Abstract
Aktivering av PI3K /AKT signalveien er en kjent pådriver for progresjon til kastrering-tilbakevendende prostatakreft (CR-cap), som utgjør den store dødelige fenotype av Cap. Her identifiserer vi bruker en genomisk shRNA skjermen PI3K /AKT-inaktive nedstrøms målet, FOXO4, som en potensiell cap metastase lyddemper. FOXO4 protein nivåer inverst korrelert med invasiv potensialet i et panel av menneskelige Cap cellelinjer, med redusert mRNA nivåer korrelerer med økt forekomst av klinisk metastase. Knockdown (KD) av FOXO4 i menneskelige LNCaP celler fører til økt invasjon
in vitro Hotell og lymfeknute (LN) metastaser
in vivo
uten å påvirke indekser for spredning eller apoptose. Økt Matrigel invasivitet ble funnet av KD av FOXO1 men ikke FOXO3. Sammenligning av forskjellig uttrykte gener påvirkes av FOXO4-KD i LNCaP celler i kultur, i primærsvulster og i LN metastaser identifisert et panel av oppregulert gener, inkludert PIP, CAMK2N1, PLA2G16 og PGC, som, hvis slått ned av siRNA, kan redusere økt invasivitet forbundet med FOXO4 mangel. Selv om bare noen av disse genene koder FOXO promoter bindingsseter, de er alle RUNX2-induserbar, og RUNX2 binding til PIP arrangøren er økt i FOXO4-KD celler. Faktisk, den tvungne uttrykk for FOXO4 reverseres økt invasivitet av LNCaP /shFOXO4 celler; tvungen uttrykk for FOXO4 endret ikke RUNX2 protein nivåer, men det sank RUNX2 binding til PIP promoter, noe som resulterer i PIP downregulation. Til slutt var det en sammenheng mellom FOXO4, men ikke FOXO1 eller FOXO3, downregulation og redusert metastase overlevelse i humane Cap pasienter. Våre data antyder sterkt at økt PI3K /AKT-mediert metastatisk invasivitet i Cap er assosiert med FOXO4 tap, og at mekanismer for å indusere FOXO4 re-uttrykk kan undertrykke Cap metastatisk aggressivitet
Citation. Su B, Gao L, Baranowski C, Gillard B, Wang J, Ransom R, et al. (2014) En Genome-Wide RNAi Screen Identifiserer FOXO4 som en metastaser-lyddemper gjennom bekjempelse PI3K /AKT Signal Pathway i prostatakreft. PLoS ONE 9 (7): e101411. doi: 10,1371 /journal.pone.0101411
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 14 april 2014; Godkjent: 05.06.2014; Publisert: 01.07.2014
Copyright: © 2014 Su et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Microarray data er avsatt til Gene Expression Omnibus under tilgjengelighetsnummeret GSE58403
Finansiering:. IHG ble støttet av Department of Defense, (www.army.mil) gir PC040256 og PC061246, National Cancer Institute (www.cancer .gov) gi CA94108 (IHG), og National Cancer Center Support Grant 2P30 CA016056. BS ble støttet av National Natural Science Foundation of China No. 81272380. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Prostatakreft (CAP) er fortsatt den mest diagnostisert ikke-hud kreft og den nest største årsaken til kreftdød i amerikanske menn [1]. Den innledende fasen av CAP er regulert av androgen, og dermed har androgen deprivasjon terapi vært bærebjelken i terapi for progressiv prostatakreft. De fleste pasientene uunngåelig mislykkes denne behandlingen, går videre til kastrering-tilbakevendende prostatakreft (CR-cap) vanligvis presenterer som bein eller lymfeknutemetastaser som vekst avhenger av vedvarende androgen reseptor (AR) signaliserte [2]. Faktisk har målretting av CR-cap med mer spesifikke anti-androgener eller AR antagonister tilbudt betydelig, men forbigående, klinisk effekt og motstand innebærer fortsatt AR avhengighet, riktignok involverer AR mutanter eller overekspresjon [3] – [5].
Aktivering av phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /AKT veien er en stor bidragsyter til Cap progresjon [6], [7] i at 42% av primær Cap lesjoner og 100% av metastatiske svulster utstillingen endringer (mutasjoner /slettinger, kopiere nummer variasjoner, differensial genuttrykk) i en eller flere komponenter [8]. Dette har ført til flere kliniske studier rettet mot PI3K, AKT eller TORC1 i kombinasjon med standard kjemoterapi (taxaner, Platins) eller antagonister androgen aksen eller AR [6]. Faktisk er tilstrekkelig prostata-spesifikt tap av PI3K /AKT antagonist, PTEN, i musetransgene modeller for å indusere intraepitelial neoplasi [9], [10].
FOXO familiemedlemmer, FOXO1, FOXO3a og FOXO4 er ubikvitært uttrykt transkripsjonsfaktorer som virker som tumor-suppressor-proteiner via deres evne til å undertrykke ekspresjon av gener som koder for proliferativ, overlevelse eller anti-differensieringsfunksjoner [11], [12]. Roller for FOXO medlemmer i undertrykke prostata kreft progresjon er beskrevet. For eksempel er FOXO1 delesjon i 13q14 forbundet med androgen- og AR-uavhengig spredning [13]. AKT, hvis virksomhet øker i Cap progresjon [7], phosphorylates direkte FOXO familiemedlemmer, og dermed motvirke deres funksjon ved å fremme samarbeid med 14-3-3 proteiner og hindre deres kjernefysisk trans [14], som fører til deres ubiquitylation-mediert proteasome degradering [ ,,,0],15]. Tapet av FOXO3a fremmer kreft formasjon i TRAMP prostatakreft musemodell [16], mens oppregulering eller aktivering av FOXO proteiner fører til vekst og apoptose [17] – [19]. En studie av Zhang et al. [20] viser at FOXO1 hemmer Cap cellemotilitet og invasivitet ved å hindre RUNX2 fra binding til og transcriptionally aktivere progresjon gener som
OP, IL8, VEGF Hotell og
MMP13
. Selv om noen overflødige roller for FOXO proteiner er implisert av funn at spontane thymus lymfomer og systemiske hemangiomer blir indusert bare på den kombinerte sletting av FOXO1, FOXO3 og FOXO4 [21], er det bevis fra kromatin immunoprecipitation-sekvensering (Chip-seq) studier på FOXO1 og FOXO3a av både vanlige og ikke-overlappende genet målene [22], [23]. For prostatakreft progresjon, felles eller forskjellige roller for FOXO proteiner fortsatt uklare.
For å identifisere gener som motvirker Cap metastaser, menneske LNCaP celler, som viser svak invasivitet, ble smittet med et lentivirus-kodet genomisk shRNA bibliotek og deretter valgt for svært invasive celler i en Matrigel belagt Boyden kammeret analysen. Våre data antyder sterkt at FOXO4 undertrykker metastatisk invasivitet ved å hindre RUNX2 fra å aktivere en gruppe av pro-metastatiske gener inkludert
PIP, PGC, CAMK2N1 Hotell og
PLA2G16
. Oppdagelsen av at FOXO4 downregulation korrelerer med tidligere debut metastatisk sykdom i Cap pasienter tyder på at CAP metastase kan motvirkes ved å aktivere FOXO4 uttrykk eller ved å hemme RUNX2 funksjon.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
følgende primære antistoffer (AB) ble brukt: kanin polyclonals spesifikk for FOXO1, FOXO3, FOXO4, kløyvde caspase-3, GFP (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); muse monoklonale antistoffer (mAb) inkluderer HA, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Myc (Applied biologisk materiale, Richmond, BC, Canada), og Ki67 (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL).
Cellekultur kultur~~POS=TRUNC
LnCap (ATCC CRL-1740) og CWR22Rv1 (ATCC CRL 2505) celler ble dyrket i RPMI 1640 media supplert med 10% FBS og inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2. DU145 (ATCC HTB-81) og HEK293T (ATCC CRL-3216) celler ble dyrket i DMEM media supplert med 10% FBS. LNCaP ble infisert med prøver av AVKODE (OpenBiosystems) sammenslåtte pGIPZ lentivirus bibliotek som koder for humant genomisk shRNAs (13.650 gener målrettet i 7 bassenger av 9750 shRNA kloner /basseng) på et mangfold-of-infeksjon av en (RPCI shRNA Core, Irwin Gelman, direktør), og deretter valgt for puromycin (2: g /ml) resistens. Puromycin-resistente celler infisert med tom pGIPZ alene tjente som en negativ kontroll.
siRNA transfeksjon
Syntetisk ON-TARGETplus SMARTpool siRNA spesifikk for FOXO4, FOXO1 og FOXO3, siCONTROL nonsilence siRNA (NS-siRNA ), og DHarmaFECT-en transfeksjon reagens ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO). LNCaP-celler ble sådd ut ved like tettheter i 6-brønners plater (5 x 10
4 per brønn) over natten. Cellene ble transfektert med 50 nM av NS-siRNA eller FOXO spesifikke siRNA i 24 timer ved hjelp DharmaFECT1 følgende produsentens protokoll.
MTS cellevekst analysen
Spredning av LNCaP-celler som stabilt infisert med pGIPZ -FOXO4 shRNA eller pGIPZ-NS-shRNA eller transient transfektert med FOXO4- eller NS-siRNA ble evaluert med MTS analysen (Promega, Madison, WI) etter produsentens protokoll. MTS-metoden måler restaureringen av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) til formazan av metabolsk aktive celler.
Immunoblot (IB) analyse
Cellene ble lysert i RIPA-buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 8% glycerol, 1% Triton X-100, 0,1 % SDS, 0,5% natrium deoxycholate, 10 mM Na
3VO4, 1 mM NaF, Komplett proteasehemmer Cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland)). 40 ug totalt protein /prøve ble separert ved SDS-PAGE, blottet på polyvinyliden-fluorid-membraner som ble blokkert i 30 minutter med 5% bovint serumalbumin (Sigma) i 1 x TBS /T (0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann ) og deretter probet som angitt. Digital bildebehandling og signal kvantifisering ble utført på en Chemi-Genius
2 Bio-Imager (Syngene, Frederick, MD) ved hjelp GeneTools programvare.
Transient transfeksjon
pFOXO4-GFP eller pFOXO4- TM-GFP, med Ala erstatninger i alle tre AKT fosforyleringsseter (vennlig levert av Stefanie Dimmeler, Universitetet Frankfurt, Tyskland) ble transient transfektert inn CWR22Rv1. Myc-wtFOXO4 plasmid (vennlig levert av Zhiping Liu, UT Southwestern Medical Center) var co-transfektert transient med pEGFP DNA (Clontech /Takara, Mountain, CA) i CWR22Rv1 celler ved hjelp Lipofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens anbefalinger, og deretter inkubert i 40 timer. GFP positive celler ble scoret for invasjon og
in situ
zymografi. For CHIP-qPCR analyse, ble HEK293T celler transient transfektert med HA-RUNX2 (vennlig levert av Jianmin Zhang, Roswell Park Cancer Institute), HA-RUNX2 pluss Myc-FOXO4, eller tom vektor.
Invasion analyse og utvalg av invasive kloner
modifiserte Boyden kammer analyser ble utført som tidligere beskrevet [24] fra og med 5 x 10
4 celler /5-brønners format. Verdier for migrasjon ble oppnådd ved å telle minst 10 celler i 6 felt per membran (x20 objektiv) og i gjennomsnitt for tre uavhengige eksperimenter. Celler med økt Matrigel invasivitet ble isolert etter fire runder med påfølgende invasjon analyser. Nærmere bestemt ble invaderende celler (festet til bunnen av Transwell-membraner) fjernet ved trypsinering, slått sammen på grunnlag av shRNA moduler, sådd ut i 6-brønners skåler, og etter utvidelse, re-kastet invasjon analyser. Etter tre runder ble cellene belagt tynt i 10 cm retter, og etter spredning og koloni isolasjon, strekkoder var Sanger sekvensert (RPCI Genomics Shared Resource Core, Irwin Gelman-direktør) fra isolerte DNA ved hjelp flankerer PCR primerpar, F: 5 « – ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3 «og R: 5′-AAGCAGCGTATCCACATAGCGT-3′ eller ved hjelp av direkte sekvenseringsprimeren, 5»-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 «. LNCaP [vektor] eller LNCaP [shFOXO4] celler transient transfektert med 1: g hver av pGIPZ lentivirus shRNA kloner (GFP-uttrykke) spesifikke for PIP (tiltredelse # NM_002652.2, kloner V2LHS170040 og V2LHS170041), CAMK2N1 (tiltredelse # NM_018584.5 , kloner V2HS176164, V2HS176163, V2HS176165), PLA2G16 (tiltredelse # NM_007069.3, clonesV2LHS_253144, V2HS199589), PGC (tiltredelse # NM_002630.3, klone V2LHS169912) eller RUNX2 (tiltredelse # NM_004348, kloner V2LHS3151, V2LHS15062, V2LHS15065, V2LHS15066, V2LHS223856 , V2LHS 224 628), eller tom pGIPZ vektor kontroll (OpenBiosystems) ble vurdert for invasiv potensial.
In situ
zymografi
dekkglass ble belagt med 0,2 mg /ml Oregon grønn 488-konjugert gelatin, tverrbundet i 0,5% glutaraldehyd i 15 minutter ved 4 ° C, og inkubert med 5 mg /ml NaBH
4 i 3 min. Objektglassene ble deretter desinfisert med 70% EtOH i 15 min og vasket i serumfritt medium i 1 time ved 37 ° C. Cellene ble sådd ut på belagte dekkglass, og inkubert ved 37 ° C i 24 timer, fiksert i 10 minutter med is-kald 60% aceton /3,7% paraformaldehyd i PBS, blokkert med 3% ikke-fettholdig tørrmelk i PBS i 30 min ved RT. Myc-FOXO4 ble farget med muse anti-myc (1:500), og kjerner ble farvet med DAPI (Invitrogen, 1:500), etterfulgt av FITC-konjugert geite-anti-mus IgG (1:500; Chemicon, Temecula, CA ). Fluorescent bildene ble tatt med et Nikon TE2000-E invertert mikroskop utstyrt med Roper CoolSnap HQ CCD kamera. Invasivitet ble kvantifisert ved å måle gjennomsnittlig tap av FITC-gelatin området i tre eksemplarer lysbilder
ortotopiske metastase modell
ortotopiske prostata injeksjoner i rygg fliker av 10
6 celler i 50:. L PBS i hann nakne mus innleiret i flankene med testosteron pellets ble utført som tidligere beskrevet [25]. Etter 10 uker, ble musene avlivet og sjekket for GFP fluorescens (Lightools Research, Encinitas, CA) i primærsvulster og i perifere organer. Alle dyreforsøk ble gjort under tilsyn av Institutional Animal Care og bruk komité Roswell Park Cancer Institute i henhold til godkjent protokoll 1177M. Anestesi ble inhalert Halotan til effekt. Eutanasi ble utført av CO2 kvelning fulgt ved halshugging.
Immunohistochemistry (IHC)
Vev ble fiksert i 10% bufret formalin i 24 timer før behandlingen. Faste vev ble dyppet i parafin og seksjonert ved 5: m. Slides ble de-parafin i xylener og deretter rehydrert i graderte alkoholer fulgt av DDH
2o. Platene ble inkubert i 1 x pH 6 citratbuffer (Invitrogen cat # 00-5000) i 20 min og deretter i 3% H
2o
2 i 15 min. Platene ble blokkert med 10% normalt geiteserum i 30 minutter, fulgt av avidin /biotin-blokk (Vector Labs Cat # SP-2001). Primære Abs til Ki67 (1:500), GFP (1:50) eller caspase 3 (1:200) ble fortynnet i 1% BSA-oppløsning og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur (RT), etterfulgt av inkubering med biotinylert geite-anti -kanin sekundær Ab (Cell Signa Cat # 9661) i 15 min. For signalforsterkning, ble ABC reagens (Vector Labs Cat #PK 6100) søkt om 30 min, etterfulgt av inkubasjon med DAB substrat (Dako Cat # K3467) i 5 minutter og kontra med modifisert Harris Hematoxylin (Richard-Allan Scientific Cat # 72704) til 20 sek. Lysbilder ble vasket grundig i PBS, forseglet med dekk og skannet i en Aperio ScanScope CS, ved hjelp ImageScope programvare (Aperios Technologies, Inc., Vista, CA).
Gene uttrykk rekke
Total RNA ble fremstilt ved bruk Trizol (Invitrogen) etter produsentens instruksjoner fra seks prøver: LNCaP [shFOXO4] cellelinje, LNCaP [pGIPZ kontroll] cellelinje, LNCaP [shFOXO4] primærtumor, LNCaP [pGIPZ kontroll] primærtumor, LNCaP [shFOXO4] lymfeknute metastase og LNCaP [pGIPZ kontroll] lymfeknutemetastase. RNA prøver ble kvantifisert ved hjelp av et ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific /Nanodrop) og evaluert for nedbrytning ved hjelp av en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Prøver med RNA Integrity Value (RIN) 7 ble behandlet for genekspresjon rekke analyse ved hjelp av Human HT-12 hel-genom genekspresjon beadchip array (v4) (Illumina, San Diego, California). 500 ng av total RNA ble konvertert til cDNA, etterfulgt av
in vitro
transkripsjon å generere biotin merket cRNA bruker Ambion Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (ambion /Life Technologies, Grand Island, New York) i henhold til produsentens anvisninger. 750 ng av de merkede prober ble deretter blandet med hybridiserings-reagenser og hybridisert over natten ved 58 ° C til HT-12v4 BeadChips. Etter vask og farging med Cy3-streptavidin konjugat ble BeadChips avbildes med en Illumina iscan Reader for å måle fluorescens intensitet på hver sonde. Intensiteten av signalet som svarer til mengden av den respektive mRNA i den opprinnelige prøven. BeadChip datafiler ble analysert med GenomeStudio (v2011.1; Illumina) genuttrykk modul (v1.9.0) rapportere både un-normaliserte og quantile normalisert, bakgrunnskorrigerte genuttrykk signalnivåer. Genuttrykket signalnivåer ble deretter analysert ved hjelp av Bioconductor pakker Lumi og Limma programmer (https://www.bioconductor.org). Gener med . Ble identifisert to gangers uttrykk endringer
kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR)
Totalt RNA (1 pg /reaksjon) isolert ved anvendelse av Trizol reagens ble utsatt for revers transkripsjon reaksjoner med tilfeldige heksamerprimere bruker High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies /Applied Biosystems). QRT-PCR ble utført på en 7900HT Sequence Detection system (Life Technologies /Applied Biosystems) med Faststart Universal SYBR Grønn Master kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) etter produsentens anvisninger. Primersekvensene (Tabell S2) ble utformet ved hjelp Primer -BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). GAPDH ble anvendt som en husholdningsgenet for QRT-PCR-reaksjoner. Hver test ble gjort i trippel replikering og 2
-ΔΔCt metoden [26] ble brukt til å beregne uttrykket av gener.
Co-immunoprecipitation (Co-IP) av FOXO4 og RUNX2
HEK293T-celler ble ko-transfektert med Myc-FOXO4 pluss HA-RUNX2, HA-RUNX2 alene eller tom vektor alene. Etter 48 timer ble cellene lysert i RIPA-buffer og IP ble utført ved å bruke HA Ab, etterfulgt av IB med den angitte Ab, eller IP ble utført ved anvendelse av Myc Ab, etterfulgt av IB
Chromatin Immunoutfelling (chip). – qPCR
brikke analyser ble utført som tidligere beskrevet (9) med mindre modifikasjoner. I korthet, LNCaP og HEK93T celler dyrket i 10-cm skåler (80-90% konfluens) ble tverrbundet ved tilsetning av 10% formaldehyd til kulturmedier for 6-7 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av tilsetning av glycin til 125 mM. Kromatin ble sonikert for å gi 100-300 bp-fragmenter i SDS-lysebuffer (0,1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2% NP-40, 0,5% deoksykolat, pH 8,1) inneholdende 1 mM fenylmetansulfonyl fluor og proteasehemmer blanding. (Roche Applied Science) Ved å følge pre-clearing med protein A /G magnetiske kuler (Millipore), kromatin ble inkubert over natten ved 4 ° C med 5 ug av følgende Ab som angitt: HA, RUNX2, eller normal mus IgG. Immunkomplekser ble revet med protein A /G magnetiske kuler. Tverrbindinger for både chip og inngangs DNA ble reversert ved 65 ° C i 5 timer og proteiner ble fordøyd med proteinase K, og DNA ble utvunnet ved fenol /kloroform-ekstraksjon og etanolfelling med 20 ug glykogen som bærer som beskrevet [27]. Utfelt fragmenter ble kvantifisert ved qPCR, og prosentinngangsverdier ble korrigert for negative kontroll regioner der det er angitt. Primere for PCR amplifikasjon av PIP som tidligere beskrevet [28].
Statistiske analyser
statistiske betydninger mellom gruppene ble bestemt av tosidige t-test, med feilfelt betegner S.E.M. En p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Et genom-wide shRNA skjermen for å identifisere kandidat metastase suppressor gener
For å forstå de genetiske komponenter. nødvendig for metastase, anvendte vi en high throughput screening shRNA tilnærming for å identifisere gener som kan undertrykke Matrigel invasivitet, en parameter for den metastatisk kaskade [29]. LNCaP-celler, som oppviser lav invasiv potensiell [30], ble infisert med moduler av pGIPZ (GFP-uttrykkende) lentiviruses koding moduler av humane genomiske shRNAs ved en MOI = 0,7 (for å minimalisere celler transdusert med flere shRNAs), og etter valg for puromycin motstand, cellene ble utsatt for triplikate Matrigel Boyden kammer invasjons analyser. Invaderende celler (fester seg til bunnen av transwells membranene) ble fjernet ved trypsinering, slått sammen mellom tre paralleller, ekspandert i kultur og deretter utsatt for ytterligere to runder med lignende invasjons analyser. LNCaP infisert med tom pGIPZ (LNCaP [vektor] celler) ble kjørt parallelt for å vurdere eventuelle utvalg av spontan økning i invasivitet (Fig. 1a). Vi antok at celler med økende invasivitet som følge av tapet av en suppressor funksjon ville bli beriket med påfølgende analyse runder. Etter tre sykluser med seleksjon ble kolonier isolert fra modulene 2, 3, 6 og 7, som viste økt invasivitet i forhold til den runde 3 nivået av LNCaP [vektoren] kontroller (fig. 1B). Sekvensanalyse (strekkode og shRNA sekvens) og BLAST databank søking (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) identifisert flere kloner av gaffelhodeboks O4 (
FOXO4
), kinesin familiemedlem 3B (
KIF3B
), signaloverførende adapter molekyl (SH3 domene og ITAM motiv) 1 (
STAM
), og Homo sapiens oppløst stoff carrier familie 17 (
SLC17A4
) (tabell S1), sammen representerer 94% av alle klonene sekvensert. Gitt den økende forståelse for roller for FOXO proteiner som negative regulatorer av kreft progresjon [31], [32], og en fersk undersøkelse viser at oppregulering av ANXA8 av FOXO4 hemmer celle trekkende og metastatiske egenskaper ved kolangiokarsinom celler [33], vi fokusert på den mulige rollen FOXO4 som en potensiell metastase lyddemper.
A. Skjematisk oppsummering av skjermen. A high-throughput screening shRNA tilnærmingen ble anvendt for å identifisere gener hvis knockdown indusert tumor invasjon, en fremgangsmåte vesentlig for metastasering. Meget invasive varianter av LNCaP ble valgt ved hjelp av Matrigel-belagte Boyden kammer invasjon analyser. B. Økt invasivitet indusert av bassenger av shRNA kloner over 3 runder av utvalget.
Øvre panel
: representative bilder av invasive GFP-uttrykke celler fra kontroll (pGIPZ vektor) eller shRNA (delmengde # 2) etter tre valgrunder.
Nedre panel
. Invasiv potensialet sammenslåtte celler i hver av 7 infeksjon moduler over tre valgrunder, sammenlignet med LNCaP [vektor] celler
nedregulering av FOXO4 i menneskets metastatisk Cap cellelinjer og metastatisk vev
for å teste om FOXO4 genekspresjon korrelerer med Cap celle invasivitet, vi først sammenlignet FOXO4 protein uttrykk i et panel av Cap cellelinjer med ulike invasive og metastatiske potensialer. Det var en invers korrelasjon mellom Matrigel invasivitet og FOXO4 proteinnivåer (Fig. 2A), særlig når man sammenligner LNCaP til to metastatiske varianter, LN3 og c4-2. Et søk på Oncomine database (https://www.oncomine.org) viste at FOXO4 var signifikant nedregulert i metastatisk Cap forhold til primær-site kreft og /eller normale prøver fra to individuelle studier (Fig 2B). Videre analyse av metastatisk Cap saker fra studiet av Taylor et al. [8] i
cbio
hjemmeside (https://www.cbioportal.org/public-portal/) viste at de med FOXO4 downregulation korrelert med en raskere utseende metastaser sammenlignet med de uten endrede FOXO4 ekspresjon (fig. 2C). Det var ingen tegn korrelere FOXO4 downregulation i brystkreft metastaser selv om det var en liten downregulation i tykktarm kreft metastase (Fig. S1), noe som tyder på at alle mulige metastase suppressor funksjon ved FOXO4 ville være vev-type spesifikke. FOXO1 nivåer ble også nedregulert i Cap metastaser (Fig. S2A), men vi kunne ikke finne ut om FOXO1 tap korrelert med økt metastaser i Cap pasienter (Fig. S2B) på grunn av underpowering grunnet lav pasientnummer. I kontrast, FOXO3 uttrykk nivåer viste ingen sammenheng med Cap metastaser (figurene S2C . D).
A. IB analyse av FOXO4 uttrykk i menneske Cap cellelinjer (
øvre panel
), kvantifisert og sammenlignet med relativ Matrigel invasivitet i
nedre panel
. Feilfelt, SE av tre uavhengige IB analyser kvantifisert ved densitometri (for FOXO4 nivåer) eller Matrigel invasjonen analyser. Den relative FOXO4 nivå i DU145 ble satt til en verdi = 1 (stiplet linje). B. Oncomine studerer FOXO4 RNA uttrykk nivåer i BPH, primære stedet (1 °) cap eller metastaser (mets) fra Latulippe et al. [45] og Yu et al. [46]. C. Kaplan-Meier plott analyse (https://www.cbioportal.org/public-portal/) av metastase forekomst vs. time-to-utbruddet i 37 Cap metastase saker fra Taylor et al. [8] der 12 tilfeller (32%) som vises FOXO4 nedregulering og korrelert med en mer hurtig opptreden av metastaser sammenlignet med de 25 tilfeller som viste ingen endringer i FOXO4 ekspresjonsnivåer.
FOXO4 tap i LNCaP Cap celler bidrar til høyt metastatisk potensial
for å finne ut om nedregulering av FOXO4 bidratt til økt invasiv kapasitet på LNCaP celler, ble LNCaP celler stabilt transduced med lentivirus FOXO4 shRNA kloner, forskjellig fra den som er identifisert i den opprinnelige skjermen, eller transfektert med siFOXO4, og disse cellene, vs. vektor eller kryptert (SCR) siRNA kontroller, ble testet for invasivitet. Knockdown av FOXO4 ved SH- eller siFOXO4 resulterte i 2,5 til 4-dobbelte økninger i LNCaP invasivitet (Fig. 3A). Motsatt CWR22Rv1 celler forbigående transfektert med pEGFP pluss enten wt-FOXO4 eller et konstitutivt aktiv FOXO4 mutant (TM, for «triple mutant», i.e.- tap av alle tre AKT fosforyleringsseter) resulterte i redusert invasivitet (Fig. 3B). Tap av FOXO4 fra shRNA eller siRNA hadde ingen effekt på LNCaP sprednings priser i 2D kulturer (Fig. S3A) tyder på at økt invasjon nivåer etter FOXO4 var ikke på grunn av endringer i sprednings priser. I tillegg analyserte vi hvordan FOXO4 styrer invasivitet av Cap celler seeded på Oregon Grønn 488-merket gelatin-belagt dekkglass. FOXO4 knockdown i LNCaP resultert i økt lokal fordøyelsen av Oregon Grønn 488-merket gelatin ekstracellulære matrise i forhold til celler som uttrykker ikke-spesifikk shRNA (Fig. 3C) mens overekspresjon av Myc-FOXO4 i CWR22Rv1 cellene redusert lokaliserte fordøyelsen (Fig. 3D).
A. LNCaP celler stabilt transduced med shRNA eller forbigående transfektert med siRNA mot FOXO4 (vs egge kontroll) ble testet for invasivitet. FOXO4 knockdown ble vurdert ved IB (
øvre panel
) og dens effekt på Matrigel invasivitet ble kvantifisert (
nedre panel
). Feil barer, S.E. av triplikate eksperimenter. *, P 0,01. B. Ektopisk uttrykk for WT eller konstitutivt aktiv (TM) FOXO4 reduserer CWR22Rv1 invasivitet. Ektopisk FOXO4 ble vurdert ved IB (
øvre panel
) og dens effekt på Matrigel invasivitet ble kvantifisert (
nedre panel
). Feil barer, S.E. av triplikate eksperimenter. *, P 0,01. C. Den lokale invasivitet av LNCaP [vektor] (
øverste rad
) vs. LNCaP [shFOXO4] (
nedre rad) ble vurdert for celler seeded på Oregon Grønn 488-merket gelatin, med celler merket med DAPI. D. Det samme analyse som i C bortsett sammenligne CWR22Rv1 stabilt uttrykker vektor eller Myc-FOXO4. E. lunge, lever, nyre og LN fra individuelle mus tumorer med LNCaP [vektor] (kontroll) eller LNCaP [shFOXO4] ble fotografert ved hjelp av synlig lys (
øvre panel
) eller fluorescerende lys (
nedre panel
). Piler, LN og nyremetastaser. F. metastatisk LN lesjoner fra en LNCaP [shFOXO4] tumorer mus farget for H E eller GFP (ved IHC). Trekanter, eksempler på GFP-positive metastatiske celler.
Gitt at FOXO familiemedlemmer dele noen overflødige funksjoner [31], vi analysert FOXO1 og FOXO3 nivåer i Cap celler og testet deres evne til å kontrollere invasivitet. I motsetning til FOXO4, FOXO1 og FOXO3 nivåer syntes å øke i de mer invasive varianter av LNCaP og PC-3 celler (figur S4A og amp;. B). Interessant, knockdown av FOXO1, men ikke FOXO3, i LNCaP celler indusert høyere invasivitet (Fig. S4C), men den tvungne uttrykk for enten FOXO1 eller FOXO3 unnlatt å redusere invasivitet av CWR22Rv1 celler (Fig. S4D). Dermed, mens FOXO1 kan være involvert med LNCaP invasivitet, er FOXO4 begge involvert med og tilstrekkelig for kontroll av invasivitet.
Vi testet om FOXO4 knockdown kunne fremme spontane metastaser
in vivo
. Hann nakne mus med innebygde tids frigivelse av testosteron pellets ble injisert i sine dorsal lober med LNCaP [vektoren] eller LnCap [shFOXO4]-celler, og etter ti uker ble musene avlivet og analysert for GFP fluorescens som en markør for pGIPZ. Selv om LnCap [shFOXO4] primær-språk tumorer de var noe mindre enn de som fremkalles av LNCaP [vektor] celler, denne forskjellen ikke var statistisk signifikant (fig. S3b). Viktigere var det ingen forskjell i deres relative GFP ekspresjon (Fig S3C.), Eller deres sprednings eller apoptose priser
in vivo sammenligning basert på Ki67 eller spaltet caspase-3 IHC-farging (fig S3D . E, respektivt) . FOXO4 knockdown resulterte i økt forekomst av GFP-uttrykkende macrometastases til lokale drenerende lymfeknuter (LN), nyre (fig. S3E) og lunge sammenlignet med kontrollceller (tabell 1). Nærmere bestemt, 82% (9/11) av den shFOXO4 gruppen hadde LN metastaser, sammenlignet med 31% (5/16) for kontrollgruppen; 27% (3/11) og 9,1% (1/11) i det shFOXO4 gruppen hadde nyre- og lungemetastaser, henholdsvis, mens metastaser ble funnet i stykke (0/16) for kontrollgruppen. I tillegg fikk vi bekreftet at LN lesjoner uttrykt GFP protein ved hjelp av GFP-spesifikke IHC (Fig. 3F).
Analyse av FOXO4-regulert pro-metastase gener
Gitt at FOXO proteiner fungere som transkripsjons repressors, utforsket vi om den økte invasive etter FOXO4 tap kan skyldes økningen i pro-metastaser genuttrykk. Dermed ble utført genom-wide genekspresjonsanalyser på LNCaP [vektor] vs. LNCaP [shFOXO4] dyrkede celler, primær-site svulster og LN metastaser. Knockdown av FOXO4 i hver av disse eksempelsettene ble bekreftet av IB (Fig. S5a). Denne analysen identifiserte 535 gener hvis uttrykk endres ≥1.5 ganger (fig. S5b). Av disse 54 endringene var felles for alle tre prøver settene (fig. 4A, Fig. S5C), og av disse ble 19 gener (15 oppregulert, 4 downregulated) forbundet med FOXO4 knockdown (Fig. 4B). For å fokusere vår analyse, analyserte vi ved oppfinnsomhet IPA programvare som i 19-genet signaturen var involvert i metastase-assosierte prosesser som celle motilitet, invasivitet, kjemotaksis eller celleoverlevelse. Åtte gener oppregulert i shFOXO4-forbundet LN metastaser (
PIP, CAMK2N1, PLA2G16, ALDH1L1, VCX, VCX3A, APP
, og
PGC
) ble identifisert som potensielt er involvert i metastase (Fig . 4C,
toppen
).
