Abstract
Betimelig karakterisering av kreft evolusjon er nødvendig for å forutsi behandlingseffekt og til oppdage motstand tidlig. Høyt innhold analyse av enkelt sirkulerende tumorceller (CTCs) muliggjør sekvensiell karakterisering av genotypiske, morfometriske og protein ekspresjon endringer i sann tid i løpet av kreftbehandling. Dette konseptet ble undersøkt hos en pasient med kastrering resistent prostatakreft utvikler seg gjennom både cellegift og målrettet terapi. I dette tilfellet studien, integrere vi over fire tidspunkter 41 genome-wide kopiantall variasjon (CNV) profiler pluss morfometriske parametere og androgen reseptor (AR) protein nivåer. Bemerkelsesverdig var liten endring observert i respons til standard kjemoterapi, gjenspeiles av det faktum at en unik klon (A), som oppviser høyt rearrangerte CNV profiler og AR + fenotypen ble funnet sirkulerende før og etter behandling. Men klinisk respons og påfølgende progresjon etter målrettet behandling var forbundet med den drastiske uttømming av klone A, etterfulgt av sekvensiell veksten av to distinkte CTC underpopulasjoner som avvek i både AR genotype og uttrykk fenotype. Mens Ar- celler med flat eller pseudo-diploid CNV profiler (klone B) ble identifisert på tidspunktet for svar, ble en ny svulst avstamning av AR + celler (klone C) med CNV endrede profiler registreres under tilbakefall. Vi viste at klone C, til tross for fylogenetisk relatert til klone A, besatt et unikt sett av somatiske CNV endringer, inkludert
MYC
forsterkning, en hendelse knyttet til hormonet flukt. Interessant, viste vi at begge kloner kjøpt
AR
genamplifikasjon ved å distribuere ulike evolusjonære veier. Samlet disse data viser tidsrammen for svulst evolusjon i respons på behandlingen og gir et rammeverk for multi-skala analyse av væske biopsier å kvantifisere og overvåke sykdomsutvikling hos enkelte pasienter
Citation. Dago AE, Stepansky A , Carlsson A, Luttgen M, Kendall J, Baslan T, et al. (2014) Rapid Fenotypisk og Genomisk endre seg i takt Therapeutic Trykk i Prostate Cancer inferred av høy innholdsanalyse av enkeltSirkulasjonstumorceller. PLoS ONE 9 (8): e101777. doi: 10,1371 /journal.pone.0101777
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 13 desember 2013; Godkjent: 11 juni 2014; Publisert: 01.08.2014
Copyright: © 2014 Dago et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Award Antall U54CA143906 fra National Cancer Institute. A. E. Dago er en mottaker av en PA-12-149- Forskning kosttilskudd for å fremme mangfold i helsefaglig forskning tildeles av National Cancer Institute (NCI). A. Carlsson er finansiert av det svenske Vetenskapsrådet, Dnr 2012-235. JH, JK, TB og MW ble støttet av en spesiell bevilgning fra Dr. Marilyn Simons for kreftforskning ved CSHL, en Breast Cancer Research Foundation stipend, og forskningsstøtte fra Skyline Genomics. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Dr. Asya Stepansky av Skyline Genomics hadde en betydelig rolle i utviklingen av protokollen for å isolere DNA fra HD-CTC celler og utført Illumina bibliotek forberedelsene. Skyline Genomics finansielt støttet Illumina sekvensering ved Cold Spring Harbor Genome anlegget som en demonstrasjon av sine evner som en fremtidig tjenesteleverandør. Selskapet hadde ikke en rolle i utformingen av eksperimenter eller tolkningen av dataene
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har konflikter å avsløre. Den HD-CTC analysen teknologi beskrevet her har blitt lisensiert til Epic Sciences. ML, AK, KB og PK har eierinteresser i Epic Sciences. AS er en ansatt i Skyline Genomics, og hadde en betydelig rolle i utviklingen av protokollen for å isolere DNA fra HD-CTC celler og utført Illumina bibliotek forberedelsene. AS hadde ikke noen rolle i utformingen av eksperimentene eller tolkningen av dataene. JH er en co-grunnlegger og aksjonær i silhuett genomikk. AED, AC, JK, TB, MW og MEG og har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
androgen-androgen reseptor (AR) signalveien er viktig for utvikling og progresjon av prostatakreft og er en viktig mål i en rekke terapeutiske midler [1]. I metastatisk prostatakreft (PCA), androgen deprivasjon terapi (ADT), utgjør gullstandarden behandling for å indusere tumor regresjon ved å undertrykke AR aktivering. Til tross for innledende respons på ADT, pasienter ofte utvikle resistens og fremgang til kastrering resistent prostatakreft (CRPC), en uhelbredelig sykdom med dårlig prognose. Disse pasientene blir ofte behandlet med berging hormon-rettet terapi, inkludert midler slik som ikke-steroide anti-androgener og androgen-syntesehemmere [1]. I å håndtere disse behandlingene, forutsi behandlingsrespons og identifisere tidlige indikatorer på terapi motstand er store utfordringer. Nivåene av prostata spesifikt antigen (PSA), et androgen regulert protein målt i serum, blir brukt til å overvåke terapeutiske respons i CRPC pasienter, men dens logisk evne for denne pasientgruppen er begrenset [2]. I tillegg, mens mange studier har identifisert molekylære hendelser som kan bidra til terapeutisk motstand mot androgen-målsøkende midler, er det vanskelig å anvende disse funnene på grunn av den begrensede tilførsel av sekvensielt ervervet vev og den forventede heterogenitet i flere metastatiske innskudd til stede i en hvilken som helst individuell pasienten [3], [4]. Som sådan, metoder som ville tillate for non-invasiv sekvensiell overvåking gjennom kliniske forløpet av behandlingen vil være av enorm verdi for klinikere.
Sirkulasjonstumorceller (CTCs) har potensial til å gi en ikke-invasive hjelp av vurdere progressive kreft i sanntid under behandlingen, og videre, for å hjelpe direkte terapi ved å overvåke fenotypiske fysiologiske og genetiske endringer som oppstår i respons på behandling. I de fleste CRPC pasienter, har den primære tumor er fjernet, og CTCs ventes å bestå av celler kaste fra metastaser, og gir en «fluid biopsi «. Foreløpig er den eneste metoden som er godkjent for CTC oppregning (CellSearch, Veridex) basert på en immun berikelse tilnærming som pre-velger for celler som uttrykker Epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM), en epitelial celleoverflaten markør [5]. Selv om tall kvantifisering av CTCs ved hjelp CellSearch har gitt noen prognostisk informasjon på visse typer kreft [6] – [8], har denne metoden begrensninger slik som lav følsomhet (celler med lav eller fraværende EpCAM uttrykket vil ikke bli fanget opp) og det faste nærvær /forurensning av genomisk normale leukocytter i prøveopparbeidelse som vanskeliggjør ytterligere molekylær karakterisering og tolking. Nylig har genomisk endringer basert på rekke CGH og begrenset sekvense blitt rapportert på CTCs isolert med CellSearch system [9]. Detaljert analyse i parvise tumorer og metastaser (n = 2) og CTCs (n = 8) foreslått at de fleste mutasjoner som detekteres i CTCs var tilstede ved et lavt nivå i den primære tumor [9]. Men fordi en enkelt endepunktet i løpet av det kliniske forløpet av sykdommen ble undersøkt denne studien omhandler ikke hvordan en svulst kan reagere og utvikle seg til terapeutisk trykk.
Her demonstrerer vi kraften av to nyutviklede teknologi for for å tilveiebringe en mer omfattende portrett av de molekylære endringer som skjer, på celle-nivået, i en CRPC pasient under behandling trykk i både ADT og kjemoterapi innstillinger. High Definition-CTC (HD-CTC) metoden ble brukt for langsgående identifisering og telling av CTCs [10] og esler for uttrykket av AR [11]. Analysen benytter en objektiv protokollen til å undersøke og skille CTCs blant de omkringliggende leukocytter basert på deres cytokeratin positive (CK +) fenotype ved hjelp av en høy oppløsning immunfluorescens bildebehandling. I tillegg bevarer de HD-CTC teknologi cellen morfologi på en slik måte som gjør det mulig for morfometriske og den indirekte kvantifisering av AR og CK protein ekspresjonsnivåene for alle CTCs identifisert i blodprøven. For ytterligere å karakterisere hvert CTC, ble en protokoll utviklet for å ekstrahere individuelle celler under betingelser som er egnet for etterfølgende analyse genomisk ved en modifikasjon av den eneste kjerne-sekvenseringsmetode beskrevet av Navin,
et al.
[12] og Baslan,
et al.
[13]. De kombinerte metoder i stand til å spore over tid de molekylære endringer i CTC befolkningen ved å sammen morfometriske og protein uttrykk data med genomet brede CNV endringer for hver av 41 individuelle CTCs isolert på fire klinisk signifikante tidspunkter. Vi var i stand til å knytte fremveksten av distinkte CTC subpopulasjoner utrustet med spesifikke molekylære forandringer med det kliniske forløpet av sykdommen, spesielt i løpet av målrettet ADT, som ble klinisk representert av en kort periode med reaksjon fulgt av motstandsdyktighet og klinisk flukt.
Materiale og metode
pasient~~POS=TRUNC klinisk Historie og blodprøver samlet inn under behandling
studiet ble godkjent av Institutional Review board (IRB) fra University of Southern California Comprehensive Cancer Center. Pasienten gitt skriftlig informert samtykke.
Pasienten presenteres med PCa metastatisk til en lumbalvirvel ved diagnose som primær biopsi representerer den første prøven i denne studien. Initial behandling besto av androgen deprivasjon terapi (leuprolidacetat). Etter 5 måneder, det var klinisk progresjon til CRPC og pasienten ble registrert i en klinisk studie med docetaxel i kombinasjon med bevacizumab og everolimus (clinicaltrials.gov identifikator: NCT00574769). Før kjemoterapi ble igangsatt, ble en basislinje blodprøvetaking tatt (Tegn 1) i henhold til prøvetakings protokollen. Klinisk progresjon ble bemerket etter 4 måneder med protokollspesifiserte kjemoterapi. I løpet av de neste 3 månedene, flere doser av docetaxel samt ekstern stråle strålebehandling og samarium (
153Sm) lexidronam (et bein målretting radiofarmaka) ble ansatt med begrenset palliativ fordel. Etter 12 måneder etter diagnose, behandling med abirateron acetat, en svært selektiv androgen syntese inhibitor, ble igangsatt. Blod ble tatt før start abirateron (tegn 2), ved 3 uker med kontinuerlig behandling som sammenfaller med en klinisk reaksjon representert ved redusert smerte og PSA-nivå (Tegn 3), og ved 9 uker som sammenfaller med klinisk progresjon representert ved økende smerte og PSA-nivå (Tegn 4). Etter abiraterone ble behandlingen endret til cabazitaxel uten klinisk respons etterfulgt av en rask klinisk forverring. Pasienten døde av allment metastatisk prostatakreft 4 måneder etter Draw 4 (17 måneder etter diagnose).
Blood Prøvetaking og behandling for CTC Detection
Pasient perifere blodprøver ble innsamlet i henhold til en IRB godkjent protokoll. Prøvene ble sendt til vårt laboratorium og behandles innen 24 timer etter tidspunktet for uavgjort. Prøvepreparering ble tidligere beskrevet i [10]. I korthet, består det av en rød blodcellelyse etterfulgt av plettering av kjerneinneholdende celler som et monolag på skreddersydde celle-adhesjon glassplate etterfulgt av lagring i en biorepository. Hver prøve produsert minst 14 uavhengige lysbilder for CTC identifisering og karakterisering.
immunfluorescens Farging og CTC Enumeration
For denne studien brukte vi en protokoll basert på publiserte HD-CTC-analyse kombinert med evaluering av androgen reseptor (AR) status i cytokeratin (CK) positiv CTC befolkning [11]. I korthet ble cellene merket ved anvendelse av mus-monoklonalt cytokeratin 19 (1:100; Dako) og panCK (1:100; Sigma) primære antistoffer for å identifisere cytokeratin (CK) positive celler. AR positive HD-CTCs ble identifisert ved hjelp av en kanin anti-AR monoklonalt antistoff (1:250, Cell Signaling Technology). Både CK og AR antigener ble visualisert ved hjelp AlexaFluor sekundære antistoffer; de CK primære antistoffer ble anerkjent med Alexa Fluor 555 IgG1 sekundært antistoff (1:500, Invitrogen) og kaninen AR antistoffet ble anerkjent med Alexa Fluor 488 IgG (H + L) sekundært antistoff (1:1000, Invitrogen). Alexa Fluor 647 konjugert anti-CD45 (1:125; ABD Serotec) primært antistoff ble brukt til å identifisere leukocytter som en utelukkelse markør. For å bekrefte at cellene er kjernedannelse og for å muliggjøre analyse av kjernefysisk morfologi alle celler ble farget med en 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI).
Glassene ble fotografert og antatte CTCs ble registrert ved hjelp av en datastyrt high-throughput fluorescens mikroskop ved 10 x forstørrelse. CTCs ble identifisert ved en hematologi tekniker ved hjelp av tidligere publiserte kriteriene for å ha en DAPI + kjerne pluss cytokeratin positivitet og CD45 negativitet [10]. Androgen reseptor-protein ekspresjon og lokalisering ble evaluert ved bruk av to kriterier (1) nærvær (AR
+) eller fravær (AR
-) av AR flekker, og (2) AR subcellulære lokalisering (atom AR versus cytoplasmatisk farge eller begge ). Terskelen for AR positivitet ble definert som et signal mer enn 6 standardavvik over gjennomsnittet signalintensitet (SDOM) observert i de omkringliggende leukocytter (bakgrunn). Subcellulære lokalisering ble målt ved hjelp av relativ pikseltetthet av AR flekker over kjernen og cytoplasma.
HD-CTC-analyse reproduserbarhet
Den HD-CTC-analysen ble teknisk godkjent med cellelinje spiking eksperimenter for å nå en R
2 = 0,9997 på linearitet testing som tidligere rapportert. Disse eksperimentene ble utført ved anvendelse av SK-BR-3-cellelinjer og fra 0 til 3 x 10
2 celler pr ml av normal donor kontroll blod. Variasjonskoeffisienten er 16% og inter-prosessor korrelasjon er R «sup> 2 = 0,979. Prøveopparbeidelse prosessen følges standard operasjonsprosedyrer for pasientprøver gjennom en bar kodet system for alle forbruksvarer og instrumentering. All off-the-sokkel instrumentering ble kalibrert i henhold til de tekniske valideringsprotokoller etablert under igangkjøring [14].
Uttak av enkeltceller
Som en standard prosedyre, med sikte på å minimere DNA-fragmentering celler ble plukket innen 5 dager etter den første fargeprosedyre. Den eksperimentelle protokollen for HD-CTC væskefase fangst ble delt inn i tre atskilte sekvensielle trinn: (1). CTC flytting, (2) celle utvinning og (3) isolasjon og manipulasjon av enkelt CTCs for nedstrøms molekylære analyser
HD-CTCs ble flyttet (trinn 1) ved hjelp av en transformasjonsmatrise fra den første datainnsamling for HD-CTC identifikasjon. Etter kalibrering og flytting, hver kandidat celle ble re-fotografert ved 40 × oppløsning for detaljert morfometrisk analyse. For cellen utvinning (trinn 2) en Eppendorf overføring Man NK2 mikromanipulator ble anvendt for å fange celle av interesse i en 25 ° taggete mikropipette (Piezo borspiss ES, Eppendorf) ved å anvende fluid suging. Når cellen av interesse ble fanget inne mikropipette (trinn 3), ble cellen skylt med PBS og avsatt inne i et 0,2 ml PCR-rør inneholdende 2 pl av lyseringsbuffer (200 mM KOH, 50 mM DTT). Prøven ble deretter og umiddelbart frosset og lagret ved -80 ° C inntil videre behandling. Alle instrumenter og forbruks ble renset ved hjelp av en DNAase løsning og eksponering for UV-lys i 30 minutter før forsøket.
Enkelt Cell Next Generation Sequencing og bioinformatiske analyse
celle som inneholder ampuller ble overført i tørris til sekvense laboratoriet. I korte trekk ble den lyserte celleblandingen tint og utsatt for WGA og sekvensering bibliotek konstruksjon som tidligere rapportert [13]. WGA ble utført manuelt i en 96-brønns plate format ved hjelp av WGA4 Genomeplex enkelt celle Whole Genome Amplification Kit (Sigma-Aldrich), etterfulgt av rensing ved hjelp av en QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen). Konsentrasjonen av eluerte DNA ble målt ved anvendelse av et Nanodrop 8000 (Thermo Scientific). For hver brønn, ble amplifisering betraktes som vellykket dersom det resulterende DNA-konsentrasjonen var ≥70 ng /ul (elueringsvolum på 50 pl), etterfulgt av ytterligere Kvalitetskontroll (QC) for å bekrefte den riktige prøvestørrelsesfordeling ved bruk av Agilent 2100 Bioanalyzer (High følsomhet DNA-analysen og Kit, Agilent Technologies).
i tillegg ble det detaljerte metoder som brukes til å analysere sekvense data publisert nylig av vår gruppe [13]. Kort fortalt, de informatikk metoder består av tre trinn: først, deconvoluting sekvensen leser basert på strekkoder; andre, kartlegge leser for det menneskelige genom (hg19, Genome Reference Consortium GRCh37, UCSC Genome Browser database) [15], og fjerne PCR duplikater; og tredje, normal for guanin-cytosin (GC) innhold og estimere kopi nummeret ved hjelp av CBS segmentering algoritmen. Kopiantallet profiler i denne rapporten er basert på 20.000 variabel lengde genom binger, i snitt en lengde på ~150 kilo-basepar hver, og ble beregnet som forholdet i forhold til normal (hg 19). Dataene som presenteres her, hadde en median teller til 1.78 million unikt kartlegging leser, med en rekkevidde fra 244 190 (minimum cutoff 200.000) til 5.33 million.
Cluster Analysis
Den hierarkiske clustering ble utført i R [16] med heatmap.2 funksjonen i gplots pakken. Ward metode med Euklidsk avstand metrisk ble brukt for clustering. Heatmap er farget i henhold til tidsavgrensninger som er beskrevet ovenfor og clustering ble utført ved hjelp av median sentrert data.
Frequency Analysis Definere Genomisk Endringer
Ved hjelp av median sentrert CNV profiler, cutoff forhold versus medianen av 0,8 og 1,25 ble brukt for å definere slettinger og amplifikasjoner, respektivt. Disse cutoffs ble brukt både til å farge heatmap og å gjøre frekvensanalyse.
Statistikk og Cell morfologi Analyse
Celle form (
celle rundhet
) ble analysert ved å spore den cellecytoplasmaet kontur i det sammensatte bildet av hvert CTC. Den spores celle Bildet ble importert til R, og en ellipse ble montert til formen ved hjelp av en minste kvadraters tilpasningsalgoritmen beskrevet av Halir og Flusser [17]. Algoritmen utganger cellens hovedakse, som er den største radius av den monterte ellipsen (se støtteinformasjon). Cellen rundhet (
c
) beregnes som andel av
de facto
celleområdet (
A
) og arealet av en sirkel med radius (
r
) satt til cellens hovedakse.
p-verdien benyttet i sammenligningen av rundhet mellom CTCs i Draw 3 og 4, ble beregnet ved bruk av Wilcoxon sum-rank test.
diskusjon
behandling Response Resultater og overvåkes av Longitudinal CTC Molecular analyse
for å vurdere pasientens respons på behandlingen høyt innhold enkelt celle analyse inkludert: (1) AR protein uttrykk fenotype (2) AR subcellulære lokalisering og (3) CNV genomisk profilering ble utført i CTCs identifisert i blodprøver tatt over fire forskjellige intervaller som representerer beslutningspunkter i standarden vare på CRPC inkludert: (Tegn en) umiddelbart før oppstart av docetaxel kjemoterapi (Tegn 2) umiddelbart før abirateronacetat (en svært selektiv androgen syntese inhibitor), (Tegn 3) etter tre uker, og (Tegn 4) etter ni uker med kontinuerlig abirateron behandling. De spesifikke data for alle profilerte celler er presentert i bære informasjonen. I tillegg ble en lignende sekvenseringsbasert metode anvendes for å oppnå den CNV profilen til en metastatisk området fra pasienten ved hjelp av et ben biopsi tatt på diagnosetidspunktet (5 måneder før trekke 1) før behandling med en hvilken som helst cancer-spesifikk terapi. Som vist i figur 1A, og i løpet av 7 måneder perioden mellom Tegner 1 og 2, pasientens oppviste innledende respons på docetaxel-baserte kjemoterapi etterfulgt av motstand. Samtidig pasientens væske biopsi viste en konstant andel av AR
+ og AR
-. Subpopulasjoner mens det totale antall CTCs redusert (figur 1A, 1D, figur S1 og tabell S1)
( A) de totale HD-CTCs teller, inkludert antall fenotypisk tydelig AR
+ og AR
– celler, ble bestemt for hver blod Uavgjort samlet under terapeutisk intervensjon. CTCs ble definert som AR positivt om AR signalintensitet var høyere enn seks standardavvik over gjennomsnittet (SDOM) av de omkringliggende leukocytter (bakgrunn). Baren-grafen viser utviklingen i fordelingen av AR
+ og AR
– CTC subpopulasjoner langs løpet av behandlingen, angitt i rødt og blått henholdsvis, og tallene blir presentert over hver bar. (B) PSA konsentrasjon målt ved hver behandling endepunktet. (C) Boxplot av celle rundhet for hver enkelt CTC identifisert på tvers av de ulike behandlings tidspunkter. (D) Representative 40 × immunofluorescence bilder av AR
+ og AR
– HD-CTCs fra subpopulasjoner identifisert i hver behandlingsendepunktet. Immunofluorescence kanaler er farget som følger: kjernen: blue; cytokeratin: red; AR: white; og CD45: green. AR fenotype vises i nedre venstre hjørne av hvert bilde. Alle grafer ble oppført ved hjelp av ggplot2 og RGL pakker i R.
genomiske CNV profiler av CK
+ celler fra Tegner en og to var av to typer (Figur 2 og S2). Tre av disse cellene var negative for AR uttrykk (CK
+ AR
-) mens flertallet (16/19) viste høye nivåer av AR protein (CK
+ AR
+). En AR
– og en AR
+ celle hadde nær normal CNV profiler sammenlignbare med dem som ble oppnådd fra enkelt CK
-CD45
+ leukocytter (figur 2). Alle andre CK
+ AR
+ -celler oppviste et komplekst mønster av genomiske rearrangementer som var lik den genomiske profilen erholdt med tilbakevirkende kraft fra pasientens benmetastase (hormon naive vevsprøve) erholdt ved diagnose (figur 2 og figur 3A) . CK + AR + celler og benmetastase prøven delt flere Avvik kromosomarmer pluss en karakteristisk fokal forsterkning på 3p13 sentrert på fosfatase regulatoriske subenhet PPP4R2 og inneholdende minst to gener involvert i kreft, FoxP1 [18], [19] og MITF [20] (figur 2). Til nivået av oppløsning tilgjengelig, viste hvert av de delte hendelser identiske genomiske brytningspunkt, og i den hierarkiske klyngeanalysen AR
+ -celler fra tegner 1 og 2 gruppert sammen med den beinmetastase (Cluster A i figur 3A). Fra dette bevis, antyde vi at disse cellene er
bona fide
CTCs utledet fra pasientens metastatisk avstamning. Til tross for den klare avstamning forholdet, AR
+ sirkulerende celler avvek fra metastaser på AR locus, viser multikopi forsterkning av ulike segmentene på Xq12 inneholder AR genet selv. AR forsterkning er hyppig i CRPC, og har vært knyttet til progresjon fra kastrering følsom prostatakreft til CRPC [21]. Det er verdt å merke seg at hver av AR amplifikasjonene (figur 3C) er unike, som oppstår fra flere forskjellige brytningspunkter på hver side av AR-genet, noe som indikerer at AR amplifikasjon oppsto flere uavhengige ganger (konvergent evolusjon) sannsynligvis som et resultat av den selektive trykket som gis av androgen deprivasjon terapi
Kopier nummer variasjon profiler fra pasientens bein metastasering.; et styre enkelt WBC; og enkelt CTCs fra hver av de fire behandlings tidspunkter vises. Den tilsvarende fluoriserende bilde av cellen som brukes til å generere den CNV profilen er vist til høyre. Relevante genomiske forandringer og deres kromosom lokaliseringer som forekommer i hvert enkelt uavgjort er angitt med lyseblå barer.
(A) Tre forskjellige klonale linjene, representert som Cluster A, B og C, ble identifisert basert på sammenligning av 41 enkeltcelle CNV profiler i en unsupervised hierarkisk clustering. Blodprøvetaking fra der hver celle ble isolert er angitt som Draw 1: gul; Tegn 2: orange; Tegn 3: lilla; og Draw 4: svart. For referanse, ble beinmetastase FFPE vev inkludert i treet, farget i grønt. Under treet, indikerer en heatmap de presiseringer (rød) og slettinger (blå) på tvers av hele genomet til hver enkelt celle. (B) Frekvens av genomisk presiseringer og slettinger i de tre klynger identifisert. Områder unikt forsterket (rød) eller slettet (blå) i klynge A og C er uthevet. (C) En detalj plott av AR forsterkning hendelsen farget per trekning for hver enkelt klynge vises.
I Draw 3, etter tre uker med abirateronacetat behandling, viste pasienten en klar klinisk respons som definert som reduksjon i PSA og smerte (figur 1B). Denne responsen sammenfalt med en brå endring i CTC fenotyper og genotyper. Selv om det absolutte antall CTCs i Draw 3 var sammenlignbar med Draw 2, var det en nesten fullstendig nedbryting av AR
+ CTC befolkningen (figur 1A). CK
+ celler identifisert i Draw 3 uttrykte liten eller ingen AR protein og også ulik morfologisk, ser ut til å være betydelig mer langstrakt enn AR
+ celler fra Tegner 1 og 2 (figur S1 og tabell S1). Dette morfologisk endring gjenspeiles i en reduksjon av median celle rundhet (figur S3) fra 0,87 (sd = 0,14) i Draw 1 og 2 til 0,62 (sd = 0,15) i Draw 3, p 10
-11 Wilcoxon rank -sum test (figur 1C).
den tilsynelatende effekten av behandlingen var også tydelig i genomisk analyse av Tegn 3 hvor de endrede fenotypiske statene korrelert med distinkte genomiske profiler. Majoriteten (10/12) av fenotypisk AR
– celler fra Draw 3 ble ikke forsterket for AR og utstilt tilsynelatende normal eller nesten normal (pseudodiploid) profiler (figur S2) plassere dem i Cluster B i figur 3A. En av de to AR
– celler fra denne endepunktet hadde det CNV signatur som er typisk for Cluster En inkludert forsterkning av AR, mens den andre forbundet med en tredje klynge (Cluster C i figur 3A), dominert av celler fra den etterfølgende endepunktet ( Tegn 4). Missense mutasjoner som påvirker AR proteinstabilitet og /eller nonsense-mutasjoner i AR-genet kunne ta hensyn til fenotype AR-genotype forskjell i de to siste celler. Vi tolke at den opprinnelige respons på abirateron acetat betydelig utarmet androgen-avhengige AR
+ befolkning, og at en annen AR
– populasjonen dominert av pseudodiploid celler var til stede i sirkulasjonen. Basert på den totale celletall, bor konstant mellom trekker 2 og 3, antyde vi at Draw 3 befolkningen er en konsekvens av kreft, men fra en kilde utenfor hoved svulst avstamning (figur 3A).
Tegn 4 ble samlet på det punktet av klinisk progresjon, når PSA nivåer økt etter 9 uker på abiraterone (figur 1B). På dette tidspunkt hadde den CTC telling redusert til 47% av den foregående endepunktet, men hadde en gang gjennomgått en betydelig fenotypisk skift, som de fleste av CTCs var igjen AR
+ med en celle rundhet verdi på 0,81 typisk celle fra de to første trekker (figur 1C og fig S1). Dette funnet, noe som tyder på en sammenheng mellom behandlingsrespons og en CTC fenotype i stedet for med total CTC teller, er forenlig med en nylig publisert studie hvor ekspresjonen av to markører for den AR signalveien på CTCs ble overvåket i respons til androgen-rettet terapi [ ,,,0],22].
Endringer i respons på behandlingen ble igjen tydelig på det genomiske nivå, som (6/10) celler dannet flertallet av en ny, tilsynelatende klonal, subpopulasjon (Cluster C i figur 3A og S2). De CNV signaturer i Cluster C er tydelig i den opprinnelige avstamning, som går tilbake til benmetastaser samplet før noen systemisk behandling, men er nå preget av funksjonelt relevante hendelser som en smal fragment som inneholder MYC, og forsvinningen av FOXP1 /MITF fragment sammen med andre forskjeller er angitt i figurene 2, 3A og 3B. MYC forsterkning er en av de mest vanlige forandringer observert i metastatiske tumorer, og har blitt foreslått å være en bypass-mekanisme for AR uavhengig motstand [23]. Interessant en nærmere undersøkelse av den genomiske AR forsterkning (skissert i figur 3C) viser at, i motsetning til de heterogene forsterknings grensene observert i tidligere celler (cluster A), ble cellene i klynge C oppviser en enkelt profilform med nesten ensartede stoppunkter og betydelig høyere nivåer av AR forsterkning. Tatt sammen de genomiske elementer tyder på at Cluster C celler representerer en roman avstamning, tilsynelatende motstandsdyktig mot abirateronacetat, og genererte kanskje fra en enkelt bestandig celle.
I tillegg morfometrisk analyse av AR subcellulære lokalisering viste at AR var vanligvis lokalisert i cellekjernen fra Tegner 1 og 2, men ble identifisert som signifikant mindre lokalisert til kjernen i CTCs isolert i Draw 4 oppsamlet ved progresjon (p = 0,00017 Wilcoxon rank sum test) (figur 4). Dette funn er spesielt interessant i lys av nylige studier indikerer at ligand-uavhengig AR spleisevarianter kan mediere abirateron resistens i et humant CRPC xenograft modell [24], og at disse avkortede og konstitutivt aktive former av AR er funnet å være lokalisert i kjernen så vel som cytoplasmaet i prostata cancer-cellelinjer [25].
(A) sammenligning av AR subcellulære lokalisering i CTCs identifisert i blodet før og etter ni ukers abirateron behandling. Korrelasjon mellom AR og DAPI signaler i cellen er indikativ for AR blir colocalized med DAPI,
dvs.
Lokalisert i cellekjernen. Høy korrelasjon ble generelt sett før abiraterone behandling, men et skifte til mindre atom flekken ble observert etter ni ukers behandling (p = 0,00017, Wilcoxon sum-rank test). (B) og (D) Høyde kart bygget opp av bildeelementintensitetene av CK (rød), AR (grønn) og DAPI (blå) i representative CTCs for å visualisere den subcellulære lokalisering av AR. Cellen i (B) ble isolert før abirateron initiering og viser AR farging begrenset til kjernen, mens cytoplasma AR farging observert i den CTC identifisert ved tidspunktet for terapeutisk tilbakefall (D). (C) og (E) Plott av AR versus DAPI signalintensitetene for hvert bildeelement inne i cellen i 40 x bilder av CTCs i (B) og (D), respektivt. Hver tomt punkt er farget av det tilsvarende CK signalintensitet. Nuclear lokalisering ble observert som positiv korrelasjon mellom de to intensiteter (C), og kjernefysisk utelukkelse som negativ korrelasjon (E). phenotype-genotype.
doi:10.1371/journal.pone.0101777.s004
(DOCX)
Acknowledgments
We
