Abstract
Uttrykket av tumorceller av proteiner med avvikende struktur, uttrykk eller fordeling står for utvikling av en humoral immunrespons. Autoantistoffer (AAB) rettet mot tumorassosierte antigener (TAA) kan dermed være spesielt relevant for tidlig diagnostisering av kreft. Serologisk proteom analyse (SERPA) tar sikte på å identifisere slike sirkulerende AAB gjennom immunoblotting av 2D-separerte tumorcelleproteiner med kreftpasient serum og rad MS identifisering av proteiner i reaktive flekker. Denne fremgangsmåte har den fordel å bruke post-translasjonelt modifiserte proteiner som en kilde for potensiell TAA. Her, søkte vi denne strategien ved hjelp av kolorektale svulstceller pre-eksponert for hypoksi for å fremme ekspresjonen av et mønster av TAA større sannsynlighet for å representere
in vivo
forhold. Vi brukte to humane HCT116 og HT29 kolorektal kreft-cellelinjer eksponert i 48 timer til 1% O
2. Flekker positive etter immunblotting av 2D-separerte lysater av hypoksiske celler med sera fra tumorbærende mus, ble samlet og analysert ved MS for protein identifikasjon. Blant de hypoksi spesifikke immunogene proteiner, identifiserte vi en fosforylert form av eukaryote oversettelse forlengelse faktor 2 (fosfor-Thr56 eEF2). Vi bekreftet økt fosforylering av dette proteinet i hypoksiske kolorektale svulstceller, så vel som i musetumorer. Ved hjelp av en spesifikk immunanalyse, kunne vi påvise nærvær av tilsvarende anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB i serum hos tumorbærende mus (
vs
friske mus). Vi har videre dokumentert at påvisning av disse AAB forut for påvisning av en følbar tumormasse hos mus, og validert tilstedeværelse av anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB i serum hos pasienter med adenomatøse polypper og kolorektal karsinom. Som konklusjon, denne studien bekrefter en fosforylert form av eEF2 som en ny TAA og mer generelt, gir bevis for at integrere hypoksi oppstrøms SERPA tilbyr en mer relevant repertoar av TAA i stand til å avsløre tilstedeværelsen av sirkulerende AAB.
Citation : Grandjean M, Sermeus A, branders S, Defresne F, Dieu M, Dupont P, et al. (2013) Hypoksi Integrering i den serologiske Proteome analyse avslører tumorantigener og Fosters Kartleggings Anti-Phospho-eEF2 Antistoffer som Potential Cancer Biomarkers. PLoS ONE 8 (10): e76508. doi: 10,1371 /journal.pone.0076508
Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, Japan
mottatt: 24 mars 2013; Godkjent: 27 august 2013; Publisert: 10. oktober 2013
Copyright: © 2013 Grandjean et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fonds National de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS), den Fonds de la Recherche Scientifique MEDICALE (FRSM), en handling de Recherche Concertée fra Communauté française de Belgique (ARC 09 /14-020), den Interuniversity attraksjonen Pole (IUAP program P7.03) og J. Maisin Foundation. M. Grandjean er en FRIA (Fonds pour la dannelse à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture) Research Fellow. Den MS innretningen av URBC-NARILIS ble støttet av FNRS (Brussel, Belgia). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bidraget av svulsten mikromiljøet til kreft progresjon er i dag anerkjent [1]. Hypoksi er en av disse microenvironmental parametere som utgjør fenotypiske endringer i tumorer [2] – [4]. Lav oksygenkonsentrasjon i tumorer oppstår som følge av en ubalanse mellom tilførsel og forbruk av oksygen hovedsakelig på grunn av umodenhet i tumorvaskulaturen og hurtig kreftcelle proliferasjon, henholdsvis [5]. Som svar på tumor hypoksi, vil tumorcellene forsinke deres proteinsyntesen maskineri, mens på samme tid, vil induksjon av transkripsjonsfaktorer slik som HIF (hypoksi-induserbar faktor) fremme spesifikke gene expression programmer [6], [7]. Hypoksiske tumorceller vil således utgjøre en proteomikk profil tydelig fra normoksisk tumorceller, med den foretrukne ekspresjon av proteiner som kreves for å støtte adaptive mekanismer, inkludert de som fører til angiogenese og glykolytisk bryteren [8] – [10]. Interessant, hypoksi spiller også en rolle i kreftutvikling som følge av tidlig tumorcelle-proliferasjon på epiteliale flater som er adskilt fra den underliggende blodtilførsel ved et intakt basalmembran [11]. Dessuten er koblingen mellom betennelse og kreft foreslått å integrere hypoksisk miljø på grunn av økt metabolisme og cellefornyelsen mens mikrovaskulær nettverk er ikke (ennå) tilpasset [12]. Interessant, i kolorektal karsinogenese, ble adenom-karsinom-sekvensen rapportert å være assosiert med induksjon av HIF-1α i premaligne lesjoner [13] så vel som med dysplasi [14]; HIF-2α ble også rapportert å fremme progresjon fra adenom til karsinom [15].
Selv om hypoksi er anerkjent som et kjennetegn på svulster utgjør endringer i tumorcelle fenotype, det har vært så langt i stor grad undervurdert som et kilde for modulering av et mønster av antigener tilbøyelige til å gi opphav til en immunogen respons. Tumor-assosierte antigener (TAA) er beskrevet som proteiner utgitt av tumorceller eller peptider eksponert på overflaten av tumorceller eller antigen-presenterende celler av MHC klasse I og II-molekyler, henholdsvis [16] – [19]. Mutasjon, trunkering, misfolding, over-ekspresjon og ektopisk ekspresjon av proteiner i tumorceller er foreslått for å ta hensyn til immunogenisiteten til disse TAA [20] – [22]. Interessant, autoantistoffer (AAB) rettet mot disse modifiserte proteiner representerer potensielle biomarkører for tidlig deteksjon av kreft eller prognose [23] – [26]. Spesifisitet og stabilitet av antistoffer sammen med en relativ letthet av påvisning representerer viktige fordeler sammenlignet med andre sirkulerende blodkomponenter [19]. Den SERPA (serologiske Proteome Analysis) teknikken utnytter separasjonen av proteinlysatene avledet fra kreftceller på to-dimensjonale gels og påfølgende immunoblotting hjelp sera innsamlet fra kreftpasienter [25], [27], [28].
Her, av de grunner som eksponerte ovenfor, valgte vi å integrere hypoksi som en miljømessig parameter i SERPA arbeidsflyten ved pre-inkubering av kolorektal kreft celler i 1% O
2, for å avdekke TAA fraværende eller ikke påvises i lysater av normoksiske tumorceller. Vi identifiserte forskjellige tumor- og hypoksi-spesifikke antigener, inkludert fosforylerte Thr56 form av eukaryote elongeringsfaktor 2 (eEF2). En dedikert immunoassay ble utviklet og satt oss i stand til å validere fosfor-eEF2 som en
bona fide
hypoksi-indusert TAA og tilsvarende AAB som potensielle kreft biomarkører hos mus og mennesker.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle forsøk med mus og tumorceller fått godkjenning av
Comité d’Ethique Facultaire
av
Université Catholique de Louvain plakater (UCL) ( godkjenning ID 2012 /UCL /MD005); musestudier ble utført i henhold til nasjonale dyr omsorg bestemmelser.
Alle pasientene ble innlagt på Universitair Ziekenhuis Brussel (Belgia) og ga skriftlig informert samtykke enige med politikken til sykehuset. Dette inkluderer anonym bruk av rest kroppen materiale for vitenskapelige forskningsformål i henhold til Helsinkideklarasjonen og artikkel 20.2 av belgisk lov (19-12-2008) knyttet til innkjøp og bruk av menneskelige Kroppslig Materialer for menneske medisinske anvendelser og for Scientific Research. Denne artikkelen av loven sier at samtykke til forskningsbruk av humant biologisk materiale anses å være gitt dersom donor ikke kommunisere en innvending til slik bruk. Praktisk talt alle pasienter som gjennomgår koloskopi gjennomgå en blodanalyse for å vurdere deres blod formel og koagulasjon; denne fremgangsmåten er obligatorisk for å tillate endoskopisk reseksjon i tilfelle polypper er funnet. Ingen av forfatterne var involvert i samlinger av prøver:. Restblodprøver ble innhentet av en sykepleier og avidentifiserte av en data manager før forsendelse til laboratoriet for den strenge formålet med studien
Cells
Mennesketykktarmskreft HCT 116 og HT29 cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC), lagres i henhold til leverandørens anvisninger og brukes innen 6 måneder etter gjenoppliving av frosne porsjoner. Begge cellelinjer ble rutinemessig dyrket i McCoy 5A medium (Invitrogen, Paisley, UK) supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i normoksiske (21% O
2, 5% CO
2) tilstander som er utsatt for hypoksi (1% O
2, 5% CO
2) i en Invivo2 500 hypoksisk kammer for 48 h (Ruskinn, Belgia).
mus
menn 7 uker gamle NMRI mus (nu /nu) (Elevage Janvier, Le Genest Saint-Isle, Frankrike ) ble subkutant injisert med 2,10
6 HCT116 eller HT29 celler; Tumordiametere ble ukentlig spores med en elektronisk caliper. Sera ble samlet for serologiske analyser gjennom retro-orbital punktering på dag 0 og hver uke frem til svulsten diameter når 8 mm. Ved slutten av et sett av eksperimenter ble musene avlivet, blod ble samlet ved intra-kardial rute, serum ble isolert etter sentrifugering ved romtemperatur og tumorer ble kryopreservert.
Pasienter
Sera var innsamlet fra pasienter som gjennomgår koloskopi for fordøyelsesproblemer eller for screening. Seks fagene hadde normal koloskopi og ble brukt som kontroller, fjorten pasienter hadde adenomatøse polypper og ni hadde karsinom; gjennomsnitts alderen disse tre kategoriene av pasientene var 71 ± 4, 67 ± 3 og 71 ± 3 år, henholdsvis. Blod ble oppsamlet på nøytral-type rør, og etter sentrifugering ble serum alikvotert og lagret ved -80 ° C.
to-dimensjonal elektroforese analyse og SERPA
For utvinning av proteiner, eller normoksiske hypoksiske celler ble vasket med 20 mM natriumfosfat-bufret saltløsning (PBS) og skrapet med DIGE merking (DLA) lysebuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS og 30 mM Tris, pH 8,5). Supernatanten ble deretter gjenvunnet etter sentrifugering i 10 minutter ved 10 000 rpm og 4 ° C, og konsentrasjonen ble bestemt ved Bradford proteinanalyse.
For SERPA eksperimenter ble 25 pg av proteinekstrakt minimalt merket med 200 pmol av cyanin fargestoff Cy5 (Amersham GE Healthcare) i 30 minutter i mørke på is, i henhold til produsentens protokoll. Merking Reaksjonen ble stanset ved inkubering av blandingen med 10 mM lysin (Sigma Aldrich) i 10 minutter. Ikke-merkede proteiner ble tilsatt for å oppnå en total på 250 ug av proteiner og fortynnet i et passende lastebuffer (4% 3 – [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 7 M urea, 2 M tiourea, 30 mM Tris, 30 mM ditiotreitol (DTT), 1% IPG buffer 3-11 [GE Healthcare]). Prøvene ble lastet inn rehydrert første dimensjonen stripe (Immobiline DryStrip, pH 3-11 NL, 18 cm, GE Healthcare). Prøvene ble separert på to-dimensjonal gel, ved hjelp av isoelektrisk fokusering i den første dimensjon (300 V i 3 timer, gradvise trinn på 1000 V i 8 timer, 8000 V i 3 timer, og 8000 V i 45 minutter ved 20 ° C med en maksimum gjeldende innstillinger for 50 uA per stripe) og SDS polyarcrylamide gel (10% akrylamid) (SDS-PAGE) i den andre dimensjonen. Proteinene ble endelig overført til en lav-fluorescens PVDF-membran. Membraner ble inkubert i 2 timer i 5% ikke-fett tørrmelk inneholdende Tris-buffer saltoppløsning med 1% Tween (TTBS) blokkeringsbuffer, og deretter eksponert over natten ved romtemperatur for å enten kontroll eller tumor-bærende mus serum i 1% ikke- fett tørrmelk inneholder TTBS (fortynning 1/100). For hvert forsøk ble en pool av sera innsamlet fra 6 forskjellige mus brukes til å sikre robustheten av screening metoden. Immundeteksjon ble utført ved anvendelse av HRP-konjugert anti-mus IgG sekundære antistoffer og ECL pluss reagens (GE Healthcare). Membranene ble skannet ved Cy5 bølgelengde på en tyfon FLA9500 Imager (GE Healthcare) for påvisning av proteiner og ved Cy2 bølgelengde for påvisning av antistoffer, utnytte den HRP-katalysert produksjon av et fluorescerende mellomliggende sender ut på 503 nm fra Acridan underlaget som inneholdes i ECL Plus reagens. For validering av Serpa eksperimenter, ble membranene inkubert med kommersiell antistoff mot eEF2 (Abcam, Cambridge, UK) og HRP-konjugerte sekundære antistoffer (1/5000, Jackson Immunoresearch, Sufolk, UK).
I Gel Enzymatisk spalting og massespektrometri (MS) Identifikasjon
For prøven utvinning, umerkede proteiner ble separert ved 2D elektroforese. 2D-geler ble fluorescensmerket-farget (Krypton protein flekken, Pierce, Thermo Scientific) etter fiksering i en 50% vann, 40% etanol og 10% eddiksyre-oppløsning, 1 time ved romtemperatur. Proteinene av interesse ble automatisk hentet fra gelene ved hjelp av en Ettan Spot Picker (GE Healthcare). Etter skylling, 2D gel flekker var dehydratisert i acetonitril ved 37 ° C. Fordøyelsen ble utført over natten ved 37 ° C med trypsin (12,5 ng /ml) i 100 mM ammoniumbikarbonat. Ekstraksjonstrinnet ble utført med maursyre 5% i 15 min ved 37 ° C. Supernatanter ble deretter anvendt for massespektrometri identifisering av proteiner med en nano-LC-ESI-MS /MS maxis 4G UHR-TOF (Bruker). Proteiner av interesse ble identifisert takket være Mascot programvare (Matrix Science, www.matrixscience.com). Da NCBI nonredundant protein databasen ble søkt med pattedyr som taksonomi. Kun betydelige hits, som definert av Mascot sannsynlighet analyse (p 0,001), ble akseptert og Protein score 63 ble ansett som statistisk signifikant
Immunoblotting og Immunohistochemistry
Immunobloting og farging ble utført. med antistoffer mot eEF2 (1/1000, Abcam), eller fosfor-Thr56-eEF2 (1/1000, Abcam). Gel lasting var normalisert med aktin antistoff (Sigma-Aldrich). Åpenbaring ble gjort med et anti-kanin-IgG-antistoff koblet med pepperrot-peroksidase (Jackson Immunoresearch) og ECL Plus (GE). For immunkjemi, ble 5 mikrometer deler av frosne xenopodet HCT116 svulster montert på lysbilder for farging. Proteinfosfatase (proteinfosfatase, lambda, Calbiochem) ble anvendt i henhold til produsentens protokoll for å bekrefte spesifisiteten av fosforylert immunofarging. Etter behandling med fosfatase, ble tumorsnitt undersøkt med anti-eEF2 (1/50) eller anti-Thr56 fosforylert eEF2 (1/50) antistoffer og ble immunostained med anti-kanin Alexa 488 (Invitrogen).
eEF2 immunoassay
mengder av sirkulerende antistoffer rettet mot fosforylert Thr56 eEF2 ble bestemt i et dedikert immunoassay. 96-brønners plater (Reacti-bindings, Thermo Scientific) ble belagt over natten ved romtemperatur med 10 ug /ml av en 12 aminosyre, fosforylert peptid av eEF2. Den phosphopeptide sekvens var RAGETRFTDTRK, tilsvarende aminosyrene 50-61 av det eEF2 protein, med en fosforylering på Thr56 (Eurogentec). Belegg og blokkeringstrinn ble utført ved anvendelse av ELISA-beleggbuffer og ELISA ultrablock (Abd Serotec) i henhold til produsentens instruksjoner. Utvannet sera (1/100 for mus og 1/200 for mennesker) ble inkubert over natten ved 4 ° C. Etter vasking, ble spesifikk hybridisering målt med et peroksydase-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (fortynning 1/10 000, Jackson Immunoresearch) og tilsetning av 3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin (TMB, Calbiochem). Platene ble avlest ved 450 nm i en VictorX4 mikroplateleser.
statistikker
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik Elevens
t
test og ANOVA tester ble brukt der det er hensiktsmessig. * P 0,05, ** P 0,01 eller *** P 0,001 ble betraktet som statistisk signifikant i de forskjellige forsøk. For kliniske data, ble sub-populasjoner av pasienter registreres automatisk ved å kjøre k-means algoritmen [29]; parvise sammenligninger mellom forskjellige profiler innenfor hver tilstand ble vurdert i henhold til en t-test inkludert Benjamini-Hochberg FDR korreksjon for mangfold av testen [30].
Resultater
SERPA Identifikasjon av eEF2 AAB i Serum av tumor-bærende mus
for å etterligne svulsten mikromiljøet, ble de humane kolorektale HCT116 og HT29-celler utsatt for hypoksi (1% O
2) i 48 timer, et tidsintervall som kreves for ekspresjon av den hypoksi-induserbar genet program på proteinnivået og for å nå en ny likevektshastighet av tumorcelle-proliferasjon. -Celler opprettholdt i henhold til normoksisk betingelser (21% O
2) ble anvendt som kontroller. Deretter påføres den SERPA teknologi for å identifisere hypoksi-spesifikk tumorantigener (figur 1A). HCT116 og HT29-lysater ble først separert på gelen ved to-dimensjonal elektroforese og overført til membraner. Sammenslåtte sera fra kontroll eller tumorbærende mus (6 sera pr tilstand) ble deretter anvendt for å åpenbare flekker svarende til immunogene proteiner. Differensial-analyse ble utført ved å sammenligne 4 forskjellige betingelser: lysatene fra normoksisk og hypoksiske celler probet med serum fra kontroll- og tumor-bærende mus (figur 1B). Denne analysen tillater oss å forkaste to typer flekker: (i) de som tilsvarer proteinene gjenkjent av antistoffer fra mus kontrollsera og (ii) de som tilsvarer proteinene gjenkjent av antistoffer fra tumor-bærende mus, men ikke å bli uttrykt under hypoksi. Gjenværende flekker av interesse ble deretter skåret ut fra preparative geler, fordøyd med trypsin og analysert ved MS (figurene 2 og 3). Ved å kombinere både HCT116 og HT29 cellelinjer, fant vi 17 proteiner med tilfredsstillende Mascot score (p 0,001) som ble gjenkjent av antistoffer fra tumorbærende mus, 4 hypoksi-spesifikke proteiner og 13 tilsvarende proteiner uttrykt begge under hypoksisk og normoksisk vilkår (se nedre paneler i figurene 2 og 3). For resten av denne studien, bestemte vi oss for å fokusere på hypoksi-spesifikt antigen strengt reaktivt med serum tumorbærende mus og identifisert ved MS med sterkest Mascot score, nemlig eEF2 eller eukaryote forlengelse faktor 2.
A. Arbeidsflyt for SERPA prosessen inkludert 2DE-gel separasjon av lysatene fra enten hypoksisk eller normoksisk tumorceller, membran overføring, immunblotting med serum fra enten kontroll eller tumorbærende mus, og påvisning av steder av interesse. B. Typisk immunoblottingforsøk mønstre som oppstår ved inkubasjon av 2D-oppløste lysater av HCT116-celler utsatt for normoxia eller hypoksi, med den indikerte museserum. I bunnplatene, er proteiner av lysatene merket med Cy fargestoff (rødt) og faste antistoffer påvist med et anti-muse-sekundært antistoff (grønn flekk); Pilen indikerer tilstedeværelsen av et protein som utelukkende påvises i lysater av hypoksiske tumorceller av antistoffer fra serum hos tumorbærende mus.
Kartlegging av flekker av interesse som følge av sammenligningen er beskrevet i Fig.1 og liste over identifiserte proteiner (p 0,001) oppnådd ved bruk av lysatene av HCT116 tykktarmskreftceller
Kartlegging av steder av interesse som følge av forhold beskrevet i figur 1 og liste over identifiserte proteiner (p 0.001) oppnådd ved å anvende lysater av HT29 kolorektal kreftceller.
Først, for å validere arten av eEF2 protein som er tilstede i 2D-geler, vi probet membranen med et kommersielt tilgjengelig anti-eEF2 antistoff og funnet at immunoblot signal matchet for lokalisering av den flekk identifisert av SERPA analyse (figur 4A). Videre vil dette forsøket viste at fordelingen av proteinet ved forskjellige isoelektriske punkter (figur 4A og 4B, øvre panel). I SERPA forsøket imidlertid en flekk (den tredje en i henhold til pi-verdiområde) var immunogen (figur 4B, midtre panel), sterkt tyder på at en post-translasjonell modifikasjon kunne gi immunogenisitet.
A. Representant immunoblotting av 2D-separerte lysatene av hypoksiske HCT116-celler med en kommersiell antistoff mot eEF2. Proteiner av lysatene merket med Cy fargestoff (rødt) og sekundære antistoff er konjugert til pepperrotperoksidase (grønne flekker). Positivt signal blir oppnådd for flere flekker av den samme molekylvekt, men skiller seg ved deres pl verdi. B. Sammenligning av de eEF2 flekker detekteres med en kommersiell antistoff mot total eEF2 (øverst), serum fra tumorbærende mus (midtre) og en kommersiell antistoff mot fosfo-Thr56 eEF2 (nederst). Spot 4 (lengst til høyre sted) tilsvarer den ufosforylerte form av eEF2 mens de andre stedene svarer til multi-fosforylerte former av proteinet; flekk 3 (andre plass fra høyre) svarer til fortrinnsrett monophosphorylated form av eEF2 (på Thr56).
Fosforylering av Thr56 eEF2 etter Hypoksi i Human kolorektal kreft celler
Siden fosforylering av eEF2 er kjent for å oppstå som følge av hypoksi (som fører til eEF2 inaktivering og arrestasjonen av protein oversettelse), undersøkte vi omfanget av eEF2 fosforylering på Thr56 tidligere beskrevet som den første og viktigste rester modifisert av en fosfatgruppe innenfor eEF2 sekvens [31]. Re-undersøkelser av 2D-membranen som brukes for SERPA bekreftet at flekken gjenkjent av serum hos tumorbærende mus ble også positivt farget av et kommersielt anti-fosfo-Thr56 eEF2-antistoff (figur 4B, nedre panel). Vi har også bekreftet i konvensjonelle Western blotting eksperimenter som eEF2 fosforylering på Thr56 ble betydelig økt i hypoksiske HCT116-celler (p 0,01) og at en tilsvarende trend ble observert i HT29 celler (figur 5A og 5B). Dessuten er injeksjon av HCT116-celler i mus førte til utviklingen av en svulst med en robust farging av fosfo-Thr56 eEF2 bekrefter forekomsten av denne post-translasjonell modifikasjon
in vivo plakater (figur 5C, øverste panel). Behandlingen av tumor seksjoner med fosfatase lambda helt avskaffet farging oppnådd med en kommersiell anti-fosfor-eEF2 antistoff (figur 5C, bunn panel).
A. Representant eEF2 og fosfor-Thr56 eEF2 immunoblotting av HCT116 og HT29 dyrket i 48 timer under hypoksi (Hx) eller vedlikeholdes i normoxia (Nx). B. Normalisert uttrykk for fosfor-Thr56 eEF2 i normoksiske vs hypoksisk HCT116 og HT29 celler; n = 3, ** p 0,01 C. Representative fosfo-Thr56 eEF2 farging av deler av HCT116 tumorer i fravær (øverst) eller nærvær (bunnen) av fosfatase lambda; merk fullstendig bortfall av fosforylert form av eEF2 ved behandling med fosfatase.
Validering av Phospho-Thr56 eEF2 som en tumor-assosiert antigen og av tilsvarende AAB som Biomarker av Mouse tumorvekst
for ytterligere å undersøke immunogenisitet av fosfor-Thr56 eEF2, har vi utviklet en analyse for å undersøke tilstedeværelse av AAB reaktiv mot en phosphopeptide av 12 aminosyrer flankerer Thr56, tilsvarende aminosyrene 50-61 (Tall 6A). Vi validert linearitet av denne immunoanalyse ved anvendelse av samme kommersielle anti-fosfo-Thr56 eEF2-antistoff som beskrevet ovenfor (figur 6B). I et første sett av eksperimenter ble det benyttet en pool av 6 sera fra mus med store tumorer (dvs. 28 dager etter implantasjon) og fant en 10-ganger høyere enn signalet ved bruk av kontrollserum (figur 6C). I et andre sett av eksperimenter, utførte vi et tidsforløpsstudium for å bestemme endringer i fosfo-Thr56 eEF2 signal i henhold til utviklingen av HCT116 tumorer. Sera ble samlet opp ved retro-orbital punktering i mus ved dag 0 og etter 7, 14 og 21 dager etter injeksjonen av HCT116 tumorceller; tumorvekst ble målt parallelt med en elektronisk skyvelære (figur 6D). Som vist i figur 6E, ble det fosfo-Thr56 eEF2 signal allerede en signifikant økning på dag 7 (s. 0,05
vs
dag 0), mens på dette tidspunkt, svulsten var ennå ikke påvises (Fig. 6D) . På dagene 14 og 21, omfanget av fosfo-Thr56 eEF2 signal ytterligere øket i parallell til veksten av tumorer HCT116 (figur 6D og 6E).
A. Humane og muse aminosyresekvenser for eEF2 i regionen av Thr56. De 12 rester svarende til det syntetiske peptid (fosforylert på Thr56) som brukes i vår immunoassay er indikert (rød ramme); oppmerksom på den perfekte identitet mellom mus og menneske sekvenser. B. Påvisning av kommersielle anti-fosfor-Thr56 eEF2-antistoffer ved hjelp av vår immunoassay; stiplede linjene viser 95% konfidensintervall band av den lineære regresjon. C. Påvisning av anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB i serum fra kontroll eller HCT116 tumor-bærende mus (n = 3). *** P 0,001. D. Tidsforløp av HCT116 tumorvekst bestemt ved måling av tumor diametere (n = 7 per gruppe). E. Påvisning av anti-fosfor-Thr56 eEF2 AAB på den angitte tiden av HCT116 tumorprogresjon. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 (n = 6-7 per gruppe). Legg merke til at på dag 7 etter implantasjon, svulster er ikke oppdages (se panel D) men et positivt signal er oppdaget i immunoassay. F. grafen representerer deteksjon av anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB i serum hos kontrollpersoner (n = 6) og pasienter med adenomatøse polypper (n = 14) eller karsinom (n = 9). * P 0,05, ** P 0,01. Av notatet, k-means identifisert to subpopulasjoner av pasienter (se svarte og røde symboler) blant personer diagnostisert med adenomatøse polypper (P 0,001) og karsinom (P 0,01); samme partisjon ble observert i 100 uavhengige løper ved å variere tilfeldig initialisering av K-betyr algoritme.
Anti-phospho Thr56 eEF2 autoantistoffer Identifiy Sub-populasjoner av pasienter med colonadenomceller og Carcinoma
Vi endelig undersøkt potensialet for påvisning av anti-fosfo-eEF2 antistoffer til å diskriminere kontrollpersoner og pasienter med enten adenomatøse polypper eller tykktarms cacinoma. På grunn av identiteten til sekvenser mellom mus og human eEF2 i restene flankerer Thr56 (se figur 6A), vi brukte den samme immunanalyse for pasienter som den er beskrevet ovenfor for tumor-bærende mus. Vi har funnet at pasienter som er diagnostisert med adenomatøse polypper og carcinoma viste en økning i den fosfo-Thr56 eEF2 AAB-titer (P = 0,0015) sammenlignet med pasienter som er identifisert som negativ følgende kolonoskopi (figur 6F). Dessuten, når du bruker k-means algoritmen (29), to sub-populasjoner av pasienter kunne bli identifisert blant de adenomatøse polypper (P 0,001) og karsinom grupper (P 0,01). (Se røde symbolene i Figur 6F)
Diskusjoner
de to viktigste funnene i denne studien er (i) at hypoksi regnskap for modifisering av immunoproteome som dokumentert av påvisning av sirkulerende AAB rettet mot TAA umulig å oppdage i tumorceller dyrket under normoksiske forhold, og (ii) at hypoksi-mediert stimulering av eEF2 fosforylering står for utviklingen av en tidlig AAB respons til tykktarmskreftutvikling.
AaB er i dag anerkjent som potensielle kreft biomarkører og SERPA ble utviklet for å oppdage dem fra serumprøver gjennom blotting av 2DE-separerte tumorcellelysatene. Den SERPA teknologi, i motsetning til Serex og fagfremvisning, muliggjør påvisning av proteiner som har gjennomgått post-translasjonelle modifikasjoner. Men proteomet i lysatene isolert fra kreftceller dyrket i en konvensjonell inkubator i henhold normoxia er langt fra representerer proteomet av tumorceller i sin
in vivo
mikromiljø. Spesielt er hypoksi et kjennetegn på mange kreftformer som skyldes ubalanse mellom O
2 forbruk og O
2 tilgjengelighet i dårlig vaskularisert svulster. Virkningen av hypoksi på tumorcelle transkriptomet og proteom- er dobbel: mens den globale translasjonelle maskineri er bremset ned til ledig energi, spesifikt gen programmer som reguleres av nøkkeltranskripsjonsfaktorer slik som HIF-familien, blir indusert til å gi tumorcelle-tilpasning [6] . Viktigere, i epiteliale kreftformer slik som kolorektal kreft, hypoksi er også foreslått å oppstå tidlig i løpet av karsinogenese. Mutante celler er faktisk opprinnelig atskilt fra de underliggende blodkar ved fortsatt intakt basalmembran: dette fører til utvikling av premaligne lesjoner i avaskulære regioner og på vei mot det motsatte, mindre begrensede områder [11]
I. denne studien har vi derfor brukt to analytiske filtrene til å velge potensial TAA for videre validering. Først ekskluderte vi flekker identifisert på 2D-membraner etter immunblotting med serum samlet fra kontroll mus. For det andre har vi ikke anser for å plukke de proteinene oppdaget av serum tumorbærende mus, men bare uttrykt i normoksisk tumorceller. Denne strategien lov til å redusere antallet falske positive resultater, og for å favorisere påvisning av spesifikke TAA som påtreffes i
in vivo
forhold. Vi brukte to forskjellige kolorektal kreft cellelinjer (P53-villtype HCT116 og P53-mutant HT29) for ytterligere å øke mangfoldet i proteomet, og spesielt av immunoproteome. Denne strategien førte til identifikasjon av en total av 17 antatte TAA, 13 uttrykt under både hypoksi og normoxia og 4 er utelukkende uttrykt under hypoksi (se figurene 2 og 3). Blant de sistnevnte, vi fokusert på eukaryote oversettelse forlengelse faktor 2 (eEF2), en viktig faktor for ribosomal mRNA oversettelse. Hypoksi er kjent for å fremme eEF2 inaktivering til å blokkere den høye energikrevende proteinsynteseprosess for å spare energi [9]. Inaktivering av eEF2 resulterer fra dets fosforylering på Thr56 av den eukaryote elongeringsfaktor 2 kinase (eEF2K) gjennom en rekke mekanismer som involverer mTOR, AMPK og PHD2 [32] – [34]. Vi har faktisk identifisert denne fosforylert form av eEF2 som immunogen protein. Selv om flere fosforyleringsseter rapporteres for eEF2 som gjenspeiles av de fire plassene med distinkte pi oppdaget av en total eEF2 antistoff, plasseringen av den positive flekk i SERPA pekte fosfor-Thr56 eEF2 som seroreactive enhet. Den andre stilling fra den høyre er virkelig forenlig med den foretrukne fosforyleringssetet tidligere er rapportert å være Thr56 i en kinetisk undersøkelse av reguleringen av eEF2 [31]. Vi deretter bekreftet ved hjelp av en immunologisk analyse med en modifisert peptid fosforylert på Thr56 rester, at denne regionen sto for immunogenisitet eEF2 som oppdages i vår SERPA studien. Ved hjelp av denne analysen, fant vi at anti-fosfor-Thr56 eEF2 AAB var påvises i museserum før svulster kan være følbar. Vi fant også at disse AAB kunne påvises hos mennesker med adenomatøse polypper og kolorektal kreft.
