet, ble basislaget laget ved å blande like volumer av steril 1,2% agar (avkjølt til 40 ° C) og 2 x RPMI1640 medium for å oppnå en sluttløsning på 0,6% agar i en x RPMI1640 medium. For det øverste laget, ble agaren fortynnet til 0,8% i destillert vann, avkjølt til 40 ° C, og deretter blandet i like proporsjoner med 2 x RPMI1640 medium. Cellene ble umiddelbart tilsatt til blandingen for å gi en sluttløsning på 0,4% agar i en x RPMI1640 medium. Cellene vokste i 4 uker ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2, og da levedyktige kolonier ble fotografert og telles ved hjelp ImageJ programvare.
sårtilheling Analyser
H661 tom-vektor og med villtype EPHB4 stabile kloner celler ble sådd i 6-brønns plater og dyrket til 100% konfluens og deretter behandlet med 1 pg /ml Efrin-B2 /Fc. En rett skrape ble laget på tvers av cellelaget ved hjelp av en 1-ml pipettespissen. Cellene ble deretter forsiktig vasket med 1 x PBS for å fjerne cellerester, og mediet ble byttet ut. Bildene ble tatt av Sårområdet på 0, 4, 7, 23 og 28 timer og analysert ved TScratch programvare (CSELab, ETH Zürich, Sveits).
In vivo
tumorvekst
2 × 10
6 A549 eller H1993 eller 4 × 10
6 H446 celler ble injisert i flankene av 10-12 uker gamle mannlige Balb /C atymiske mus (Harlan Laboratories, Placentia CA ) og tillates å etablere primærtumorer omtrent 75 mm
3 i volum. Flanke injeksjoner ble valgt over en orthotopic modell på grunn av deres veletablerte bruk i lungekreft studier samt deres enkle non-invasive tumormålinger [32]. Tumorvekst ble målt tre ganger ukentlig, og volumet ble beregnet ved bruk av 0,52 × a × b
2 (avledet fra volumberegning av en celleklump, V = 4/3 · π · en
2 · b, der a er radius av mindre aksen og b er radiusen til den store akse, Ref. 33), der a er den lengste dimensjon, og b er den korteste dimensjon av følbar masse. Seks dager etter implantering ble musene med A549-xenografter tilfeldig fordelt i fire grupper (seks mus pr gruppe), og behandling ble igangsatt: PBS (kontroll), paclitaxel (20 mg /kg ukentlig), sEphB4-HSA (20 mg /kg tre ganger per uke), eller paclitaxel pluss sEphB4-HSA. Mus med H1993 eller H446 xenotransplantater ble delt i to grupper (seks mus pr gruppe), og behandling ble igangsatt: PBS (kontroll) eller sEphB4-HSA (50 mg /kg tre ganger per uke). Alle behandlinger ble administrert intraperitonealt. Dyrene ble til slutt avlivet og svulstene ble høstet ved slutten av forsøket.
immunfluorescens
Vev høstet fra mus A549 xenografter var snap frosset og innebygd i oktober sammensatte. 5-10 mikrometer seksjoner ble fiksert i 4% paraformaldehyde, vasket i PBS, og inkubert i grunnskolen anti-Ki-67 (BD Biosciences), anti-CD31 (BD Biosciences), anti-fosforylert S6 (S235 /S236, Cell Signaling, Danvers MA), anti-fosforylert Akt [S473 (Ref 34).; Cell Signa], eller anti-fosforylert Src (Y416, Cell Signaling) antistoff over natten ved 4 ° C. For immunfluorescens ble snittene vasket i PBS og inkubert med Alexa Fluor-konjugert sekundært antistoff (Life Technologies). En TdT-mediert dUTP nick-ende merking (TUNEL) assay (Promega, Madison WI) ble også utført for å evaluere apoptose. DAPI ble brukt som en kjernefysisk counterstain og fungerte som en kontroll mot som cellulære markør intensiteter ble normalisert. Bilder ble tatt med et Nikon Eclipse 80i fluorescens mikroskop og Meta Morph bildeserien system. For immunhistokjemi, ble delene først inkubert i biotin-konjugert sekundært antistoff, etterfulgt av HRP-konjugert avidin, så 3,3′-diaminobenzidin reagent (Vector Labs, Burlingame CA). Hematoxylin ble anvendt som en kjernefysisk counterstain. Bilder ble tatt med et Olympus BX51 mikroskop og bilde-Pro Plus 6.0 system.
statistikker
For immunhistokjemisk farging analyser, log
10 ACIS verdier for tumor mot matchet normale lungevev var sammenlignet ved bruk av en to-halet paret t-test for pasientene, kullet, så vel som innenfor den enkelte subtyper. Hver ACIS intensitet representerer middelverdien av inntil tre replikater for en gitt pasient bestemt ved anvendelse av separate vev kjerner innenfor den samme tumor microarray. Graden av likhet mellom ACIS og manuell patologisk scoring ble bestemt ved bruk av en to-tailed Spearman korrelasjon. Overlevelsesdata er representert ved hjelp av Kaplan-Meier-kurver basert på immunhistokjemiske intensitet scoring (høy versus lav ved hjelp av en score cutoff på 500 på ACIS, som representerer median total intensitet) og på rase betegnelse.
For celleviabilitet analyser, replikere datapunkter ble gjennomsnitt og sammenlignet enten til tids matchet mock-transfekterte celler (for siRNA-transfekterte celler) eller til tids matchet kontrollceller (for sEphB4-HSA-behandlede celler). Å sammenligne behandlinger parvis, ble en student t-test benyttet. Andre sammenligninger av to grupper ble gjort ved bruk av en student t-test, og de av tre eller flere grupper ble gjort ved hjelp av en enveis ANOVA. For å vurdere variasjon mellom et sett av behandlingsforhold med flere tidspunkter, ble to-veis ANOVA brukes. Dersom ikke annet er angitt, feilfelt som benyttes ved visning av cellenes levedyktighet data representerer standardfeil av gjennomsnittet normalisert til prosent forskjell sammenlignet med kontrollverdier. For
in vivo
vekstanalyser, ble statistisk signifikans av forskjeller i tumorvekst på hvert tidspunkt for hver tilstand bestemmes ved hjelp av enten en student t-test for uparede prøver eller enveis ANOVA for prøver blant fire behandlingsgruppene. For å bestemme den statistiske betydningen av en endring i gjennomsnittlig tumorvolum for en individuell behandling arm, var en student t-test benyttet. Alle statistiske beregninger ble utført ved hjelp av Prism programvare (GraphPad, La Jolla CA) eller SAS statistikkpakke (Cary NC).
Resultater
EphB4 er overuttrykt og har økt Gene Kopier numre i Lung Cancer
i parvise analyser av 89 matchet normale og tumorprøver fra lungekreftpasienter, fant vi EphB4 å være betydelig overuttrykt sammenlignet med sammenkoblede normalt vev i adenokarsinom (n = 41; 4,3 ganger bety forskjellen), stor celle karsinom (n = 15; 2,9 ganger bety forskjellen), småcellet karsinom (n = 13; 2,4 ganger bety forskjellen), og plateepitelkarsinom (n = 10, 2,7 ganger gjennomsnittlig forskjell) subtyper. Total, tumorer ble funnet å uttrykke EphB4 3,2 ganger sterkere enn koblede normale vev (figur 1). EphB4 i tilstøtende normalt lungevev er vist i figur S5.
A
. Representative immunhistokjemi bilder av EphB4 uttrykk på tvers av flere lungekreft subtyper. Patologisk scoring er angitt ovenfor kolonner; lengst til høyre er en med høyere makt visning av tilsvarende 3+ bilder viser subcellulære fargemønstre. Merk uttales membran flekker i stor celle karsinom.
B
. EphB4 uttrykk mønstre i ulike lungekreft undergrupper med rase og scene distribusjon. Enkelte punkter representerer gjennomsnitts ACIS score i en enkelt pasient for tilsvarende normale og tumorvev. vises det totale antall pasienter i hver analyse under grafene. Kun pasienter med paret tumor og normalt vev ble inkludert i analysene. Vannrette streker representerer gjennomsnitts ACIS score på tvers av alle pasientene i et gitt sett. Race og klinisk stadium distribusjoner for hver subtype og det samlede sett vises under hver graf.
Vi har også bestemt NSCLC cellelinje uttrykk for EphB4 protein via immunoblot analyse (figur 2A). Seks til åtte NSCLC cellelinjer (A549, H358, H522, H1703, H1993, SW1573) uttrykt EphB4 i en vesentlig grad, en (H661) viste lav EphB4 uttrykk, og en (H2170) manglet EphB4 uttrykk. Den EphB4 ligand Efrin-B2 ble uttrykt på en konsekvent lavt nivå i alle cellelinjene som ble testet. Ekspresjon av EphB4 i et panel på åtte SCLC-cellelinjer ble undersøkt ved immunblotting (figur 2B) og flow-cytometri (figur 2C). Fire SCLC cellelinjer (H82, H249, H446, H2171) uttrykt EphB4 av immunoblot analyse, mens H69 og H526 celler ikke uttrykker EphB4. Surface uttrykk for EphB4 av flowcytometrisk analyse i stor grad validert immunoavtrykket funnene.
A-B
. EphB4 protein uttrykk i paneler av NSCLC og SCLC cellelinjer ved immunoblotting. Efrin-B2 uttrykk ble også vurdert i NSCLC cellelinjer. BEAS-2B er en immortalisert, ikke-kreft lunge cellelinje som brukes her som en kontroll; prostatakreft-cellelinjen PC3 ble inkludert som en positiv kontroll. B-aktin og GAPDH ble brukt som laste kontroller.
C
. EphB4 ekspresjon i et panel av SCLC-cellelinjer vurderes ved strømningscytometri ved å bruke EphB4-spesifikt antistoff (rød). Normal mus IgG ble anvendt som negativ kontroll (blå). EphB4 positivitet uttrykt som prosent av totale celler er vist på høyre side av hvert panel.
For å finne ut EPHB4 genkopitallet i vevsprøver, gjennomførte vi qPCR analyse og funnet ut at flere vev demonstrert økt EPHB4 genet kopiantall. Seks, ni og 23 prosent av adenokarsinom, småcellet karsinom, og plateepitelkarsinom vev, henholdsvis, ble funnet å inneholde mer enn tre EPHB4 genkopier, med 14% av plateepitelkarsinom vev som har mer enn 10 eksemplarer (figur S6) . Ingen cellelinjene som ble testet ble funnet å demonstrere genkopitallet gevinster.
EphB4 Expression og forutsigelse i Lung Cancer
En oppsummering av kliniske kjennetegn ved pasient vev brukt i denne studien er vist i tabell S2. Pasientens overlevelse var sterkt positivt korrelert med tumor ekspresjon av EphB4, som de med høy EphB4 ekspresjon ha en median overlevelse tredelt lengre enn de med lav uttrykket (51 måneder versus 17 måneder, p = 0,021; Figur 3A). Kaukasiske pasienter ble også funnet å uttrykke EphB4 betydelig sterkere enn afrikansk-amerikanske pasienter (p = 0,019; data ikke vist); Men dette gjorde ikke slå ut i en forskjell i overlevelse stratifisert etter rase (p = 0,92, figur 3B). Det var ingen signifikant sammenheng mellom EphB4 uttrykk og andre pasientkarakteristika, som kjønn, røykestatus og alder ved diagnose, enten i den samlede pasientmateriale eller når stratifisert etter lungekreft subtype.
Ordinataksen i hver grafen representerer den fraksjon av levende pasienter.
A
. Survival stratifisert etter EphB4 uttrykk. ACIS score over og under 500 ble valgt for lagdeling basert på medianen poengsum av den samlede kohort. Piler representerer median overlevelse (50% levende pasienter) i måneder.
B
. Survival stratifisert etter løpet.
EphB4 Modulation påvirker cellevekst
in vitro
lungekreft celler ble transient transfektert med EPHB4 styrt siRNA eller behandlet med sEphB4-HSA i kultur for å bestemme om celle-levedyktighet ville bli påvirket. sEphB4-HSA er et monomert protein-fragment som omfatter det ekstracellulære domenet av EphB4 og konjugert til humant serumalbumin som kan binde Efrin-B2 ligand og derfor motvirker EphB4 reseptoraktivering gjennom forstyrrelse av samspillet mellom EphB4 reseptor og Efrin-B2-ligand [35], [36]. I A549-cellelinjen, ble levedyktighet etter eksponering for sEphB4-HSA redusert med ca 17% med lavest konsentrasjon og med 40% med de høyeste konsentrasjonene av sEphB4-HSA etter 96 timer (Figur 4A). I H522-cellelinjen, ble en lignende effekt ses i den høyeste dose etter 96 timer (~58% reduksjon), mens de nedre to konsentrasjoner innledningsvis redusert levedyktighet sammenlignet med kontrollceller, men hadde en redusert effekt på senere tidspunkter (figur 4A) .
A
. A549 og H522-celler ble behandlet med oppløselig EphB4 ved konsentrasjonene angitt, og dets virkning på cellelevedyktighet ble målt i løpet av de tidspunkter som vises ved hjelp av resazurin fluorescens.
B
.
C
.
B
.
C
.
D
.
B
.
C
.
B
.
