Abstract
Identifisere midler som hemmer STAT-3, en cytosoliske transkripsjonsfaktor som er involvert i aktivering av forskjellige gener involvert i tumorprogresjon er en lovende strategi for kreft chemoprevention. I den foreliggende studien undersøkte vi effekten av kost astaxantin på JAK-2 /STAT-3 signalering i 7,12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) -indusert hamsterkinnhulen (HBP) karsinogenese modell ved å undersøke mRNA og protein uttrykk for JAK /STAT-3 og dets mål gener. Kvantitativ RT-PCR, immunoblotting og immunhistokjemiske analyser viser at astaxanthin tilskudd hemmer viktige hendelser i JAK /STAT signale spesielt STAT-3 fosforylering og påfølgende atomtrans av STAT-3. Videre astaxanthin downregulated ekspresjonen av STAT-3 målgener som er involvert i cellevekst, invasjon og angiogenese, og redusert mikrovaskulær tetthet, for derved å hindre tumorprogresjon. Molekylær docking analyse bekreftet hemmende effekter av astaxanthin på STAT signalering og angiogenese. Cellekultur eksperimenter med endotel-cellelinjen ECV304 begrunnet rollen av astaxanthin i undertrykke angiogenese. Tatt sammen, våre data gir betydelig bevis for at kosten astaxanthin hindrer utvikling og progresjon av HBP karsinomer gjennom inhibering av JAK-2 /STAT-3 signalering og nedstrømshendelser. Dermed astaxanthin som fungerer som en potent hemmer av svulst utvikling og progresjon ved å målrette JAK /STAT signale kan være en ideell kandidat for kreft chemoprevention
Citation. Kowshik J, Baba AB, Giri H, Deepak Reddy G, Dixit M, Nagini S (2014) Astaxanthin Hemmer JAK /STAT-3 Signa å oppheve Cell Proliferation, Invasion og Angiogenese i en Hamster Modell av Oral Cancer. PLoS ONE 9 (10): e109114. doi: 10,1371 /journal.pone.0109114
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 17 juni 2014; Godkjent: 08.09.2014; Publisert: 08.10.2014
Copyright: © 2014 Kowshik et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Institutt for bioteknologi, New Delhi, India under syvende FP av den indo-EU Joint Samarbeidsprosjektet på «FUNCFOOD». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) protein er et latent cytoplasmisk transkripsjonsfaktor som overfører signaler fra celleoverflaten til kjernen når den aktiveres av cytokiner og vekstfaktorer [1]. I særdeleshet, interleukin-6 (IL-6) eller epidermal vekstfaktor (EGF) stimulere fosforylering av STAT3 proteinet ved Janus kinase og aktivert STAT3 danner en homodimer som translocates til kjernen hvor den regulerer ekspresjon av gener avgjørende for normale cellulære prosesser slik som celle utvikling, differensiering, proliferasjon, overlevelse, angiogenese, og immunfunksjon [2] -. [6]
Aberrant aktivering av JAK /STAT3 signalering er blitt dokumentert i et bredt spekter av humane tumorer, inkludert hematopoetisk ondartede sykdommer og faste tumorer så som hode og nakke, bryst og prostata-kreft [7], [8]. Konstitutiv STAT3 aktivering bidrar til spredning og onkogenese ved å modulere ekspresjon av en rekke gener som kreves for tumorcelleoverlevelse, proliferasjon og angiogenese, samt invasjon og metastase og som vanligvis tyder på dårlig prognose [9] – [11]. Dermed spiller JAK /STAT3 signale en sentral rolle i tumordannelse og anses som et viktig terapeutisk mål for romanen narkotika utvikling.
Identifisering av agenter som er rettet mot STAT3 molekylet er sannsynlig å være av betydning i kreft chemoprevention. Flere kosten antioksidanter er kjent for å blokkere svulst utvikling ved å målrette den STAT3 signaleringsnett [12] – [15]. Astaxanthin, et ikke-provitamin A karotenoid hovedsakelig i mikroalger, sopp, planter, hav mat og noen fugler som flamingoer og vaktel er en potent antioksidant [16]. Astaxanthin ble funnet å utvise den høyeste antioksidant aktivitet blant de karotenoider og er mye brukt i forebygging og behandling av forskjellige sykdommer [17]. AXT har også vist seg å stille ut anti-inflammatorisk og kreft egenskaper [18], [19].
Nylig har vi vist at kosttilskudd av AXT induserer iboende apoptose ved å hemme PI3 /Akt, MAPK, NF-kB og Wnt /β-catenin signale kretser i 7,12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) -indusert hamster kinnhulen (HBP) kreft modell [20]. Disse funnene fristet oss til hypoteser som AXT som induserer apoptose kan blokkere den motsatte prosessen med celledeling og dermed hindre den sekvensielle opphopning av mutasjoner som til slutt fører til tumorinvasjon og angiogenese. Videre AXT-indusert inaktivering av transkripsjonsfaktorer NF-kB og β-catenin, sentrale knutepunkter i onkogene signalisering kan også påvirke JAK /STAT3 veien. I denne studien viser vi at kosten AXT hemmer tumorprogresjon basert på opphør av JAK /STAT3 sti og dens nedstrøms mål cyclin D1, MMP-2, -9, og VEGF i HBP kreft modell. Videre AXT redusert mikrovaskulær tetthet, som spiller en viktig rolle i tumorutvikling og progresjon. Cellekultur eksperimenter med endotelceller linjen ECV304 ble også utført for å underbygge den rollen astaxanthin i å undertrykke hypoksi-indusert angiogenese.
Materialer og metoder
Kjemi
Akrylamid, storfe serum-albumin (BSA), bromfenolblått, 7,12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA), hydroksyurea, 2-merkaptoetanol, natriumdodecylsulfat (SDS) N, N, N «, N» – tetrametylen-diamin (TEMED) og Trizol ble kjøpt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. Astaxanthin ble anskaffet fra Bio-Real, Sverige. DMEM-F12 medium, antibiotikaløsning bestående av penicillin og streptomycin og Alamar blå var fra HiMedia Labs, Mumbai, India. Fetal bovin serum av søramerikansk opprinnelse var fra GIBCO, Invitrogen, NY, USA. Strøm SYBR Grønn PCR Master Mix ble innhentet fra Applied Biosystems, California, USA. Antistoffer for IL-6, GAPDH, cyclin D1, PCNA, p21, MMP-2, MMP-9, TIMP-2, RECK, VEGF, VEGFR2, HIF1α, ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, USA. PJAK-2
tyr1007 /1008, JAK-2, pSTAT-3
tyr705, STAT-3 og histone (H2b) antistoffer og BrdU, STAT-3
tyr705, total cyclin D1 og pVEGFR2
tyr1175 ELISA kits var fra Cell Signaling Technology, USA. CD-34 antistoffet ble kjøpt fra Novocastra, Tyskland. Matrigel var fra BD Biosciences, USA. Alle andre reagenser som ble brukt var av analytisk kvalitet.
Dyr og etikk uttalelse
Åtte til ti uker gamle mannlige syriske hamstere som veier mellom 100-110 g ble brukt i denne studien. Dyrene ble hentet fra Central Animal House, Annamalai University, India. Dyrene ble huset fire til et bur og forsynt med standard pelletdiett og vann ad libitum. Dyrehelse ble overvåket daglig i løpet av studien. Protokollene for dyreforsøk ble godkjent av etikkomiteen Institutional Animal, Annamalai University og gjennomført i henhold til retningslinjer fastsatt av komiteen for hensikten med kontroll og tilsyn på Eksperimenter på dyr (CPCSEA).
Behandling tidsplan
dyrene ble randomisert til eksperimentelle og kontrollgrupper og delt inn i 4 grupper på 5 dyr hver. I gruppe 1, ble de riktige kinnposer av hamstere malt med 0,5% DMBA i flytende parafin tre ganger i uken i 14 uker [21]. Gruppe 2 dyr fikk i tillegg til DMBA, en basal diett inneholdende 15 mg /kg kroppsvekt av astaxanthin [20], [22]. Gruppe 3 dyr fikk astaxanthin (15 mg /kg kroppsvekt) alene i 14 uker. Gruppe 4 dyr fikk basal diett alene og fungerte som en ubehandlet kontroll. Forsøket ble avsluttet etter 14 uker, og alle dyr ble avlivet ved cervikal dislokasjon etter faste over natten. Kinnhulen vev ble umiddelbart oppdelt og behandlet for distribusjon til hvert eksperiment.
Cellekultur
ECV 304-cellelinjen ble anvendt og dyrket i DMEM basal medium med 10% føtalt bovint serum uten antibiotika. ECV304 er en endotelial cellelinje avledet fra humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) gjennom spontan transformasjon [23]. Sammenlignet med primær HUVEC kulturer, bruk av ECV304 celler har en praktisk fordel som disse cellene viser forbedret og reproduserbar kapasitet for in vitro angiogenese er dermed et ideelt valg for cellekultur basert angiogenese analyser [24]. Sammenflytende kulturer av ECV304-celler ble dyrket og opprettholdt i CO
2 inkubator ved 37 ° C. For Matrigel-analysen ble cellene opprettholdt i DMEM basal medium med 4% føtalt bovint serum. For hypoksisk tilstand, ble cellene inkubert i hypoksi kammer med 1% O
2.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time RT-PCR
Total RNA fra kinnhulen vev ble ekstrahert ved hjelp av Trizol reagens som tidligere beskrevet [25]. RNA-konsentrasjonen ble bestemt fra den optiske tetthet ved en bølgelengde på 260 nm (ved hjelp av en OD260 enhet ekvivalent med 40 ug /ml RNA). 5 ug av isolert total RNA ble revers-transkribert til cDNA i en reaksjonsblanding inneholdende 4 ul 5 x reaksjonsbuffer, 2 pl dNTP-blanding (10 mM), 20 enheter RNase inhibitor, 200 enheter av avian-myeloblastosevirus (AMV ) revers transkriptase og 0,5 pg oligo (dT) primer (Promega, WI, USA) i et totalvolum på 20 ul. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 42 ° C i 60 minutter og reaksjonen avsluttet ved oppvarming ved 70 ° C i 10 min. CDNA ble lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av strøm SYBR grønn konsentrat-blanding i henhold til produsentens instruksjoner under anvendelse av en StepOne Plus termo (Applied Biosystems). Til 1 x PCR masterblanding, ble 2,5 ul av hver cDNA tilsatt i en 20 ul sluttvolum. PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 5 minutter, 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 sekunder ved 52 til 60 ° C (basert på målet), og 60 s ved 72 ° C. Relativ kvantitativ gangers endring i forhold til kontrollen ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct-metoden, hvor Ct er syklusen nummeret som fluorescens første overskrider terskelverdien. De Ct-verdier fra hver prøve ble erholdt ved å subtrahere verdiene for GAPDH Ct fra målgenet Ct verdi. Spesifisiteten til resulterende PCR-produkter ble bekreftet ved smeltekurver.
Western blotting
Proteiner ble ekstrahert fra vev prøve ved anvendelse av lyseringsbuffer inneholdende 62,5 mM Tris (pH 6,8), 10% SDS, 5% 2-merkaptoetanol, 10% glycerol og bromfenolblått. Kjerne- og cytoplasmatiske fraksjoner ble separert som beskrevet av Legrand-Poels et al. [26]. Lik mengde av proteinekstrakter ble applisert på SDS-PAGE og de oppløste proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Blottene ble deretter inkubert i 2 timer i 1 x PBS inneholdende 5% ikke-fettholdig tørrmelk. Membranene ble deretter undersøkt med primære og sekundære antistoffer som i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinene ble visualisert ved hjelp av forbedrede chemiluminescence gjenkjenning reagenser (Sigma). Densitometry ble utført på IISP flat seng skanner og kvantifisert med Total Lab 1,11 programvare.
ELISA
Nivåene av pSTAT
tyr705, total cyclin D1 og pVEGFR2
tyr1175 ble bestemt ved hjelp av sandwich-ELISA kit (Cell Signaling Technology, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunohistochemistry
Parafin vevssnitt ble deparaffinised, rehydrert og utsatt for antigen gjenfinning og endogen peroksidase blokkering. Deretter ble seksjonene inkubert med pSTAT-3 kanin monoklonalt, PCNA, MMP-2 og VEGF kanin polyklonale antistoffer ved romtemperatur i 3 timer. Objektglassene ble vasket med TBS og deretter inkubert med biotin-merket sekundært antistoff, etterfulgt av streptavidin-biotin-peroksidase (Dako, Carprinteria, CA, USA) i 30 minutter hver ved romtemperatur. Immunpresipitatet ble visualisert ved behandling med 3,3′-diaminobenzidin og kontra med hematoksylin. De vev ble så fotografert ved hjelp av en invertert fluorescerende mikroskop (Leica Micro Vertrieb GmbH, Wetzler, Tyskland) festet med digitalt kamera DFC295.
Mikrovaskulær tetthet (MVD)
Mikrovaskulær tetthet ble vurdert ved immunhistokjemisk farging med anti-CD34-antistoff. Områdene av høyeste neovascularization ble plassert, og bildene er fanget i minst fem ulike felt. Microvessels ble talt av to uavhengige etterforskere og dataene representert som antall skip /synsfelt.
Molecular docking
Molecular docking ble gjort ved hjelp av Schrödinger suite 2013. Astaxanthin ble hentet fra pubchem (www .ncbi.nlm.nih.gov /pccompound) og proteiner STAT-3 og VEGF ble hentet fra protein databank med PDB ID: 3CWG og 3V2A hhv. Receptor grid generasjon og ligand docking ble utført ved å bruke Glide Xp docking-algoritmen.
Alamar blå analyse
Celleviabilitet ble målt ved Alamar blå analyse [27]. I korthet ble Alamar blue (Resazurin natriumsalt fra Himedia) oppløst i fosfatbufret saltoppløsning pH 7,4 for å lage et lager av 5 mg /ml og en endelig arbeidskonsentrasjon på 0,1 mg /ml i cellekulturmedium. Resazurin er et redoks-indikator, som måler den reduserende miljøet i cellen ved å redusere til et sterkt fluorescerende resorufin. Astaxanthin ved forskjellige konsentrasjoner (5, 10, 20, 50, 100, 200 og 400 uM) ble tilsatt til cellene, og etter 24 timer ble Alamar blue fargestoff tilsatt, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Fargeendringen ble overvåket kolorimetrisk ved 595 nm og 570 nm for å evaluere oksidert versus redusert form av henholdsvis reagenset ved hjelp av multi-mode plateleser.
BrdU analysen
Celleproliferering ble analysert ved å måle DNA-syntese med bromdeoksyuridin (BrdU) enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) kit (Cell Signaling Technology, USA), ifølge produsentens instruksjoner. I korthet, en x 10
4-celler ble sådd på en 96-brønners mikroplate og dyrket med eller uten astaxanthin (50 uM) i 24 timer. Cellene ble deretter merket med BrdU i 6 timer. Etter fiksering ble cellene inkubert med 100 ul anti-BrdU-antistoff i 60 min. Etter vasking ble 100 pl sekundært antistoff tilsatt og inkubert i 30 min, deretter 100 ul substrat (tetrametylbenzidin) ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert ved romtemperatur i 30 min. Absorbansen ved 450 nm ble målt med en ELISA-leser.
Migration assay
Sammenflytende monolag av ECV 304 celler i 24 brønners plater ble risset med en 200 ul pipette tupp og inkubert i normoksiske og hypoksiske tilstand med og uten 50 uM astaxanthin. 5 mM hydroksyurea ble også tilsatt for å inhibere celleproliferasjon. Cellene ble fotografert under et mikroskop ved en forstørrelse på 4x ved 0 og 24 timer [28].
Matrigel rør dannelsesbestemmelsen
Forhåndskjølt 96-brønners plater ble belagt med 80 ul (matrigel BD) og inkubert ved 37 ° C i en halv time. Samme antall celler (20 000 /brønn) ble tilsatt i hver brønn med og uten hypoksisk tilstand og i nærvær og fravær av astaxantin (50 uM) og inkubert i CO
2 inkubator ved 37 ° C i 14 timer. Bilder ble tatt til fange i minimum fem ulike felt og data representeres slutt som antall rør /synsfelt [29].
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en parametrisk Mann-Whitney test (Stats Direct, Storbritannia) for
in vivo Hotell og Tukey posthoc test for
in vitro
eksperimenter. En sannsynlighet verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Tumor forekomst
tumortilfeller er rapportert i en tidligere studie [20]. Ved slutten av forsøksperioden svulsten forekomsten var 100% med en gjennomsnittlig tumorbyrde 82,25 mm
3 i hamstere malt med DMBA (gruppe 1). Kosttilskudd av astaxanthin (15 mg /kg kroppsvekt) til DMBA malte hamstere fremkalte ikke noen brutto svulster i kinnhulen og histologisk undersøkelse avslørte bare mild hyperplasi. I hamstere matet astaxanthin alene og i kontrollgruppene, Epitel var normal, intakt, og kontinuerlig.
Astaxanthin hemmer JAK /STAT signalering ved å holde fosforylering av STAT-3
Som STAT 3 er konstitutivt aktivert i et bredt utvalg av ondartede sykdommer, vi først analysert mRNA-ekspresjon av JAK-2 og STAT-3 ved kvantitativ RT-PCR-analyse. Våre resultater viser at kosttilskudd av astaxanthin betydelig redusert mRNA uttrykk av viktige molekyler involvert i JAK /STAT signalering i forhold til DMBA malte dyr (Figur 1a). Ingen signifikante forskjeller ble observert hos dyr behandlet med astaxanthin alene sammenlignet med kontrollen. Ytterligere for å utforske den mekanismen som regulerer astaxanthin JAK /STAT-signalering, ved siden fastslått at det er protein ekspresjon av IL-6, JAK-2, PJAK-2, STAT-3 og pSTAT-3 ved western blotting. Vi har funnet at topisk påføring av DMBA betydelig økt uttrykk for disse genene sammenlignet med kontrollen. Samtidig diett administrering av astaxanthin inhiberte JAK /STAT-signalering ved å redusere nivåene av IL-6, JAK /STAT fosforylerte former og etterfølgende translokasjon til kjernen (figur 1B n = 3).. A. transkripsjon Ekspresjonsnivået av JAK-2 og STAT-3 i forskjellige eksperimentelle grupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. B. representant immunoblot analyse. Proteinprøver (100 mikrogram /kjørefelt) vedtok på SDS-PAGE ble undersøkt med tilsvarende antistoffer. GAPDH ble brukt som lasting kontroll for cytosol og hele vevshomogenater. Histone H2B ble brukt som lastekontroll for kjerneproteiner. Fosforylerte proteiner er normalisert ved sin ufosforylerte form. C. Densitometrisk analyse. Proteinet ekspresjon fra kontroll-lysater for tre bestemmelser ble betegnet som 100% i diagrammet. Hver søyle representerer protein uttrykk for tre bestemmelser
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. D. Nivåer av pSTAT
tyr705 (ELISA). E. Representative mikrofotografier av immunhistokjemisk farging av pSTAT-3 i kontroll- og forsøksdyr (20X).
Astaxanthin hindrer celledeling, invasjon og angiogenese via hemme JAK /STAT sti
Som STAT-3 aktivering regulerer transkripsjon av gener som er involvert i cellevekst, invasjon, og angiogenese, vi neste undersøkte effekten av astaxantin på markører for celleproliferasjon. Kosttilskudd av astaxanthin betydelig redusert mRNA og protein uttrykk for cyclin D1 og PCNA. Videre økte AXT atom p21 ekspresjon i forhold til den cytosoliske fraksjon. I tillegg vil redusert AXT supplementation total cyklin D1 nivå (ELISA) sammenlignet med DMBA gruppe (figur 2). Men ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert mellom hamstere matet astaxanthin alene og kontrollgruppen
(gjennomsnitt ± SD, n = 3).. A. transkripsjon ekspresjon nivå av p21, cyklin D1 og PCNA i forskjellige eksperimentelle grupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. B. representant immunoblot analyse. Proteinprøver (100 mikrogram /kjørefelt) vedtok på SDS-PAGE ble undersøkt med tilsvarende antistoffer. GAPDH ble brukt som lasting kontroll for cytosol og hele vevshomogenater. Histone H2B ble brukt som lastekontroll for kjerneproteiner. C. Densitometrisk analyse. Proteinet ekspresjon fra kontroll-lysater for tre bestemmelser ble betegnet som 100% i diagrammet. Hver søyle representerer protein uttrykk for tre bestemmelser
♣ p. 0,05 versus kontroll. p 0,05 versus DMBA. D. Nivåer av total cyclin D1 (ELISA). E. Representative mikrofotografier av immunhistokjemisk farging av PCNA i kontroll- og forsøksdyr (20X).
For å avgjøre om hemming av JAK /STAT sti av astaxanthin hindrer invasjon, vi neste analysert uttrykket av MMP-2 , MMP-9 og deres inhibitorer. Diettadministrasjonen av astaxanthin betraktelig modulerte mRNA og protein ekspresjon av disse molekylene i forhold til gruppe 1 dyr. For ytterligere å validere at astaxanthin regulerer matriksmetalloproteinaser, vi også undersøkt protein uttrykk av MMP-2 ved immunhistokjemisk analyse. Våre resultater viser at astaxanthin administrasjon markert redusert uttrykk av MMP-2 i forhold til gruppe 1 dyr. . På den annen side ble ingen signifikante forskjeller observert i dyr foret astaxanthin alene sammenlignet med kontroll (figur 3)
(gjennomsnitt ± SD; n = 3). A. transkripsjon ekspresjon nivå av MMP-2, MMP-9 og TIMP-2 i forskjellige eksperimentelle grupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. B C. Representative immunoblot og søylediagram som representerer protein ekspresjon av MMP-2, MMP-9, TIMP-2 og RECK for minst tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. D. Representative mikrofotografier av immunhistokjemisk farging av MMP-2 i kontroll og forsøksdyr (20X).
Som neovaskularisering spiller en stor rolle i tumorvekst, og er en av de store nedstrøms hendelser utløst av JAK /STAT vei, undersøkte vi effekten av astaxantin på angiogenese. Som vist i figur 4, kosttilskudd av astaxanthin betraktelig modulert ekspresjon av VEGF, VEGFR2 og redusert HIF-1α nukleær translokasjon sammenlignet med DMBA-malt dyr. Videre redusert AXT tilskudd nivået av pVEGFR2 (ELISA). Immunhistokjemisk farging også bekreftet redusert uttrykk av VEGF i hamstere matet astaxanthin i forhold til DMBA malte dyr. Ingen signifikante forskjeller ble observert hos dyr behandlet med astaxanthin alene sammenlignet med kontroll
(gjennomsnitt ± SD; n = 3).. A. transkripsjon Ekspresjonsnivået av HIF-1α, VEGF og VEGFR2 i forskjellige eksperimentelle grupper som bestemt ved kinetisk PCR. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. B. representant immunoblot analyse. Proteinprøver (100 mikrogram /kjørefelt) vedtok på SDS-PAGE ble undersøkt med tilsvarende antistoffer. GAPDH ble brukt som lasting kontroll for cytosol og hele vevshomogenater. Histone H2B ble brukt som lastekontroll for kjerneproteiner. C. Densitometrisk analyse. Proteinet ekspresjon fra kontroll-lysater for tre bestemmelser ble betegnet som 100% i diagrammet. Hver søyle representerer protein uttrykk for tre bestemmelser
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. D. Nivåer av pVEGFR2
tyr1175 (ELISA). E. Representative mikrofotografier av immunhistokjemisk farging av VEGF i kontroll og forsøksdyr (20X).
Som AXT redusert HIF-1α og VEGF uttrykk, sentrale aktører involvert i neovascularization, vi neste søkt å fastslå om inhibering av disse molekyler ved AXT har noen effekt på vaskulatur ved å måle mikrovaskulær tetthet. DMBA malt dyr viste høy vaskularitet med en midlere MVD på 185 sammenlignet med kontrolldyrene. Kosttilskudd av AXT betydelig redusert antall skip i forhold til DMBA malte dyr, indikerer antiangiogene potensialet av astaxanthin (figur 5).
A. Representative mikrofotografier av mikrovaskulær tetthet i kontroll og forsøksdyr (40X). B. Bar grafen representerer antall fartøy for minimum tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. * P 0,05 versus DMBA. C. Bar graf som representerer fartøyet lengde for minimum tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus kontroll. p. 0,05 versus DMBA
For ytterligere å bekrefte hemming av STAT-3 signalering og angiogenese av astaxanthin, vi utførte molekylær docking studie for astaxanthin med STAT-3 og VEGF. AXT ble funnet å binde med STAT-3 og VEGF med en docking score på henholdsvis -5,081 og -2,94. AXT samhandler med dimerization stedet STAT-3 for å danne hydrogenbindinger med Met 1482, Glu 1523, Arg 1593 og Asn 539 og samhandler med VEGF gjennom hydrogen bånd med Asp 41 rester (figur 6).
A. Representerer AXT skjema hydrogen bånd med Met 1428, Glu 1523, Arg 1593 og Asn 538 av STAT-3. B. Representerer AXT skjema hydrogen bånd med ASP 41 av VEGF.
For å teste antiangiogene potensialet av astaxanthin
in vitro
vi brukte ECV 304 celler. Angiogenese er en kompleks prosess som involverer celle-proliferasjon, migrering og rør formasjonen. Først bestemmes vi konsentrasjonen av astaxanthin ved hvilken det hemmer levedyktigheten til ECV-celler med 50% (IC
50). Vi brukte varierende konsentrasjoner av astaxanthin fra 5 til 400 uM. Vi har funnet at astaxanthin ikke reduserer levedyktigheten av ECV 304 celler til 50% i de konsentrasjonene som ble testet. Levedyktigheten av cellene var 100% opp til 50 uM av astaxanthin, som vist i figur 7; derfor astaxanthin ved 50 uM konsentrasjon ble brukt for videre eksperimenter. For å teste om astaxanthin hemmer spredning av endotelceller, utførte vi Alamar blå analyse og BrdU analysen. Hypoksi-indusert celleproliferasjon ble ikke påvirket av astaxanthin som bekreftet ved både BrdU-analyse, så vel som Alamar blue-analyse (figur 7).
A. IC
50 verdi for astaxanthin på ECV304 celler (Alamar blå assay). B. Effekt av astaxanthin (50 uM) på hypoksi-indusert celleproliferering (Alamar blue analyse). * P 0,05 versus normoxia. C. Effekt av astaxanthin (50 uM) på hypoksi-indusert celleproliferering (BrdU-analyse). * P. 0,05 versus normoxia
Migrasjon av endotelceller er en av de viktigste trinnene i angiogenese og metastase; derfor vi neste bestemmes effekten av astaxanthin om migrasjon. Våre resultater viste at 50 uM astaxanthin hemmet signifikant migrering av endotelceller. Som vist i figur 8, hypoksiske ECV-celler migrert omtrent 437 um etter 24 timer; mens AXT behandlet hypoksiske celler migrert bare ca 192 mikrometer, noe som indikerer antimigrasjonspotensialet av astaxanthin
A B. Representative mikrofotografier av migrasjon analysen i kontroll- og hypoksisk ECV celler ved 0 t og 24 timer (4x). C. Bar graf som representerer avstand migrert for minimum tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus normoxia. p. 0,05 versus hypoksi
Det viktigste trinnet under angiogenese er dannelsen og sammenslåing av rør produsert av endotelceller danner et komplekst nettverk av skip, derav vi neste fastsatte effekten av AXT på tube dannelse av utføre matrigel tube-analysen. Under hypoksiske tilstand, var det signifikant økning i antallet av rør som dannes, så vel som rørlengde i forhold til normoksisk tilstand. Astaxanthin behandling betydelig redusert antall rør og rør lengde etter hypoksisk tilstand. Ingen signifikante forskjeller ble observert i celler behandlet med astaxanthin i henhold normoksiske tilstand (figur 9).
A. Representative mikrofotografier av matrigel tube-analysen i kontroll og hypoksisk ECV celler (4x). B. søylediagram som representerer no. av rør for minimum tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus normoxia. * P 0,05 versus hypoksi. C. Bar graf som representerer rørlengde for minimum tre uavhengige eksperimenter
♣ p. 0,05 versus normoxia. * P. 0,05 versus hypoksi
Å kjenne mekanismen som AXT hemmer migrasjon og tube dannelse av endotelceller, vi analysert uttrykket av pro-angiogene molekyler i normoksiske og 4 timer, 8 timer, og 16 h hypoksisk ECV celler. Immunoblot-analyse viste en økning i HIF1α ekspresjon fra 4 timer som ble opprettholdt opp til 8 timer hypoksi. VEGF og MMP-2 uttrykk økt fra 8 h og utover, og fortsatte til 16 timer. Behandling med AXT redusert hypoksi-indusert økning i ekspresjonen av disse molekylene (figur 10)
A B. Representative immunoblot og søylediagram som representerer protein ekspresjon av HIF-1α, VEGF og MMP-2 i minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 versus hypoksi
Diskusjoner
Flere studier har dokumentert at avvikende aktivering av STAT-tre signalveien bidrar til neoplastisk transformasjon i ulike kreftformer, og har validert Stat 3 som et lovende mål for cancerterapi [11], [30], [31]. Utviklingen av midler som er rettet mot STAT-3 med tilstrekkelig styrke og tumor selektivitet har vist seg å være en vanskelig oppgave. Studier av andre, og vi har indikert at fytokjemikalier er involvert i kreft chemoprevention ved modulering av signaliseringskretsene avvikende i kreft [32] – [35]. I denne studien, viser vi at astaxanthin hemmer JAK /STAT-tre signalveien samt dens målgener i HBP carcinoma modell.
Funksjonene STAT-3 protein i hovedsak avhenge av fosforylering og subcellulære lokalisering. I ikke-stimulerte celler, idet STAT-3-proteiner er til stede i inaktiv form i cytosol. Aktivering av STAT-3 skjer gjennom fosforylering av dets tyrosinrest av cytokin eller vekstfaktor-reseptor-signalering. Fosforylert STAT-3 så dimerizes og translocates til kjernen hvor det binder til IFN-gamma-aktivert stedet (GAS) i DNA og aktiverer transkripsjon av målgener [12]. STAT-3 er funnet å være konstitutivt aktiv i forskjellige karsinomer og hemming av STAT-3 aktivering korrelerer med undertrykkelse av maligne celler både
in vitro
og
in vivo product: [36], [37] . Resultatene av denne studien tilveiebringe bevis for at astaxanthin supplementation opphever konstitutiv aktivering av STAT-3 ved å forhindre dets fosforylering og etterfølgende kjernetranslokasjon. Videre er interaksjonen av AXT med dimerisering området av STAT-3 av molekyltilkoblings studier bekrefter også inhiberingen av STAT-3 av AXT. Astaxanthin ble vist å hemme rotte leverkreft CBRH-7919 celler ved å modulere JAK /STAT-3 signale [38].
