Abstract
Vår pilotstudie med miRNA arrays fant at miRNA-29C (MIR-29c) er uttrykt forskjellig i den sammenkoblede lav-metastatisk lungekreft cellelinje 95C i forhold til høy-metastatisk lungekreft cellelinje 95D. Bioinformatikk analyse viser at inte β1 og matriksmetalloproteinase 2 (MMP2) kan være viktige mål gener fra Mir-29c. Derfor hypotese vi at Mir-29c undertrykker lungekreft celle adhesjon til ekstracellulære matriks (ECM) og metastase ved å målrette inte β1 og MMP2. De gain-of-funksjon studier som hevet MIR-29c uttrykk i 95D celler ved hjelp av sin ligner viste reduksjoner i celleproliferasjon, adhesjon til ECM, invasjon og migrasjon. I kontraster, tap-av-funksjon studier som reduserte MIR-29c ved hjelp av sin inhibitor i 95C celler fremmet spredning, vedheft til ECM, invasjon og migrasjon. Videre er to-luciferase reporter-analysen viste at MIR-29c inhiberte ekspresjon av luciferasegenet som inneholder 3′-UTR av inte β1 og MMP2 mRNA. Western blotting indikerte at MIR-29c downregulated ekspresjonen av integrin β1 og MMP2 på proteinnivået. Gelatin zymografi analyse bekreftet videre at Mir-29c redusert MMP2 enzymaktivitet. Nude mus med xenograft modeller av lungekreftceller bekreftet at Mir-29c hemmet kreft metastasering lunge in vivo, inkludert bein og levermetastaser. Til sammen våre resultater viser at Mir-29c fungerer som en metastase Lyddemper, som undertrykker lungekreft celle adhesjon til ECM og metastasering av direkte hemmende integrin β1 og MMP2 uttrykk og ved å ytterligere redusere MMP2 enzymaktivitet. Resultatene viser at Mir-29c kan være en roman terapeutisk kandidat mål å bremse lungekreft metastase
Citation. Wang H, Zhu Y, Zhao M, Wu C, Zhang P, Tang L, et al. (2013) miRNA-29c Undertrykker Lung Cancer Cell Adhesjon til ekstracellulær matriks og metastasering av målretting inte β1 og Matrix Metalloproteinase2 (MMP2). PLoS ONE åtte (8): e70192. doi: 10,1371 /journal.pone.0070192
Redaktør: Edward F. Plow, Lerner Research Institute, USA
mottatt: 8 april 2013; Godkjent: 17 juni 2013; Publisert: 6. august 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av delvis med tilskudd fra Natural Science Foundation of China National (No. 30800631, nr 30872553 og nr 81272433) og et stipend fra Shanghai Science and Technology Committee (nr 09411964800). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i dag er lungekreft en av de mest vanlige kreftformer. Mer enn 90% av lungekreftpasienter dør av metastase i stedet for fra deres primære tumorer, noe som tyder på at metastase er en nøkkelfaktor prognostisk [1], [2]. Tumorprogresjon og metastase er en kompleks prosess som involverer mange forskjellige biologiske spillere. Ett av de kritiske regulatorer som er involvert i denne prosessen er en mikroRNA (miRNA) [3].
Mature mirnas er kort, enkelt-trådet, endogen og ikke-kodende RNA bestående av omtrent 22 nukleotider, som regulerer gener på post-transkripsjonsnivået i løpet av oversettelsesprosessen. De kan målrette det 3′-UTR (utranslaterte regioner) av mRNA, noe som funksjonelt fører til en translatorisk hemming eller deregulering av mål-mRNA [4]. mirnas har en stor innflytelse på ulike biologiske prosesser, herunder celledifferensiering, spredning, apoptose, stress motstand, fettstoffskiftet, og utvikling. Derfor spiller de en viktig rolle i ulike sykdommer, inkludert kreft [3]. Videre undersøkelser tyder på at noen mirnas kan fungere som onkogener eller tumor dempere. Mirnas spiller en viktig rolle i tumorigenese og tumorprogresjon, inkludert proliferasjon og metastase [3], [5] – [8]. For eksempel fremmer MIR-10b brysttumormetastase, mens MIR-335 og MIR-126 undertrykke metastase [9], [10]. Derfor kan den neste generasjonen av terapeutiske mål for ondartede svulster være mirnas [11].
Mir-29-familien er et konservert familie av miRNAs inkludert MIR-29a, MIR-29b, MIR-29c, og MIR -29d. Nylig ble ekspresjonsnivåene til mange MIR-29-familiemedlemmer funnet å være redusert i en rekke kreftformer. For eksempel, Sengupta og hans kolleger har vist at Mir-29c er nedregulert i nasofaryngeale karsinom [12], mens Fabbri og hans kolleger oppdaget at MIR-29-familien, inkludert MIR-29c, mål DNMT3A og DNMT3B i lungekreft vev og celler [13].
i denne studien Vår tidligere pilotstudie funnet en nesten firedoblet forskjells uttrykk for MIR-29C mellom høy (95D) og lav-metastatisk (95C) kreftcellelinjer (Detaljer i Tabell S1). Flere studier har tatt nytte av denne forskjellen mellom de to cellelinjer i forhold til invasjon og metastasering [14], [15]. Men rollen som MIR-29c i lungekreft har ennå å bli grundig undersøkt og det meste av sin totale biologiske funksjon er ukjent. Her viser vi bevis på at Mir-29C fungerer som en metastase suppressor som hemmer lungekreft celle adhesjon til ECM og migrasjon
in vitro
, og undertrykker kreftcelle fjernmetastaser
in vivo
. Vi videre bekreftet at Mir-29c kan direkte downregulate inte β1 og MMP2 uttrykk ved å målrette den 3 «-untranslation sekvens, hemmer proteinnivåer inte β1 og MMP2, og redusere MMP2 enzymaktivitet. Resultatene viser at Mir-29c kan være en roman terapeutisk kandidat mål eller strategi for å søke å kontrollere lungekreft metastase.
Materialer og Metoder
Etikk
Alle dyreforsøk var utføres ved å bruke hunn nakne mus (6-7 uker gamle). Musene ble kjøpt fra SLAC Forsøksdyr Ltd Co (Shanghai, Kina) og brydde seg ifølge National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle dyr eksperimentelle protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Tongji University (IACUC nr 1201).
Cellelinjer og cellekultur
Det parede lav-metastatisk 95C og høy metastatisk 95d cellelinjer ble subklonet fra en lav differensiert human stor celle lunge karsinom cellelinje PLA-801. Cellene ble vel godkjent og publisert av flere forskningsgrupper [14], [15]. Cellene ble vennlig levert av professor Ying-Lin Lu, Institutt for patobiologi, Institutt for medisinske basalfag, Military Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina på desember 5,2009. Som beskrevet for 95C og 95D-celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, USA) med 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% kalve bovint serum, og dyrket ved 37 ° C i atmosfære med 5% CO
2. Celler ble brukt for funksjonelle studier innen 6 måneder etter tinte fra flytende nitrogen tank.
microRNAs matrise og QRT-PCR-analyse
Etter å ha utført en enkel migrering analyse for å screene høy- og lav-metastatiske celler , gjennomførte vi en transwell assay som en indeks av Matrigel invasjon
in vivo
ved hjelp av ikke-invasiv 95C-celler i det øvre kammer av den ikke-belagte transwell sette inn (24-brønns innsats; porestørrelse 8 pm; Corning, USA) og 95D celler i bunnen ved hjelp av en Matrigel (50 ug /ml) belagt transwell sette inn for å forsterke den differensielle ekspresjonen av miRNAs. Deretter mirnas differensial uttrykk mellom 95C og 95D ble målt ved hjelp av en MIR human_01_H10.1_080277 miRNA array (LC Sciences Houston, USA). Alle data ble avsatt ved Gene Expression Omnibus (GEO). Sjonsnummer er GSE47788. De målte mirnas med en statistisk forskjell (
p
0,01). Ble ansett for å være vesentlig forskjellig uttrykt
kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble gjennomført for å måle uttrykket nivåer av 95C og 95D celler. Total RNA fra villtype 95C og 95D ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens anvisninger. Den totale RNA (50 ng) ble revers-transkribert med MIR-29C stem-loop RT primere eller U6 RT primere (Shanghai Utvidet Nature Biotech Co., Ltd) ved hjelp av en RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA) i henhold til produsentens protokoll for å danne cDNA. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en SYBR® Premiks Ex Taq ™ Kit (Takara, Japan) med MIR-29c eller U6 PCR primere (Shanghai Utvidet Nature Biotech Co., Ltd). Reaksjonene ble utført ved hjelp av en ABI7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Alle data for hver prøve ble samlet i tre eksemplarer og vurdert ved hjelp av to
-ΔΔCt relativ kvantitativ analyse.
Gain-of-funksjon og tap-av-funksjon for MIR-29c
gain-of-funksjon analyse av MIR-29C etterligner og tap-av-funksjon-analyse av MIR-29c inhibitor
in vitro
ble utført ved celle transfeksjon ved anvendelse av fremgangsmåten nevnt nedenfor. Oligonukleotid sekvenser av MIR-29C etterligner, inhibitor og deres negative kontrollen er:
MIR-29C ligner (29C):
Sense: 5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3 «, etter
Anti-sense: 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3 «;
MIR-29C ligner negativ kontroll (MiNC):
Sense: 5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′, etter
Anti-sense: 5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 «;
MIR-29C inhibitor (29ci): 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3′
MIR-29c hemmer negativ kontroll (IhNC): 5’UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 «.
Alle disse oligonukleotider ble chemosynthesized fra Extended Nature Biotech, Shanghai.
Cell transfeksjon
95C eller 95D celler ble dyrket til ca 80 % konfluens i 6-brønners plater og ble transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene i hver brønn av en 6-brønns plate ble transfektert med 100 nM etterligner eller 200 nM inhibitor. 24-48 timer etter transfeksjon, ble cellene høstet for videre eksperimenter, inkludert spredning, adhesjon, migrasjon og invasjon.
celleproliferasjon analyser
Spredning av de transfekterte cellene ble evaluert av MTT analyse. Omtrent 2 x 103 celler ble sådd i en 96-brønns plate med 100 ul medium i hver brønn. Etter 24 h, 48 h 72 h og 96 h, 20 ul MTT (5 mg /ml) ble tilsatt i en 96-brønnplate og inkubert i 4 timer før lest ved 530 nm på en plateleser. Alle uavhengige forsøk ble kjørt i tre eksemplarer.
Cell adhesjon til ekstracellulære matriks (ECM) analyser
transfektert celle adhesjon til Matrigel ble evaluert av MTT-analyse og telling. I MTT-analyse, 96-brønners plater ble for-belagt med 40 ul av 50 ug /ml Matrigel (BD Biosciences, USA) og deretter 1 x 104 celler ble sådd ut i hver brønn i en 96-brønns plate med 100 ul medium og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Neste utførte vi MTT-analysen beskrevet tidligere etter tre ganger vasket bort de ikke-adherente celler med PBS. I tellingen analysen, ble det 95D og 95C celler transfektert med lentivirus av NC-CMV-GFP-LV (Shanghai Genechem) til stabilt uttrykker GFP-genet. De 95D-GFP og 95C-GFP-celler ble transfektert med 100 nM etterligner eller 200 nM inhibitor, henholdsvis, trypsinert, vasket to ganger i 1 x PBS, og deretter 1 x 104 celler with100 ul medium ble sådd ut i hver brønn i en 96-brønners plate forhåndsbelagt med 40 ul av 50 ug /ml Matrigel og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 30 min.The ikke-adherente celler ble vasket 3 ganger med PBS, og antall celler som fester seg til Matrigel ble tellet under en invertert mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) 100 × forstørrelse fra 3 tilfeldig utvalgte grønne felt i hver brønn. De uavhengige forsøk ble kjørt i tre ganger.
Cell migrasjon og invasjon analyser
Potensialet for migrasjon og invasjon av transfekterte celler ble evaluert av en transwell analysen. I migrasjonsanalysen, 2,5 x 104 celler ble dyrket i 200 ul medium med 1% kalve bovint serum i det øvre kammer av et ikke-belagt transwell innsats. I det nedre kammer, ble 600 ul medium med 10% kalve bovint serum anvendt som en chemo-tiltrekningsmiddel for å stimulere cellemigrering. I invasjonen analysen, ble det øvre kammer i transwell innsatser belagt med 50 ul 2,0 mg /ml Matrigel, og 5 x 104 celler ble sådd ut i det øvre kammer av Matrigel-belagte transwell innsats. Celler av begge analysene ble inkubert i 24 timer og celler som ikke trekker eller invadere ble fjernet ved hjelp av en bomullspinne. Alle celler ble farget ved bruk av krystallfiolett-farging og tellet under et invertert mikroskop. Vi valgte fire tilfeldige utsikt å telle celler og uavhengige eksperimenter ble gjentatt tre ganger.
Bestemmelse av MIR-29c targeting sekvenser av beregnings prediksjon
Computational spådommen har allerede vist seg å være en effektiv og effektiv metode for å forutsi miRNA målsettinger. Vi brukte TargetScan, PicTar og Miranda å forutsi MIR-29c targeting sekvenser. Målene som ble spådd av de tre databasene og ble knyttet til tumorinvasjon og metastase ble ansett relevant for vår forskning.
Dual-luciferase assay for å fastslå effekten av målet sekvenser av 3′-UTR regionen inte β1 og MMP2
3′-UTR fragment av integrin β1 og MMP2 gener, blant annet MIR-29C bindingssetet, ble forsterket av PCR fra 95D cellen genomisk DNA ved hjelp av følgende primere. PCR primere for integrin β1 var:
Intβ1-
Sal
I-UTR1, 5′-TGGAGCTCTAACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 «(fremover), etter
Intβ1-
Mlu
I-UTR2, 5′-TGACGCGTAACTTCAGTAAATAGCACTGTA-3 «(bakover)
PCR primere for MMP2 var:.
MMP2-
Mlu
I-UTR1, 5′ -TGACGCGTAACTGCCTTCGATACACCGGGCCTG-3 «(fremover), MMP2-
Hind
III-UTR2, 5′-TGAAGCTTGCACATAGAAAGCACTCTATTAATTC-3′ (bakover).
inte β1 og MMP2 genet mutert 3′-UTR fragment som inneholder MIR-29c bindingssetet ble forsterket fra 3′-UTR fragment ved hjelp av følgende primere for inte β1 av Intβ1-
Sal
i-UTR1 + Intβ1-
Mlu
I-
mut
-UTR3 (5′-TGACGCGTGAAGAGGTGACAGAAACTAAGT GACATTAAAC-3 «) og for MMP2 av MMP2-
Mlu
i-UTR1 + MMP2-
Hind
III
-mut -.
UTR (5′-TGAAGCTTGAAGAGCCTGAAGTGTGGCAGCGTCTGGGC-3 «) (understreket baser vise mutasjonen stedet)
forsterket fragment ble klonet inn i pMIR-RAPPORT Luciferase vektor (Ambion, USA) på
Sal
i +
Mlu
i
og Mlu
i +
Hind
III stedet for inte β1 og MMP2 hhv.
95C eller 95D -celler ble ko-transfektert i 24-brønners plater inneholdende 200 ng ildflueluciferase vektor, 40 ng
Renilla
luciferase PRL-TK-vektor (Promega, USA) og 100 nM etterligner eller 200 nM inhibitor. Firefly luciferase fungerte som en reporter gen og
Renilla
luciferase som et normalisert kontroll. De transfekterte celler ble inkubert i 48 timer. Luciferase-aktivitet ble målt ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega, USA).
Western blotting
For isolering av de totale proteiner, behandlede og kontrollceller ble vasket med 1 x PBS, lysert med RIPA-buffer (50 mmol /liter Tris-base, 150 m mol /l NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 1 m mol /l natrium-ortovanadat, 10 m mol /l natrium fluorid, 1% protease inhibitor cocktail) i 15-20 minutter på is. Etter sentrifugering ved 12 000 rpm i 15 minutter, ble supernatantene oppsamlet. og proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved BCA proteinanalyse. 20-30 ug av totale proteiner ble oppløst i SDS-PAGE ladningsbuffer, oppvarmet ved 100 ° C i 5 minutter, separert på 10% polyakrylamidgel, overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences). Membranene ble blokkert i 5% ikke-fettholdig melk i TBST-buffer (Tris-buffer saltløsning inneholdende 0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur, og deretter inkubert over natten ved 4 ° C ved passende fortynnet primære antistoffer for kanin monoklonalt anti humaninte β1 og MMP2 (utvannet 1:1000, Cell Signaling Technology). Etter grundig vasking med TBST-buffer, ble blottene deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter grundig vasking med TBST buffer, ble target proteiner oppdaget av forsterket kjemiluminescens reagenser ECL.
Gelatin zymografi av MMP2 enzymaktivitet
Dette eksperimentet søkt å påvise spesifikke MMP2 og MMP9 enzymaktivitet. Mediene uten serum oppsamlet fra den transfekterte 95C og 95D celler etter 24 timer ble analysert ved hjelp av en gelatin zymografi analysesett (Applygen, Kina). MMP-aktivitet ble målt ved hjelp av SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. Gelen inneholdt 1% gelatin og 30% akrylamid. Elektroforese ble utført ved 4 ° C. Etter vasking med buffer A (inneholdende 2% Triton X-100) fra settet, ble gelen inkubert i 37 ° C med buffer B (inneholdende den nødvendige metallion: 5 mmol /CaCl
2, 1 umol /L ZnCl
2). MMP aktivitet ble visualisert ved farging med Coommasie Blue R-250.
In vivo metastase analyser i hårløse mus xenograft modell
95D og 95C celler ble transfektert med lentivirus av U6-RNAi- (Ubi ) -luc-LV (Shanghai Genechem) til stabilt uttrykke ildflue luciferase i lungekreftceller. De 95D-Luc og 95C-Luc-celler ble transfektert med 100 nM etterligner eller 200 nM inhibitor, henholdsvis, trypsinert, vasket to ganger i 1 x PBS og resuspendert i en konsentrasjon på 1-5 x 10
6 celler /ml i kaldt 1 × PBS. Hunn nakne mus (6-7 uker gamle) ble bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (90-110 mg /kg) og xylazin (10 mg /kg) før intrakardielle injeksjoner og ble plassert i ryggleie. Med en 25-gauge nål, 2-3 x 10
5-celler ble injisert inn i venstre hjertekammer (volum 0,1 ml) etter visualisering av arteriell blodstrømning inn i sprøyten. Etter injeksjon ble musene plassert på varme bur for å komme seg fra anestesi. Cellen-injiserte dyr ble plassert under sterile forhold på Experimental Animal Facility av Tongji University (Shanghai, Kina).
For
in vivo
metastase analysen, lungekreft metastase ble overvåket i levende dyr med selvlysende imaging (BLI) ved hjelp av en LB 983 in-vivo bildesystem (Berthold) starter 3-4 uker etter implantasjon. Femten minutter før
in vivo
BLI, ble dyrene bedøvet med 1-3% isofluran og injisert intraperitonealt med D-luciferin (150 mg /kg i 1 x PBS). Forsøkene ble utført ved bruk av 5 eller 6 mus pr gruppe og gjentatt tre ganger. Utviklingen av benmetastaser ble overvåket ved røntgen-radiografi i 6-8 uker etter injeksjonen. Musene ble bedøvet, plassert på en gjennomsiktig bord i utsatt og lateral stillinger, utsatt for røntgenstråler ved 30 kV og 0,5 mA i 10 s i en Fixitron MX-20 radiografi System ved Institutt for traumatologi Ortopedi, Shanghai Academy of tradisjonell kinesisk medisin.
Statistisk analyse
Kvantitative verdier ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Studentenes
t Hotell og χ
2 tester ble utført for å sammenligne de tilsvarende data. Forskjeller med
P
. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
MIR-29c er nedregulert i high-metastatisk lungekreft celler
i denne studien var 95C og 95D cellelinjer ble valgt fordi de stammer fra samme individ, og det er en dramatisk forskjell i deres metastatiske adferd. Å identifisere differensial uttrykk for miRNAs mellom 95C og 95D celler. Først ble en primær screening utført ved bruk av en enkel Matrigel invasjon transwell assay før miRNA array. Vi fant en signifikant differensial uttrykk for miRNAs mellom 95C og 95D celler ved hjelp av miRNA array (Detaljer i tabell S1). For å studere mulige rolle mirnas som hemmer lungekreft celle metastase og potensielle kandidater målrette gener, vi fokusert på MIR-29c fordi den er nedregulert i høy metastatisk 95D celler og oppregulert i lav-metastatisk 95C celler. Funnene kan tyde på MIR-29c funksjon som en svulst metastase lyddemper. Dataene fra QRT-PCR ytterligere bekreftet de ulike uttrykk nivåer av MIR-29c mellom 95C og 95D celler. Dette resultatet er i samsvar med de miRNA matrise resultater. (MIR-29c viste en 3,8 fold ganger høyere i 95C enn 95D fra figur 1A).
(A) QRT-PCR av MIR-29c i 95D og 95C cellelinjer. Endringen ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt relativ kvantitativ analyse; **
p
0,01 (Student
t
-test). Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger (n = 3). (B) MIR-29c hemmer celledeling i 95D celler ved MTT-analyse. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (C) MIR-29c inhibitor økt cellulær proliferasjon i 95C-celler med MTT-analyse. **
p
. 0,01 (Students
t
-test, n = 3)
MIR-29c undertrykker celleproliferasjon i 95D celler
For å finne ut om MIR-29c undertrykker lungekreft celleproliferasjon, MIR-29C ligner (MIR-29C) og etterligner negativ kontroll (MiNC) ble transfektert inn 95D celler, mens MIR-29C inhibitor (29ci) og inhibitor negativ kontroll ( IhNC) ble transfektert inn i 95C celler. MTT-analyser ble gjennomført for å måle celleproliferasjon. Resultatene (figur 1B) antyder at MIR-29c har en hemmende virkning på proliferasjonen av 95D-celler. Det var ingen forskjell på 24 timer i spredning av 95D celler mellom MIR-29c og MiNC grupper (
p
0,05). Imidlertid, var det en betydelig forskjell mellom de to gruppene etter 48 timer, 72 timer og 96 timers inkubering (
p
0,01). De inhiberende effektivitet var 37,5%, 54,4% og 40,3% (fig. 1B), respektivt. Derfor MIR-29c hemming av 95D celleproliferasjon er en tidsavhengig prosess.
I 95C celler transfektert med MIR-29C inhibitor (MIR-29ci), spredning økt i en tidsavhengig måte. De spredning priser mellom Mir-29ci og IhNC gruppene varierte ikke (
p
0,05) ved 24 h poenget med inkubasjon. Det var imidlertid en statistisk signifikant mellom de to gruppene etter 48 timer, 72 timer og 96 timers inkubering med spredningshastigheter på 15,2%, 13,7% og 10,4% (figur 1C,
p
0,01), henholdsvis. Derfor MIR-29c forfremmet 95C celleproliferasjon i en tidsavhengig måte.
MIR-29c hemmer celle vedheft til ECM in vitro
Adhesjon til ECM er et viktig skritt når kreftceller plante selv i fjerne steder i løpet av metastasering. Matrigel inneholder kjellermembrankomponenter kan simulere celle adhesjon
in vitro.
Vi tok fordel av denne egenskapen, og utført en vedheft analysen. I 95D celler transfektert med MIR-29C ligner (MIR-29C) og etterligner negativ kontroll (MiNC), antall celler som holder seg til Matrigel sunket betraktelig (
p
0,01, Figur 2 A-C ) etter MIR-29c transfeksjon forhold til de transfektert med MiNC. Men i 95C celler transfektert med MIR-29C inhibitor (29ci) og inhibitor negativ kontroll (IhNC), har MIR-29c hemmer betydelig økt 95C vedheft til matrigel når celler transfektert med MIR-29c hemmer sammenlignet med dem tilført med IhNC (
p
0,01, Figur 2 D-F). Disse resultatene indikerer at mir-29c kan redusere antall adhesjons-celler i høy-metastase 95D-celler, mens inhiberingen av mir-29c kan økes celleadhesjon ved lave metastatiske 95C-celler (figur 2).
( A) 95D-celler transfektert med MIR-29C etterligner adhesjon til Matrigel ble målt ved å telle som beskrevet i Materialer og Metoder. Representative felt av 95D 29C og 95D MiNC (forstørrelse x 100). (B) Gjennomsnittlig vedheft celle nummer per tilfeldig felt. **
P
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (C) MIR-29c hemmer 95D celle adhesjon (MTT analyse). **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (D) Representative felt fra 95D 29ci og 95C IhNC lungekreftceller (forstørrelse x 100). (E) Gjennomsnittlig vedheft celle nummer per tilfeldig felt. **
P
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (F) Suppression of Mir-29c forbedret celle adhesjon i 95C celler (MTT assay). **
p
. 0,01 (Students
t
-test, n = 3)
MIR-29c hemmer celle invasjon og migrasjon in vitro
Transwell-analyse er mye brukt til å måle cellulær oppførsel under migrasjon og invasjon, viktige skritt i tumormetastaser. Vi satt en Matrigel membran eller transwell seg med en chemo-attractant å simulere celle invasjon og migrasjon atferd
in vitro
. I 95D celler etter MIR-29c og MiNC transfeksjon, ble en synlig signifikant forskjell sett med færre Mir-29C transfekterte celler telles enn MiNC transfekterte celler (celletall redusert 104,2% i migrasjon analysen og 136% i invasjonen assay,
p
0,01). Dette funnet kan tyde på at oppregulering av MIR-29c hemmer celle invasjon og migrasjon (figur 3A og B). I kontrast, transfeksjon av 95C celler med MIR-29c hemmer og IhNC viste en motsatt resultat; mer MIR-29C hemmer transfekterte celler gått gjennom matrigel og transwell membran (celle tall økt ca 79,7% i migrasjon analysen og 97,4% i invasjonen analysen,
p
0,01) sammenlignet med 95C celler transefected med IhNC (figur 3 C og D). Disse dataene viser at Mir-29c påvirket celle invasjon og migrasjon atferd
in vitro
.
(A) I en Matrigel invasjonen assay, MIR-29C ligner transfektert 95D celler vs MiNC transfektert celler i en 200 × lys omfang etter krystallfiolett farging. (B) Matrigel invasjonen og transwell migrasjon: 95D celler ble talt i en lys omfang i fire tilfeldige visninger. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 4). (C) I en Matrigel invasjon assay, MIR-29c inhibitor transfektert 95C-celler vs IhNC transfekterte celler i en 200 x lys omfang etter krystallfiolett farging. (D) Matrigel invasjonen og transwell migrasjon: 95C celler ble talt i en lys omfang i fire tilfeldige visninger. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 4)
MIR-29c rettet mot 3′-UTR av inte direkte. β1 og MMP2 genet
For ytterligere å utforske de mekanismer som MIR-29c undertrykker lungekreft celle invasjon og metastasering, analyserte vi sannsynlige nedstrøms tumor metastaserelaterte gener. Beregnings forutsigelse ble brukt til å finne ut den mest sannsynlige målgenet. Vi tok fordel av TargetScan, PicTar og Miranda databaser over spådd mikroRNA mål å analysere taregets av MIR-29c. 3′-UTR av inte β1 (Intβ1) og MMP2 bærer MIR-29C-bindingssteder. 3′-UTR av inte β1 og MMP 2 av MIR-29C-bindingsseter har svært konservative sekvenser i pattedyr (Figur 4A og D). Studiene i de antatte funksjoner av MIR-29c i cellulær adhesjon og invasjon oppmuntret oss til videre forskning på integrin β1 og MMP2.
(A) konservert målretting av 3′-UTR av menneske int β1 av speil 29C (understreket). Vill-type og mutante sekvenser av int β1 3′-UTR er angitt for sammenligning. (B) Dual-luciferase reporter analysen for target gen int β1 i 95D celler transfektert med MIR-29C etterligner. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (C) To-luciferase reporter assay for target-genet int β1 i 95C-celler med eller uten transfeksjon mir-29C-inhibitorer. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (D) MIR-29c bindingsseter i MMP2 3’UTR regionen (understreket); bindingssetet er sterkt konservert i virveldyr, inkludert mennesker. De villtype og mutante sekvenser av MMP2 3’UTR er oppført for sammenligning. (E) Dual-luciferase reporter analysen av MMP2 mRNA i 95D celler transfektert med MIR-29C etterligner. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 3). (F) Dual-luciferase reporter analysen av MMP2 mRNA i 95C-celler med eller uten transfeksjon mir-29C-inhibitorer. **
p
0,01 (Student
t
-test, n = 3)
For å avgjøre om inte β1 og MMP2 blir undertrykt av speil. 29c gjennom binding til deres mRNA 3′-UTR, utførte vi en dual-luciferase-analysen for å verifisere forholdet mellom de to målgenet og MIR-29C. Villtype og mutant grin β1 og MMP-2 mRNA 3′-UTR ble satt inn i nedstrømsområdet av et luciferase reporter-gen fra pMIR-RAPPORT vektor, og nemlig villtype-integrin β1 3′-UTR vektor, MMP 2 3 «-UTR vektor, mutant integrin β1 3′-UTR-vektoren og mutant MMP2 3»-UTR vektor, respektivt. Vi brukte pMIR-RAPPORT Luciferase vektor som en kontroll fordi det ikke ville bli påvirket av eventuelle MIR-29C etterligner eller hemmer, og kan også fungere som en standard kontroll for transfeksjon effektivitet. Derfor
Renilla
luciferase vektor (PRL-TK vektor) og ildflue luciferase vektor ble ko-transfektert med etterligner eller hemmer. I 95D celler med MIR-29C etterligner, ble luciferase-aktivitet av villtype-integrin β1 og MMP2 vektor relative forholdet inhibert omtrent 2,00 ganger sammenlignet med kontrollen (Fig 4 B og C,
p
0,01) . Selv om mutant integrin β1 og MMP2 vektor i 95D-celler viste en lavere luciferase-aktivitet enn kontrollen, var det ingen signifikant forskjell (
p
0,05). I 95C-celler, inhibering av MIR-29c har økning av integrin β1 og MMP2 luciferase-aktivitet (figur 4 E og F
p
0,01) sammenlignet med celler som ikke var stimulert med MIR-29c inhibitor på grunn av integrin β1 og MMP2 vektor luciferaseaktivitet, som ble inhibert av endogen MIR-29c. Tilsvarende mutante integrin β1 og MMP2 i 95C-celler viste ingen signifikant reaksjon på styre (
p
0,05). Angivelig, mål MIR-29c integrin β1 og MMP2 direkte siden gain-of-funksjon av MIR-29c i 95D celler betydelig redusert inte β1 og MMP2 vektor luciferase aktivitet, og tap-av-funksjon av MIR-29c inhibitor i 95C celler viste at inte β1 og MMP2 beholder sin uttrykksnivået kun når cellene ikke blir utsatt for MIR-29C inhibitor (figur 4).
MIR-29c hemmer endogent protein uttrykk for den integrin β1 og MMP2
for ytterligere undersøkt effekten av MIR-29c på inte β1 og MMP2 protein uttrykk ved Western blotting. I 95D-celler transfektert med MIR-29C etterligner, ekspresjonen av integrin β1 og MMP2 på proteinnivåene var betydelig mindre enn den for den negative kontrollen av celler transfektert med MiNC (figur 5,
p
0,01) . I 95C celler, sammenlignet med celle transfektert med IhNC, Western blotting Resultatene indikerte integrin β1 og MMP2 preotein uttrykk ble oppregulert etter transfektert med MIR-29c inhibitor i 95C (Figur 5,
p
0,01). Disse dataene viser integrin β1 og MMP2 er direkte mål av MIR-29.
(A) Effekter av MIR-29c på endogent inte β1 protein.
