Abstract
repressor element stanse transkripsjonsfaktor (REST) er en koordinat transkripsjonen og epigenetisk regulator som fungerer som en tumor suppressor eller en onkogenet avhengig cellulær kontekst, og en avkortet spleisevariant REST4 har vært knyttet til forskjellige typer kreft. Vi utførte en omfattende analyse av alternativ spleising (AS) i
REST
ved rask forsterkning av cDNA slutter og PCR forsterkning av cDNA fra ulike vev og cellelinjer med spesifikke primere. Vi identifiserte 8 nye alternative eksoner inkludert en alternativ siste ekson som dobler
REST
genet grensen, sammen med en rekke 5 «/3» spleiseseter og ender i de konstitutive eksoner. Med kombinasjonen av forskjellige spleise mønstre (f.eks ekson hoppe og alternativ bruk av de første og siste exon) som er prediktive for endret REST aktivitet, i det minste 45 alternativt spleiset varianter av kodende og ikke-kodende mRNA ble uttrykt i en arts- og celle -type /vev-spesifikk måte med individuelle forskjeller. Ved å undersøke repertoar av
REST
pre-mRNA spleising på 27 pasienter med nyre, lever og lunge kreft, fant vi at alle pasienter uten unntak viste differensial uttrykk for ulike
REST
spleise varianter mellom paret svulst og tilstøtende normalt vev, med slående celle-type /vev og individuelle forskjeller. Videre har vi vist at exon 3 hopper over, noe som fører til ingen ramme forskyvning, men tap av et domene essensielle for kjernetranslokasjon, ble påvirket av pioglitazon, er en svært selektiv aktivator for peroksisomproliferator-aktivert reseptor gamma (PPARy) som bidrar til celle differensiering og tumorigenesis foruten sine metabolske handlinger. Følgelig denne studien viser en omfattende AS på
REST
pre-mRNA som redefinerer
REST
genet grense og struktur, sammen med en generell, men differensial koblingen mellom
REST
pre- mRNA spleising og ulike typer kreft. Disse funnene fremme vår forståelse av den komplekse, kontekstavhengig regulering av
REST
genekspresjon og funksjon, og gi potensielle biomarkører og terapeutiske mål for kreft
Citation. Chen GL, Miller GM ( 2013) Omfattende alternativ spleising av Repressor Element lyddemping transkripsjonsfaktor knyttet til kreft. PLoS ONE 8 (4): e62217. doi: 10,1371 /journal.pone.0062217
Redaktør: Emanuele Buratti, International Centre for genteknologi og bioteknologi, Italia
mottatt: 14 februar 2013; Godkjent: 18 mars 2013; Publisert: 16 april 2013
Copyright: © 2013 Chen, Miller. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir DA025697 (GMM), DA030177 (GMM), og OD11103 (NEPRC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Alternativ spleising (AS), en prosess for å forskjellig kobling eksoner i en enkelt forløper mRNA (pre-mRNA) for å produsere to eller flere forskjellige modne mRNA, er en stor bidragsyter til transkriptomet og proteomet mangfold, med 90% av humane gener som gjennomgår AS på en vevs- og utviklingsstadium-spesifikk måte, [1], [2]. Det er nå erkjent at koplingen mellom transkripsjon og spleising er avgjørende for AS regulering [3], [4], og at ekson-intron veikryss eller spleiseseter (SS) er spesifisert av epigenetiske modifikasjoner avhengig cellulær sammenheng [4], [ ,,,0],5]. Følgelig epigenetiske modifikasjoner påvirker ikke bare transkripsjon, men også ko-transkripsjonelle spleise [6], [7]. Epigenetisk regulering av pre-mRNA spleising, i tråd med spatiotemporal utvalg av SS, tyder på at cross-samtaler med miljø signaler for å bidra til tilpasninger og sykdom patofysiologi. Faktisk AS er modulert av biologiske klokke, psykologisk stress, og mange hormoner og kjemikalier [8] – [10], mens anslagsvis 15-60% av menneskelige genetiske sykdommer, alt fra nevrologisk til tumorigen og metabolske forstyrrelser, involverer skjøting mutasjoner [2], [11] – [14]
repressor element stanse transkripsjonsfaktor (REST, også kjent som NRSF for nevron-restriktiv stanse faktor), opprinnelig identifisert som en repressor av nevronale gener i ikke-. nerveceller [15], [16], er nå anerkjent som et koordinatsystem transkripsjonen og epigenetisk regulator som orkestrerer mobil epigenome i både nevrale og ikke-nevronale celler [17]. REST binder seg til utbredt genomiske regulatoriske sekvenser, inkludert repressoren element-1 (RE1) av et DNA-bindende domene (DBD) som består av 8 sinkfinger motiver (ZFMs), mens dens effekt på genekspresjon mediert av to uavhengige undertrykkelse domener ( RD1 og RD2) som direkte eller indirekte rekruttere tallrike transkripsjons- og epigenetiske kofaktorer. Kort, rekrutterer den N-terminale RD1 mSin3, et stillas for histone deacetylases (HDACs), mens C-terminale RD2 partnere med resten corepressor (CoREST) som i tillegg rekrutterer HDACs, metyl-CpG bindende protein 2 (MeCP2), histon H3K4 lysin demetylase (LSD1) og H3K9 metyltransferaser (G9a), samt en komponent i SWI /SNF kromatin remodeling kompleks-Brg1. Ved å rekruttere flere kofaktorer å målrette genloci, fremmer REST dynamisk, situasjonsavhengig kromatin organisasjon og undertrykkelse /aktivering av tusenvis av gener involvert i mange cellulære prosesser, inkludert tumorigenesis, som det fungerer som en tumor suppressor eller et onkogen avhengig av mobilnettet sammenheng [ ,,,0],18], [19]. Den mangfoldige, kontekstavhengig funksjon av REST er spesifisert ved flere mekanismer inkludert proteasomal degradering, nukleær translokasjon og pre-mRNA-spleising [20] – [23], så vel som modulering av ikke-kodende RNA (ncRNAs) og bindingsaffiniteten REST til diverse RE1 og ikke-RE1 nettsteder [24], [25].
REST
gjennomgår AS med et begrenset antall Skjøt varianter har blitt rapportert, hvorav en C-terminal avkortet variant REST4, som inneholder RD1 og ZFMs 1-5, har blitt godt dokumentert [20], [21]. Som en dominant negativ, REST4 knyttet til småcellet lungekreft (SCLC), neuroblastom og brystkreft [26] – [28], og den bidrar til tidlig-liv programmering av stressrespons, nevrobeskyttelse og hormonelle regulering av glutamin synthethase [ ,,,0],29] – [31]. Ytterligere to spleisevarianter, REST1 som inneholder RD1 og ZFMs 1-4 [16], og REST-5FΔ med en sletting av ZFM-5 [27], har også blitt dokumentert. Spesielt, er REST4 med ZFM-5 transportert til kjernen, mens REST1 uten ZFM-5 ikke er [32], og det ble senere demonstrert at ZFM-5 er avgjørende for den kjernefysiske målretting av REST [33].
i denne studien utførte vi en omfattende analyse av AS av
REST
pre-mRNA og undersøkt dens relevans for kreft. Vi viser at: 1)
REST
gjennomgår omfattende AS tvers av et gen grense nå fordoblet ved en ny siste exon (E
5), med en rekke koding og ikke-kodende mRNA-er er utformet med en arts- og celletype /vev-spesifikk ekspresjon; 2) en rekke
REST
spleisevarianter, som er forårsaket av ulike skjøte mønstre (f.eks ekson hopper og alternativ bruk av de første og siste exon) prediktiv av endret REST aktivitet, men er generelt differensielt koblet til ulike typer kreft ; og 3) ekson 3 (E
3) hoppe, noe som fører til ingen ramme skift, men tap av ZFM-fem avgjørende for kjernefysisk translokasjon, er bemerkelsesverdig påvirket av pioglitazon, en svært selektiv agonist for PPARy som modulerer celledifferensiering og tumorigenesis foruten dens metabolske handlinger. Disse funnene fremme vår forståelse av kompleksiteten i
REST
genregulering og funksjon, og gi potensielle biomarkører og terapeutiske mål for kreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
bruk av menneskelig vev ble godkjent av Harvard Institutional Review Board, og de relaterte prosjekter der aper og mus ble avlivet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité for Harvard Medical School. Harvard Medical School dyr management program er akkreditert av American Association for akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) og møter National Institutes of Health standarder som angitt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (DHHS publikasjon nr ( NIH) 85-23 Revidert 1985). Institusjonen aksepterer også som obligatorisk PHS politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr ved prisvinner Institusjoner og NIH Prinsipper for Utnyttelse og vedlikehold av virveldyr som brukes i testing, forskning og opplæring.
Dyr (aper og mus) som er involvert i denne studien var ivaretatt i samsvar med National Institutes of Health, US Department of Agriculture, og Harvard Medical School retningslinjer for dyreforsøk. Makaker var single-huset og alle anstrengelser ble gjort for å redusere ubehag og gi berikelse muligheter (f.eks variert kosttilskudd, beite og oppgaveorienterte fôringsmetoder og samspill med omsorgspersoner og forskere). Spesielt makaker ble matet to ganger daglig (AM og PM) med en balansert kommersielt tilgjengelig Old World Primate Diet (f.eks Harlan Teklad 8714 Monkey Diet). Frukt og /eller vegetabilske kosttilskudd ble gitt til alle dyrene daglig, og drikkevann ble gitt ad libitum av automatiske vann lixits eller plastflasker. Vevsprøver ble oppsamlet fra fem aper som var blitt anvendt i andre forsøk på tidspunktet for deres nekropsi. Makaker ble avlivet følgende blir bedøvet med ketamin HCl ved en intravenøs pentobarbital overdose, og tappet for blod. Mus ble avlivet med karbondioksidgass inhalering fulgt ved cervikal dislokasjon, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere smerte.
humane og animalske vev
cDNA-sampler utledet fra voksne normale humane vev (nyre, lever, lunge, hypofysen, hippocampus, amygdala og pons, en for hver) ble kjøpt fra BioChain® Institute, Inc (Newark, CA). 27 par av svulsten og nærliggende normalt vev fra pasienter diagnostisert klinisk med nyre, lever og lunge kreft (9 par for hver) ble innhentet fra UMass Cancer Center Tissue Bank (5 par for hver kreft vev i RNAlater) og BioChain® Institute Inc (4 par for hver kreft som total RNA). Den demografisk informasjon av pasientene kort er vist i tabell 1. De humane perifere mononukleære blodceller (PBMC), som ble renset som beskrevet tidligere [34], ble vennligst Gitt av Dr. Fred Wang ved Brigham Dame Hospital. Vi har også samlet vev fra rhesusaper og mus avlives for andre prosjekter.
Cellelinjer og medikamentell behandling
I alt 18 cellelinjer avledet fra menneske (HEK293, HEK293T, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7-, K562, SK-N-MC, HeLa, Raji, TE671, Jurkat, Sup-T1 og indusert pluripotent stilk (iPS)), ikke-menneskelig primat (COS-7) og gnagere (RN46A og PC12) ble benyttet i denne studien. Bortsett RN46A og iPS, ble alle de andre 16 cellelinjer hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). RN46A celler ble vennlig levert av Dr. Scott Whittemore [35], mens iPS-cellene ble stammer fra Dr. Stephen J. Haggarty [36]. For å undersøke effekten av pioglitazon på
REST
pre-mRNA-spleising, den NCCIT, HEK293T og HepG2-celler ble behandlet med enten 10 uM pioglitazon (Sigma-Aldrich) eller et matchet konsentrasjon av oppløsningsmiddel (0,04% DMSO ), og cellene ble høstet ved 48 timer etter behandling. Behandlinger ble utført i duplikat på 3 uavhengige anledninger.
RNA isolering og cDNA syntese
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol® reagens (Invitrogen). En alikvot av total RNA ble revers transkribert inn i cDNA ved å bruke QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen), mens en annen prøve ble reverstranskribert inn i cDNA ved hjelp av en forankret oligo-dT (ankersekvensen angitt i tabell 2). Syntetiserte cDNA ble fortynnet til 50 ng /mL for bruk.
PCR forsterkning og DNA-sekvense
En touchdown PCR protokoll ble ansatt for både standard og nestet PCR, og presiseringer ble utført i en MJ Forskning PTC-200 Peltier Thermal Cycler (GMI) i et totalvolum på 20 ul som består av 1 pl av malen (50 ng /ul cDNA for standard eller en
st trinn PCR, og 1:20 fortynnet produktet av 1
st trinn PCR for 2
nd trinnet med nestet PCR), 10 pmol av hver primer (tabell 2), og 10 ul av GoTaq® Grønn Master Mix (Promega). Det første trinnet i nestet PCR ble utført ved hjelp av cDNA laget av forankrede oligo-dT som mal og oligo-dT anker sammen med E
1AF
2, E
1BTK
2 og E
1CF
2 som primer sett. For voksne normale menneskelige vev uten cDNA laget av forankrede oligo-dT tilgjengelig, ble det oligo-dT anker erstattet av E
4R
3 og E
5R
2 (utenfor E
4R
1 og E
5R
1, henholdsvis). Primere for rhesusape og gnagere ble endres hvis nødvendig. Amplifikasjonsbetingelser involverte en innledende 2,5 minutter denaturering ved 95 ° C, etterfulgt av 28 (for 1
st trinnet med nestet PCR) eller 40 (for standard eller to
nd trinnet med nestet PCR) sykluser av 30 s denaturering ved 95 ° C, 30 s annealing (temperatur som starter ved 61 ° C og redusert med 0,5 ° C /syklus for de første 12 sykluser, deretter fiksert ved 55 ° C), og 60~180 s forlengelse ved 72 ° C, med en endelig forlengelse av 5 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter ble lastet på en 2% agarosegel og amplikonene av tydelig størrelse ble skåret ut, renset og sekvensert. DNA-sekvensering ble utført som kommersiell tjeneste ved Funksjonell biovitenskap Inc (Madison, WI). PCR-produkter med dårlig kvalitet sekvense data ble klonet inn pGEM®-T vektor (Promega) for videre sekvensering.
5 «/3» Rapid forsterkning av cDNA ender (RACE)
Total RNA generert fra HEK293, HEK293T, HepG2 og SH-SY5Y ble brukt til å utføre 5 «og 3» RACE, som ble utført av to kommersielle kits, 5 «/3» RACE Kit (2
nd Generation) fra Roche ( Indianapolis, iN) og GeneRacer® fra Invitrogen, som varierer i strategier for 5 «RACE. For 5 «RACE med GeneRacer® kit, ble en RNA Oligo først bundet til RNA, etterfulgt av cDNA syntese hjelp Oligo-dT og nestet PCR ved hjelp av
REST
-spesifikke revers primere (f.eks E
4R
1 og E
4R
2) sammen med en GeneRacer® 5 «primer (homolog til RNA Oligo). For 5 «RACE med Roche kit, ble cDNA først syntetisert fra total RNA ved hjelp av en
REST
-spesifikke revers primer (f.eks E
4R
2, utenfor), etterfulgt av tailing med dATP og terminale transferase og påfølgende nestet PCR bruker forankret Oligo-dT eller anker primer sammen med en
REST
-spesifikke revers primer (f.eks E
4R
1 inne). For å utføre 3 «RACE, ble cDNA syntetisert fra total RNA ved hjelp av forankrede Oligo-dT, etterfulgt av nestet PCR ved hjelp av
REST
-spesifikke forward primere (f.eks E
1AF
1 og E
1AF
2) sammen med anker primer.
kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) assay
ved hjelp av primere som er oppført i tabell 2, har vi utviklet SYBR Grønn i og /eller hybridisering Probe QRT-PCR for spesifikke exon-ekson kryss og exon 2 (E
2, representerer antagelig generell ekspresjon av kodende mRNA, uavhengig av det første og siste eksoner), samt husholdningsgenet
GAPDH
. QRT-PCR-analyser ble utført som tidligere beskrevet på en Roche LightCycler 2,0-system [37], med terskelen syklus (Ct) -verdier som anvendes for å beregne uttrykket endringen mellom parede vev eller celler ved 2
-ΔΔCt tilnærming [ ,,,0],38]. PCR-reaksjoner ble kjørt i duplikat. For E
1a /E
4 veikryss som uttrykkes på lave nivåer i de fleste tilfeller, er bare SYBR Grønn jeg analysen tilgjengelig og Ct-verdiene er trolig forvirret av primer-dimer dannet av overdreven gjenværende primere, så vi utførte QRT -PCR ved å bruke produktet fra en
st trinn PCR som templat. På grunn av den høye sekvensidentitet mellom 3′-endene av E
2 og E
3, QRT-PCR-analyse spesifikk for E
2 /E
4 knutepunkt var ikke oppnåelige.
Bioinformatikk og dataanalyse
Prediksjon av den åpne leseramme (ORF) av bestemt
REST
varianter ble utført ved hjelp av StarORF program (https://star.mit.edu/orf /runapp.html), og epigenetisk informasjon i
REST
locus ble hentet fra UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Sammenligninger av QRT-PCR-analysert uttrykk nivåer av spesifikke exon-ekson overganger mellom parede vev eller celler ble utført av to
-ΔΔCt tilnærming ved hjelp av passende referanse, og to ganger endring ble ansett som signifikant.
Resultater
Identifikasjon av E
2 /E
3 Hoppe uttrykt i et artsavhengig måte
Vi utførte standard og nestet PCR med cDNA prøvene stammer fra en rekke menneskelige vev (lever, nyre, lunge, hypofysen, hippocampus, amygdala og Pons) og cellelinjer (HEK293, HEK293T, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7 og iPS). Ved hjelp av en omvendt primer E
4R
1 målrette den proksimale ekson 4 (E
4) sammen med fremover primere E
1AF
1 og E
2F
1 målretting eksoner 1a (E
1a) og 2 (E
2) (figur 1A og tabell 2), henholdsvis, identifiserte vi flere
REST
spleise varianter med E
2 og /eller E
3 hoppet (Figur 1B og 1C). Varianten med E
2 hoppet er rikelig uttrykt i alle testede cellelinjer og vev unntatt amygdala, mens variantene med E
3 alene eller pluss E
2 hoppet ble uttrykt på et lavt nivå i en undergruppe av vev og cellelinjer. Spesielt, E
2 /E
3 hopper er hovedsakelig forbundet med E
1a, men sjelden med E
1b og E
1c (figur 1B). I tillegg E
2 /E
3 hopper ble observert i ytterligere 7 humane cellelinjer og perifere blod mononukleære celler (PBMC) (figur S1).
(A) Illustrasjon av annotert
REST
eksoner og plassering av primere benyttes for identifisering av
REST
spleisevarianter. De konstitutive eksoner (1a, 2, 3 og 4) og alternative eksoner (1b, 1c og N) er vist i åpen og grå bokser, henholdsvis, mens forover- og reversprimerne er angitt med høyre og venstre piler, henholdsvis. (B) Påvisning av E
2 /E
3 hopper i menneskelig vev og cellelinjer ved nestet PCR med spesifikke primer sett. E
2 /E
3 hopper er vanligvis forbundet med E
1a, men sjelden forbundet med E
1b og E
1c. (C) Trace kromatogrammene for exon-ekson veikryss involvert i E
2 /E
3 hopper. (D) Påvisning av E
2 /E
3 hopper i vev og cellelinjer fra ikke-menneskelige primater og gnagere ved nestet PCR. Av de mange rhesus vev, E
2 hoppe alene ble kun observert i amygdale (a) og pineal (b).
Vi testet om E
2 /E
3 hopper er uttrykt i ikke-humane primater og gnagere vev og cellelinjer. Som vist i figur 1D, hopper av E
2 alene, ble bare observert i mandelen og pineal ut av 17 vev oppnådd fra en rhesusape, mens hopper av både E-
2 og E
3 ble bare observert i macaque PBMC og COS-7 celler (avledet fra afrikanske grønne aper nyre); imidlertid, hopper av E
3 alene ble observert i de fleste vev og macaque COS-7-cellelinjen. I gnagere, hopper av E
2 (alene og i tillegg til E
3) ble observert i RN46A men ikke PC12-celler, mens hopper av E
2 alene ble observert i hippocampus fra to av fire mus som ble testet, tyder på en inter-individ forskjell. Tilsvarende individuell forskjell i
REST
pre-mRNA spleising ble også observert i pons og rafe fra 4 makaker (Figur S2).
Funn av en roman siste ekson som dobler menneskelig
REST
genet grense
Vi utførte RACE for å bestemme de 5 «og 3» endene av menneskelig
REST
mRNA. Uventet, identifiserte vi en roman polyadenylert ekson (E
5) som lokaliserer ~ 30 kb nedstrøms E
4 og delvis overlapper i motsatt retning med ekson 5 av nitrogenoksid assosiert-en (
NOA1
) genet (figur 2A), som koder for en GTPase essensiell for proteinsyntese mitokondrielle [39]. Ved nestet PCR ved hjelp av en E
5-spesifikke revers primer (E
5R
1) er sammenkoblet med E
1AF
1 og E
2F
1, henholdsvis, vi fant at E
5 inkludering, noen ganger i kombinasjon med E
2 /E
3 hopper over, kommer til uttrykk i de fleste menneskelige vev og cellelinjer (figur 2B, 2C og figur S1). Som E
2 /E
3 hoppe, E
5 inkludering er først og fremst forbundet med E
1a, men sjelden med E
1b og E
1c. Spesielt, fant vi ingen varianter som inneholder både E
4 og E
5, noe som tyder på at E
4 og E
5 er gjensidig utelukkende, og at E
4, som er tilfelle for E
2 og E
3, kan være helt hoppet over. Følgelig romanen siste ekson E
5 dobler den menneskelige
REST
genet grensen fra ~28 kb til ~59 kb (figur 3A). E
5 inkludering ble ikke observert i humane primater og gnagere.
(A) Sekvens av E
5 og dens delvis (81 bp) overlappende med
NOA1
genet i motsatt retning. (B) Påvisning av E
5 inkludering i menneskelig vev og cellelinjer ved nestet PCR. (C) Trace kromatogrammene for veikryssene E
5 med E
1a, E
2 og E
3. Legg merke til at 3 «endene av E
2 og E
3 deler høy sekvensidentitet.
(A) Identifiserte
REST
eksoner og deres 5′ /3 «SS eller slutter. Den UCSC gener sporet ble brukt til kort indikere kromosom plasseringen av
REST
genet locus, mens genomisk sekvens NG_029447 ble ansatt som en referanse for å klargjøre de nøyaktige posisjoner av eksoner. Store områder av resten protein (NP_005603) ble illustrert parallelt med den tilsvarende kodende region for derved å forutsi konsekvenser av AS i
REST
pre-mRNA på proteinnivået. De konstitutive og alternative eksoner, samt deres 5 «/3» SS eller slutt, er fargekodet som angitt. Merk at: 1) ekson N i figur 1 er omdøpt til N
3c her; 2) E
2k er en utvidelse av E
2a uten skjøting; og 3) E
5 og N4b faktisk ikke presentert i NG_029447. (B) Mønstre av
REST
pre-mRNA spleising og resulterende mRNA varianter. Antatte koding varianter er fargekodet (blå-no aminosyre forandring spådd, rød-avkortet protein) eller skygget (tap av ZFM-5). (C) Prediksjon av C-terminal avkortet REST proteiner for spesifikke mRNA varianter. De exon-ekson veikryss og premature stoppkodoner er understreket.
Omfattende AS av
REST
pre-mRNA
Ved å undersøke ovennevnte primater vev og cellelinjer , samt sammenkoblet tumor og tilstøtende normale vev fra kreftpasienter som er nevnt i det etterfølgende, vi avslørte et omfattende som of
REST
pre-mRNA. Som vist i figur 3A, foruten E
5 og tidligere rapportert ekson N (nå omdøpt til N
3c) identifiserte vi en annen 7 roman alternative eksoner (N
1, N
2a, N
2b, N
3a, N
3b, N
4a og N
4b), sammen med mange 5 «/3» SS og ender i det konstituerende eksoner E
2 og E
4. Uavhengig av den 5 «/3» ender i E
2 og E
4, minst 45 varianter (S1-S45) er dannet ved hjelp av forskjellige skjøtemønster, inkludert exon hoppe Alternative 5 «/3» SS, gjensidig eksklusjon og alternativ bruk av de første og siste exon (figur 3B). Sekvenser av de nye variantene har blitt deponert i GenBank med tildelte deponeringsnummer JX896957-JX896993 og KC117262-KC117266.
29 av de 45 spleisevarianter innebærer hel eller delvis hoppe av E
2 der oversettelse initierer, slik at de kan fungere som ncRNAs grunn av manglende translasjonsstartsetet (TSS), bortsett fra at flere varianter (S16, S19 og S28) hvis TSS ble bevart er prediktive for N-terminale, avkortede REST protein isoformene. Tilsvarende delvis eller fullstendig skipping av E
4, som ofte ledsaget av E
2 hopper og /eller E
5 inkludering, produserer mange ncRNAs eller koding mRNA predikerer avkortede REST protein isoformer. I kontrast, hopper av 84-bp E
3 (S4 og S34) fører ingen ramme skift, men tap av ZFM-5. Spesielt, varianter med intakt E
2 (eller i tillegg til E
3), etterfulgt av alternative eksoner (men ikke E
4) er forutsagt å kode C-terminale, avkortede REST-proteiner, hvorav 8 varianter med E
3 kode REST4 (S3 og S12) eller REST4-lignende (S2, S21, S31, S33, S39 og S41) proteiner med RD1 og ZFMs 1-5, mens en annen 4 varianter (S34, S39-S41) med E
3 hoppet kode REST1 med RD1 og ZFMs 1-4 (figur 3C)
de fleste av de 45 spleisevarianter blir uttrykt ved lave nivåer i en celletype /vev-spesifikk måte.; ble imidlertid minst en variant observert i alle de testede vev og cellelinjer (figur 1, 2 og Figur S3).
Link mellom
REST
pre-mRNA spleising og kreft
Vi sammenlignet ekspresjonen av spesifikke spleise mønstre og varianter mellom paret tumor (T) og tilstøtende normal (N) vev fra 27 pasienter med nyre (Ki), lever (LI) og lunge (Lu) kreft (9 parene for hvert kreft, tabell 1) ved nestet PCR og QRT-PCR-analyser, med en vekt på E
2 /E
3 hopper og alternativ bruk av de første og siste exon. QRT-PCR-analyser ble utformet rettet mot bestemte exon-ekson veikryss (Figur 4A), og uttrykk endringer av spesifikke spleising mellom T og N er vist i folder (t over N) for hvert fag (figur 4B). Med unntak av E
1a /E
3 og E
1a /E
4 som representerer S5 og S6 varianter, henholdsvis de ekson-ekson veikryss representerer ikke nødvendigvis en enkelt spesifikt spleisevariant , som imidlertid kan påvises ved nestede PCR (figur 4C). Følgelig ble både QRT-PCR og nestet PCR-analyser tatt i betraktning ved sammenligning av
REST
pre-mRNA spleising profil mellom sammenkoblede T og N vev. Mens den brede uttrykk for E
2 /E
3 hopper og E
5 inkludering i menneskelig ble ytterligere validert, fant vi at alle de 27 pasientene uten unntak viste differensial uttrykk for mange
REST
spleisevarianter som følge av bestemte spleisemønsteret mellom paret T og N vev, med en slående vev-type og individuell forskjell.
(A) Strategi for konstruksjon av QRT-PCR-analyse for bestemte exon-ekson veikryss. (B) Expression endringer (t over N, i folden) av spesifikke exon-ekson veikryss analysert ved QRT-PCR-analyse; (C) Uttrykk for spesifikk
REST
spleisevarianter oppdaget av nestet PCR. Den forover og bakover primere er angitt med høyre og venstre pilene, henholdsvis. Sammenkoblet T og N vev ble samlet fra 27 pasienter med nyre (Ki), lever (LI) og lunge (Lu), og den grunnleggende diagnose vist i tabell 1 ble kort gitt som dens innledende 3 bokstaver for hver pasient. Expression endringer (T løpet N, i folden) av spesifikke varianter eller spleising (f.eks exon-ekson veikryss) ble analysert ved QRT-PCR og beregnes av 2
-ΔΔCt tilnærming ved hjelp av E
2 som referanse. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. QRT-PCR-analysen er ikke oppnåelig for E
3 hopper bare (dvs. E
2 /E
4-krysset), men åpenbare endringene kan observeres mellom T og N vev for de fleste fag ved nestet PCR der E
2F
1 /E
4R
en primer sett.
Som vist i figur 4B og 4C, varianter med E
2 /E
3 hoppet ble uttrykt forskjellig mellom sammenkoblede T og N vev for de fleste pasienter. Varianter bruker E
4 som siste ekson, S6 (både E
2 og E
3 hoppet) viste påfallende differensial uttrykk for alle pasienter unntatt Lu # 4 og 7. Spesielt, 7, 5 og 1 pasienter med nyre-, lever- og lungecancer, henholdsvis, viste økt ekspresjon S6, mens 2, 4 og 6 pasienter med nyre-, lever- og lungecancer, henholdsvis, utviste redusert S6 uttrykk. Selv QRT-PCR-analyse for E
3 bare hoppe (dvs. E
2 /E
4-krysset) er ikke oppnåelig, nestet PCR med E
2F
1 /E
4R
1 viste tilsynelatende forskjells uttrykk for S4 mellom paret T og N for en del av pasientene. I mellomtiden, differensial uttrykk for E
2-hoppet varianter S5 og S15 mellom paret T og N fra enkelte pasienter ble vist med henholdsvis QRT-PCR og nestet PCR,. Dessuten, noen andre varianter (f.eks S14, S16 og S17) med E
1b som det første ekson og E
2 delvis hoppet ble uttrykt forskjellig mellom paret T og N for noen pasienter. For eksempel ble S14 og S16 bare observert i T vev hos 4 pasienter (Ki # 5, 6 for S14 og Ki # 4, # 9 Lu for S16, henholdsvis). Likeledes varianter som bruker E
5 som siste ekson, S34 (E
3 hoppet), S35 (E
2 hoppet over) og S38 (begge E
2 og E
3 hoppet ) viste tilsynelatende forskjells uttrykk mellom paret T og N som indikert av nestede PCR med E
1AF
1 /E
5R
1 og E
2F
1 /E
5R
1. Følgelig E
2 /E
3 (spesielt E
3) hopper er generelt, men forskjellig knyttet til ulike typer kreft med slående celle-type /vev og individuelle forskjeller.
Som vist i figur 4C, med unntak av 3 pasienter (Li # 5, 6 og Lu # 6) uten detekterbar ekspresjon av E
5 inkludering, alle andre pasienter viste differensial ekspresjon av E
5-inkludert varianter mellom paret T og N vev. Spesielt uttrykk for S33 /S39 uten E
2 /E
3 hopper ble vunnet og tapt i T vev av 6 (Ki # 2, 9, Li # 1, 3, 7 og Lu # 3) og 4 (Ki # 1, 4, 7, 8 og Lu # 1) pasienter, henholdsvis. Spesielt, nestet PCR med E
2F
1 /E
5R
1 viste at alle 9 nyrekreftpasienter uttrykt E
5 i sine N vev, av dem tre (Ki # 1, 7, 8) mistet E
5 uttrykk i deres t vev. I motsetning til alle 9 pasienter med leverkreft viste ingen E
5 ekspresjon i deres N vev, og av dem, 4 (Li # 1, 2, 3, 7) fikk E
5 ekspresjon i deres t vev. Differensial uttrykk for E
5-inkludert varianter mellom sammenkoblede T og N vev vist ved nestet PCR ble støttet av QRT-PCR analyse av E
3 /E
5 veikryss (figur 4B).
i tillegg er den varianten som benytter S18 E
1c som den første ekson ble uttrykt forskjellig mellom sammenkoblede T og N vev for de fleste (22/27) pasienter, med 12 og 10 pasienter som viser økt og redusert ekspresjon hhv (Figur 4B og 4C). I mellomtiden, QRT-PCR-analyse indikerte at variantene S1 og S11 som bruker E
1a og E
1b som det første ekson henholdsvis viste mer enn to-fold uttrykk endringer mellom sammenkoblede T og N vev for noen pasienter (Figur 4B).
