Abstract
mesothelin (
MSLN
) genet koder for et 71 kDa (kDa) forløper protein som er behandlet i megakaryocytic potenfaktor (MPF), et 31 kDa protein som utskilles fra cellen, og modne mesothelin (mMSLN), et 40 kDa-celleoverflateprotein. Den mMSLN binder seg til CA125, et samspill som har vært innblandet i intra-hulrom spredning av mesothelioma og eggstokkreft. Å definere rollen MPF og mMSLN bedre, ble veksten av lungekreft cellelinje A549 evaluert i immunmangelfull mus med inaktivering av
Msln
genet. Vi observerte at
Msln Anmeldelser – /- mus xenopodet med intraperitoneal A549 svulster overleve betydelig lengre enn tumorbærende
Msln + /+
mus. Når tumor bærende
Msln Anmeldelser – /-
mus
suppleres med rekombinant MPF (og i mindre grad mMSLN), det meste av dette overlevelse fordel er tapt. Disse studiene viser at MPF og mMSLN har en viktig rolle i veksten av lungekreftceller
i
vivo Hotell og øke muligheten for at inaktivering av MPF kan være en nyttig behandling for lunge og andre MSLN uttrykke kreft
Citation. Zhang J, Bera TK, Liu W, Du X, Alewine C, Hassan R, et al. (2014) Megakaryocytic poten Factor og Eldre Mesothelin stimulere veksten av et Lung Cancer Cell linje i bukhulen på mus. PLoS ONE 9 (8): e104388. doi: 10,1371 /journal.pone.0104388
Redaktør: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA
mottatt: 24 april 2014; Godkjent: 12 juli 2014; Publisert: 13 august 2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mesothelin
(MSLN)
genet koder for en avstamning begrenset tumor antigen som er uttrykt i normale mesothelial celler lining pleura, peritoneum og hjerteposen. Det er også sterkt uttrykt i epitheliod mesotheliomas, som er utledet fra normale mesothelial celler, og avvikende i mange andre kreftformer, inkludert ovarian, bukspyttkjertel, lunge, mage, kolangiokarsinom og tre negative brystkreft [1] – [4].
MSLN
genet koder for et 71 kDa forløper protein som er behandlet i to modne proteiner: Megakaryocytic potenfaktor (MPF) og modne MSLN (mMSLN). MPF er et 31 kDa glykoprotein som utskilles fra cellen inn i blodet. Den mMSLN er et 40 kDa glykoprotein protein som forblir bundet til cellemembran av fosfatidyl-inositol [5], [6], men kaster fra celleoverflaten over tid via virkningen av TNF-α konverterende enzym (fig. 1) [7 ]. Den mMSLN har vist seg å binde seg til MUC16 (CA125); Dette samspillet har vært innblandet i intra-hulrom spredning av mesothelioma og eggstokkreft [8]. Studier av
Msln
genet slå ut (- /-) mus tyder på at genet er ikke avgjørende for normal utvikling og reproduksjon, men flere nyere studier har reist muligheten for at
MSLN
kan regulere kreft cellevekst [9] – [12]. I Eker rotter, ble utvikling av rotknoller sklerose-2-indusert renal karsinom betydelig redusert i fravær av en homolog av den
MSLN
-genet [13], [14]. I kreft i bukspyttkjertelen celler, over uttrykk for
MSLN
har vært innblandet i betydelig forbedring av tumorcellevekst og migrasjon
i
vitro product: [11]. Nylig ekspresjonsnivået av MSLN protein ble korrelert med tumor aggressivitet, så vel som redusert total overlevelse av pasienter med tidlig stadium lunge adenokarsinom [15], men den molekylære mekanisme som bidrar til disse fenotyper er ikke godt forstått. CA 125, et membranassosiert antigen eggstokkreft, har blitt rapportert til å samhandle med MSLN, og det har blitt antydet at denne interaksjonen kan lette ovarian cancer metastase. Selv om binding av MSLN-uttrykkende celler til CA 125 er vist i cellekultur [8], [16], er det ingen dyreforsøk viser at denne interaksjonen er viktig i tumorbærende mus.
GPI, glykosylfosfatidylinositol.
Vi har generert atymiske nakne mus der
Msln
genet er inaktivert, hindrer produksjon av mMsln og MPF protein. Disse musene reprodusere normalt og ingen unormalt i deres vekst eller andre egenskaper har blitt observert. Fordi disse mus ikke gjør MPF og ikke har Msln på cellene på bukhulen, har vi benyttet dem til å undersøke hvorvidt fravær av Msln påvirker veksten av lungekreftceller inokulert i bukhulen til disse mus.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og Immunohistochemistry
lungekreft cellelinjen A549 ble hentet fra Dr. Hisataka Kobayashi (National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA) og sin identitet ble bekreftet av DNA fingerprinting hjelp Short Tandem Gjentar analysen. Den humane epidermoid-karsinom-cellelinje A431 ble kjøpt fra ATCC (Mananasas, VA) og opprettholdt i laboratoriet som anbefalt. Immunhistokjemisk farging for MSLN og CA125 ble utført av Histoserv, Inc (Germantown, MD) ved hjelp av mus anti-MSLN 5B2 (Novocastra Reagenser fra Leica Bioystems, Buffalo Grove, IL) som tidligere beskrevet [17], og mus anti-CA125 OC125 (Zymed Laboratories) på 1:50 fortynning.
Animal Experiments
Animal utrede forslag (LMB-053 og LMB-014) ble godkjent av NIH Animal Care og bruk komité. Alle dyreforsøk inkludert behandling og offer ble gjennomført i henhold til de institusjonelle retningslinjer NIH. Atymiske nakne mus (NCR-nu /nu) og Akt /
Msln
– /- mus oppnådd fra NCI-Frederick ble huset i mikro-isolator bur i løpet av eksperimentet. Alle mus anvendt for forsøkene var kvinner, vekt (15-20 g) og alder (7-10 uker) matchet. Alle injeksjoner ble intraperitoneal (IP) med mindre annet er angitt. A549 og A431 IP-xenografter ble etablert ved å inokulere 2 x 10
6-celler i 200 ul cellesuspensjon i fosfat-bufret saltvann (PBS). For den subkutane modellen, ble 2 x 10
6 A549-celler injisert i høyre lår. Alle rekombinante protein behandlinger ble utført ved intraperitoneal injeksjon av 25 ug studium protein i 200 ul PBS, tre ganger i uken i totalt tre uker. For overlevelse studier, ble musene overvåkes daglig, og ofret av CO
2 innånding når døende
Generering av
Msln.
– /- Atymiske nakne mus
Mann
Msln
null mus i C57 /BL6 genetisk bakgrunn (
Msln Anmeldelser – /-) [9] ble brukt til å sikkerhets krysse med BALB /c villtype (WT) mus og kull ble screenet for
Msln
heterozygot allel. Mann heterozygote mus fra hver generasjon ble vant til kryss med WT BALB /c kvinner og tilbake krysset ble utført i mer enn ti generasjoner. Hanner heterozygote for
Msln
i BALB /c genetisk bakgrunn ble krysset med atymiske nakne (Fox N) kvinner til å generere Fox N null /
Msln
– /- mus. Since Fox N null /
Msln Anmeldelser – /- hunnmus er ikke gode oppdrettere, brukte vi
Msln Anmeldelser – /- /Fox N Het kvinner som yngle samarbeidspartnere for Fox N null /
Msln
– /- menn å opprettholde og generere Fox N null /
Msln Anmeldelser – /-. hunnene for våre eksperimenter
Generering av MPF-Rabbit (r) Fc, mMSLN- RFC og CD22-RFC fusjonsproteiner i pattedyrceller
for å generere rekombinante versjoner av mMSLN og MPF, mMSLN-RFC og MPF-RFC ble uttrykt som fusjonsproteiner med kanin IgG (RFC) i HEK293T celler og renset som tidligere beskrevet [18]. CD22-RFC-fusjonsproteinet ble fremstilt for anvendelse som en kontroll.
Flow Cytometry
Cellene ble høstet, vasket og resuspendert i iskald FACS-buffer (PBS med 5% FBS og 0,1 % natriumazid), og deretter inkubert med anti-mesothelin antistoff, MN (Rockland immunokjemiske Inc., Gilbertsville, PA) eller Morab-009 (Morphotek Inc., Exton, Pennsylvania) eller anti-MUC16 antistoff, OC125 (Abcam, Cambridge, MA) i en konsentrasjon på 5 ug /ml. Isotop-matchet-antistoff ble anvendt som en kontroll. Bindingen av primære antistoffer mot tumorceller ble detektert ved anvendelse av enten geite-anti-muse-konjugert med R-fykoerytrin (R-PE) (Invitrogen) eller med geit anti-mus konjugert med FITC (Biosource). Fluorescens assosiert med de levende celler ble bestemt ved bruk av et FACS Calibur (BD Biosicences). Geometriske middel ble uttrykt som midlere fluorescensintensitet (MFI). MFI for celler ble sammenlignet med MFI fra en standardkurve av R-PE-konjugerte kalibrerings perler (BD QuantiBRITETM PE kvantifisering kit, BD Biosciences) og antall mMSLN sider per celle ble beregnet. Resultatene var lignende med MN (n = 2 forsøk) eller Morab-009 (n = 3 forsøk).
MPF Kvantifisering
A549 celler stabilt transfektert med enten vektor kontroll (A549 /pcDNA) eller MPF ekspresjonsvektor (A549 /MPF) ble sådd ut i skåler inneholdende tilsvarende mengde av fullstendig medium og inkubert i 48 timer. Total cellepopulasjon ble tellet ved anvendelse av en Cellometer Vision celleteller (Nexcelom, St. Lawrence, MA) En like volum porsjon av kondisjonert medium ble fjernet fra hver tallerken og konsentrasjonen av MPF i oppløsningen ble kvantifisert ved anvendelse av en proprietær human MPF enzyme-linked immunosorbent analysesett (Morphotek, Easton, PA).
Soft agar analysen
A549 /pcDNA eller A549 /MPF stabile transfektanter ble suspendert i 0,35% agar, belagt i 6 brønners plater (2 × 10
3 celler /brønn) og inkubert i 15-21 dager ved 37 ° C. Etter at krystallfiolett farging ble platene vasket i 1 time og deretter skannet for å produsere digitale bilder. Kolonier ble tellet i løpet av en forhåndsdefinert, sentralt plassert square felt med sidelengde lik en tredjedel av brønndiameteren. Flere brønner (n) ble tellet for hver av de tre uavhengige eksperimenter. Det midlere antall kolonier for hvert forsøk er angitt med standard avvik (SD). KB-celler ble brukt som en positiv kontroll for kolonidannelse.
Statistical Analysis
For overlevelse studier ble Kaplan-Meier-kurver plottet og sammenlignet med log-rank test. En Mann-Whitney test ble brukt for statistisk sammenligning av overlevelsesdata. P 0,05 ble anvendt som grensen for statistisk signifikans. All statistisk analyse ble utført ved hjelp av Prism (versjon 5) for Mac (GraphPad programvare).
Resultater
Tidligere studier har vist at mMSLN samhandler med eggstokkreft tumor antigen CA125, og at denne interaksjonen kan være viktig i metastatisk spredning av ovariecancer gjennom bukhulen [8], [16], [19]. For å vurdere effekten av MSLN på IP vekst av humane kreftceller, opprettet vi Fox N null /
Msln
– /- mus. For å sikre at
Msln
genet var inaktivert og at musene ikke gjorde Msln vi først bekreftet sletting bruker polymerase chain reaction å screene for de slettede lene av
Msln
genet (data ikke vist). Mangel på mMsln protein-ekspresjon ble bekreftet ved analyse immunohistochemical fra musevev ved hjelp av kanin-polyklonalt anti-Msln-antistoff, etterfulgt av påvisning farge som tidligere beskrevet [9] (fig. 2). Immun undertrykkelse forårsaket av FoxN sletting tillater xenograft eksperimentere med humane tumorceller. Vi brukte lungekreft cellelinjen A549, som har meget lav ekspresjon av MSLN (gjennomsnitt på 3,5 x 10
3 mMSLN bindingsseter /celle), men robust ekspresjon av CA125 (fig. 3). Vi injisert to millioner A549 celler i bukhulen til
Msln
– /- og
Msln + /+
nakne mus, så overvåket for overlevelse av dyrene. Som vist i figur 4A, var det en statistisk signifikant forskjell i overlevelse mellom de to gruppene av mus. Median overlevelse av
Msln + /+
mus var 31 dager, men økte til 46 dager i
Msln Anmeldelser – /- mus (p 0,0001). Nesten 25% av
Msln Anmeldelser – /- mus overlevde over fire måneder (tabell 1), mens alle de
Msln + /+
mus døde innen 50 dager (Fig. 4A). Ingen lik overlevelse ble sett når A431 epidermoid kreftceller (Fig. 4B), som uttrykker verken MSLN eller CA125, ble inokulert intraperitonealt. Tumorvekst ble også vurdert når A549 lungekreft celler ble inokulert subkutant. I denne modellen, svulster i
Msln Anmeldelser –
/
– og
Msln + /+
mus vokste i samme takt (Fig. 4C), viser at
Msln
uttrykk har ingen effekt på tumorvekst i dette kammer.
En porsjon av lungevev ble fiksert i 4% paraformaldehyd innstøpt i parafin og snittet 5 til 6 pm i tykkelse, og deretter farget for MSLN. A-C: Lung vev skjema
FoxN null /Msln product: (+ /+) farget med anti-Msln antistoff (A: 100X, B: 200X forstørrelse); eller sekundært antistoff bare (C: 100X forstørrelse) som negativ kontroll. D-F: Lung vev skjema
FoxN null /Msln product: (- /-) farget med anti-Msln antistoff (D: 100X, E: 200X forstørrelse); eller sekundært antistoff bare (F: 100X forstørrelse) som negativ kontroll. Som forventet sterk mesothelin uttrykk ble påvist i mesothelial cellen slimhinnen i lungene fra
FoxN null /Msln product: (+ /+) mus, men ingen uttrykk i lunge fra
FoxN null /Msln product: (- /-.) mus
Celler ble inkubert med de angitte primære antistoffer eller isotop-kontrollantistoffer, og passende sekundært antistoff (geite-anti-mus IgG, R-PE eller geit anti-mus, FITC). Resultatene er vist som plott histogram for binding av primært antistoff (svart kurve) eller isotypekontroll (grå kurve). A431-celler er negative for begge MSLN og CA125. A549 celler viser lav mesothelin uttrykk (3,5 × 10
3 steder /celle), men svært express CA125
(A) Plot viser overlevelse av mus etter å ha mottatt IP injeksjon av A549 celler.; median overlevelse på
Msln Anmeldelser – /- mus er 46 dager og
Msln (+ /+)
mus er 31 dager (
p
0,0001). (B) Plot viser overlevelse av
Msln product: (-
/Anmeldelser -) eller
Msln product: (+ /+) mus etter IP injeksjon av A431 celler. (C) Plot viser overlevelse av
Msln product: (-
/Anmeldelser -) eller
Msln (+ /+)
mus etter subkutan injeksjon av A549 celler (D) Overlevelse av A549 xenograft peiling
Msln product: (- /-). mus etter å ha mottatt MPF-RFC eller mMSLN-RFC eller CD22-RFC proteiner
bilder
i intraperitoneal modellen, mager av A549 tumor-bærende mus ble svellet like før døden. Ved obduksjon ble tumormasser vokser på peritoneal veggen, på omentum, og på den store og tynntarmen. IHC demonstrerer at disse A549 svulster gjør ingen påvisbar MSLN (fig. 5A), men gjør CA 125 (fig. 5B). Disse resultatene indikerer at MPF, mMSLN eller begge kan øke aggressivitet A549 svulster i bukhulen.
En atymiske nakne mus ble ofret 26 dager etter IP inokulering med A549 celler. Tumorer ble immunfarget med (A) anti-MSLN og (B) anti-CA125 monoklonale antistoffer. Disse svulstene var negative for MSLN men positivt for CA125 uttrykk som vist ved brune flekker av tumorceller.
Vi antok at dersom tap av
Msln
var ansvarlige for den bremset tumorprogresjon hos
Msln Anmeldelser – /- mus, så eksogene utskifting av sine protein produkter, MPF eller mMSLN, kan gjenopprette mer aggressiv sykdomsforløp sett i
Msln
(+ /+) mus. Derfor syntetisert vi rekombinant MPF-RFC, mMSLN-RFC, og en kontroll CD22-RFC protein. Den strategiske tilsetning av kanin Fc-delen øker i betydelig grad halveringstiden til disse molekylene, men antas ikke å forstyrre funksjonen. A549-celler ble injisert inn i bukhulen av
Msln
– /- mus som før, og deretter, som begynner på dagen for implantering, ble musene behandlet med en av de rekombinante Fc-proteiner annenhver dag i totalt seks doser. Som oppsummert i Tabell 1 og vist på figur 4D, median overlevelse av
Msln
– /- mus behandlet med CD22-RFC kontroll peptidet fortsatt 46 dager. Imidlertid median overlevelse av mus behandlet med MPF-RFC ble redusert til 31 dager, ligner på overlevelsen av
Msln plakater (+ /+) mus injisert med A549-celler (fig. 4A). Injeksjon av mMSLN-RFC også produsert en statistisk signifikant reduksjon i median overlevelse, selv om effekten var mindre markert (42 dager, p 0,016). Resultatene fra dette forsøket tyder på at tap av MPF snarere enn mMsln er hovedansvarlig for forlenget overlevelse av
Msln Anmeldelser – /-. Mus med xenopodet A549 celler
For å finne ut om MPF virker direkte på de A549 celler for å forbedre deres vekst eller aggressivitet, vi stabilt transfektert
MPF
cDNA inn A549 celler. MPF-ekspresjon ble bestemt ved modifisert ELISA-analyse av kondisjonert medium og produsert mengde av 1 x 10
6-celler, ble beregnet basert på en standard kurve av rekombinant MPF. Mens A549 /MPF-kloner produsert ca. 400 ng av MPF i 48 timer, ble det ikke påvist MPF i tilstanden medium til A549-celler transfektert med vektor kontroll (A549 /pcDNA). Vi merket ingen åpenbar forskjell i veksttakten eller morfologi av
MPF
-transfected A549 celler sammenlignet med vektor transfektert kontroll (data ikke vist). Forankrings-uavhengig vekst av disse celler i bløt agar ble også vurdert. Som vist i tabell 2 er det ingen statistisk forskjell i kolonidannelse mellom
MPF
-transfected A549 celler og vektor-transfiserte styreledning. Disse tyder på at MPF ikke direkte fremme veksten av A549 celler.
Diskusjoner
For vår studie har vi opprettet en musemodell som mangler
Msln
gen og er ettergivende for veksten av humane kreftceller. Den A549 lungekreft cellelinje som brukes til å danne IP svulster i våre eksperimenter gjør kun minimale mengder mMSLN, slik at alle MPF og mMSLN må leveres eksogent. Vi observerte en statistisk signifikant 15 dagers forskjell i overlevelse mellom
Msln + /+ Hotell og
Msln Z – /- mus med intraperitoneale A549 svulster. Dette funn var cellelinje spesifikk og interessant nok ikke observert i en subkutan modell. Disse resultatene indikerer at et produkt av
Msln
genet spiller en viktig rolle i å fremme
i
vivo
tumorvekst og progresjon for enkelte typer kreftceller vokser i peritoneal hulrom.
MPF og mMSLN er både protein produkter laget av uttrykk for
MSLN
genet. Begge proteiner er høyt uttrykt ved et antall faste tumor maligniteter, inkludert mesothelioma, bukspyttkjertel og eggstokk-kreft [1], [4]. Flere studier har undersøkt hvordan endringer i uttrykk for
MSLN
genet kan endre tumorvekst, progresjon eller invasivitet å produsere en mer aggressiv svulst fenotype. Overekspresjon av
MSLN
genet ble vist å øke interleukin (IL) -6 signaliserer [11], og å gi resistens mot tumornekrosefaktor (TNF) -a mediert apoptose i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [20]. Ektopisk uttrykk for
MSLN
genet i en human brystkreft cellelinje fremmet celle overlevelse og forankringsuavhengig vekst
i
vitro product: [10]. Andre studier har vist en viktig rolle for
MSLN
genet i å regulere vekst og apoptose via både p53-avhengige og uavhengige baner i kreft i bukspyttkjertelen celler [12]. I alle disse
i
vitro
studier, pro-tumorigene effekter av
MSLN
genmanipulering ble antatt å være mediert av endringer i uttrykket av mMSLN, selv om den genetiske manipulasjoner i forsøkene skal produsere tilsvarende endringer av MPF nivåer
for å skille bidrag fra MPF eller mMSLN til fenotype vi observerte i vår studie, vi levert eksogene rekombinant protein til
Msln
. – /- mus. Vi fant at MPF supplementation redusert animalsk overlevelse 15 dager sammenlignet med mus behandlet med et kontrollprotein. Mens supplering med mMSLN gjorde redusere overlevelse en statistisk signifikante 4 dager, er det klart at MPF er mer potent faktor i vår modell.
MPF ble opprinnelig identifisert som en vekstfaktor som kan fremme kolonidannelse av megakaryocytter når gitt i kombinasjon med IL-3 [5]. Til dags dato har ingen MPF-reseptoren blitt identifisert på megakaryocytter eller andre celler. Heller ikke har teorier blitt fremsatt for å forklare hvorfor et protein som normalt uttrykkes utelukkende av mesothelial celler bør ha en hovedfunksjon som en megakaryocytt- stimulerende faktor. Interessant, i våre eksperimenter, mens MPF økt tumor aggressivitet
i
vivo
, tvunget overekspresjon av MPF produsert ingen vekst fordel
i
vitro.
Dette antyder at effekten av MPF på tumor aggressivitet ikke formidles ved en direkte virkning av MPF på svulsten, men kanskje ved å arbeide indirekte på andre celler. Selv om det kan være fristende å tenke at MPF kan ha en immun effektor funksjon, ble våre eksperimenter utført i lymfocytt-mangelfull mus, noe som tyder på at en annen mekanisme er mer sannsynlig å være ansvarlig. Identifikasjon av celletype (r) er ansvarlig for formidling av denne virkningen av MPF er utenfor rammen av denne studien.
Selv om våre observasjoner ble gjort ved bruk av en enkelt celletype, effekten vi observert på overlevelse var dyp og reproduserbar. Våre data antyder at MPF kan være en viktig mediator av tumor aggressivitet i bukhulen, og at inhibering eller lagring av MPF kan være klinisk nyttige i å bremse veksten av enkelte krefttyper som vokser i bukhulen. Studier for å teste denne hypotesen er igangsatt.
