Abstract
Karakteristiske genotypiske og fenotypiske trekk ved eggstokkreft via epitel-mesenchymale overgang (EMT) har blitt korrelert med legemiddelresistens og tilbakefall av sykdommen. Vi undersøkte om terapeutisk reversering av EMT kunne re-bevisst eggstokkreft celler (OCCS) til eksisterende kjemoterapi. Vi rapporterer at epimorphin, en morphogenic protein, har sentral kontroll over mesenchymale versus epitelceller avstamning avgjørelse av de antatte OCCS. Eksponering for epimorphin indusert morfologiske endringer som minner av mesenchymale-til-epitelial overgang (MET), men på en doseavhengig måte, dvs. ved 10 ug /ml av epimorphin celler oppnå en mer mesenchymale-lignende morfologi, mens på 20 ug /ml av epimorphin cellene vise en epitelial morfologi. De sistnevnte endringer ble ledsaget av undertrykkelse av mesenchymale markører, for eksempel vimentin (~8 ganger ↓,
p
0,02), Twist1 (~ 7 ganger ↓,
p
0,03), dystroglycan (~4 ganger ↓,
p
0,01) og Palladin (~3-fold ↓,
p
0,01). Omvendt betydelige økninger i KLF4 (~28 ganger ↑,
p
0,002), β-catenin (~6 ganger ↑,
p
0,004), EpCAM (~ 6-fold ↑,
p
0,0002) og occludin (~15 ganger ↑,
p
0,004) mRNA som en del av satsingen på epitelceller avstamning ble påvist i respons på 20 ug /ml av eksogent epimorphin. Endringer i occludin mRNA nivåer ble ledsaget av en parallell, om enn svakere uttrykk på proteinnivå (~ 5 ganger ↑,
p
0,001). Likeledes, oppkjøp av epitel-lignende egenskaper, inkludert mucin1, CK19, og β-catenin genekspresjon, ble også oppnådd følgende epimorphin behandling. Videre ble MMP3 produksjon funnet å være redusert, mens laminin sekresjon ble sterkt amplifisert ved epimorphin-indusert MET. Disse resultatene antyder at det er en dosering vindu for handlinger epimorphin på cellulær differensiering, karakterisert ved at det enten kan undertrykke eller forbedre epitelial differensiering av OCCS. Viktigere, induksjon av epitel-lignende fenotyper av epimorphin ført til en økt følsomhet for karboplatin. Samlet sett viser vi at epimorphin kan gå tilbake OCCS bort fra sin mesenchymale fenotype og mot en epitelial fenotype, og dermed styrke deres følsomhet for en front-line kjemoterapeutisk middel
Citation. Yew KH, Crow J, Hirst J, Pressetto Z, Godwin AK (2013) Epimorphin-Induced MET sensitizes eggstokkreft celler til Platinum. PLoS ONE 8 (9): e72637. doi: 10,1371 /journal.pone.0072637
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 10 april 2013; Godkjent: 11 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Yew et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet delvis av et program prosjektstøtte fra Ovarian Cancer Research Fund (https://www.ocrf.org), et stipend fra Kansas Biovitenskap Tilsynet Eminent Scholar program, og et stipend fra NCI (R01CA140323) til AKG Forfatterne ønsker også å erkjenne støtte fra University of Kansas Cancer Centers (KUCC) (P30 CA168524) delte ressurser og University of Kansas Endowment Association. A.K.G er Chancellors Distinguished Chair i biomedisin ved KUCC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er en ledende årsak til død hos kvinner, ofte på grunn av sent stadium anerkjennelse og aggressiv svulst tilbakefall. Høy pasient sykelighet skyldes delvis tilbakevendende vekst av rest ovarietumorceller som blir motstandsdyktige mot vanlige kjemoterapeutiske behandlinger, og deretter aggressivt sprer og spre eller metastaserer til flere nettsteder. Nyere studier har vist at de eggstokkreft celler med epithelial funksjoner er faktisk mer følsom for kjemoterapiregimer sammenlignet med tumorceller med mesenchymale trekk [1], [2], [36]. Imidlertid, når disse cellene gjennomgå epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), blir de mindre mottakelige for konvensjonelle terapeutiske regimer [1] – [3], [36]. EMT, indusert av en rekke stimuli og cytokiner, har blitt fremtredende innblandet som et middel som differensiert EOCs gjennomgå en fenotypisk konvertering som er knyttet til tap av epitelceller egenskaper (f.eks occludin) og oppkjøpet av mesenchymale markører (for eksempel vimentin). Derfor kan reversering av EMT (dvs. MET) gjengi kreftceller mer utsatt for førstelinje anti-kreft narkotika og potensere apoptotiske effekten av visse kjemoterapeutika.
Epimorphin, også kjent som syntaxin-2, er en viktig formidler av en rekke fundamentale prosesser i embryoutvikling, og ofte spiller en avgjørende rolle i regionen mesenchyme-epitel interaksjoner [4] – [8]. Senere studier har også vist at epimorphin medierer epitelial mønster og morfogenese i mange vev, som for eksempel pankreatiske kanaler [5], brystkjertel [6], lunge [7], og liten tarmepitelet [8]. Mens epimorphin ser ut til å bli uttrykt i pattedyr eggstokk og testis [9], den presise mekanismen som denne mesenchymale morfogen utøver sin regulerende effekt på menneskers gonadene er fortsatt i stor grad ukjent.
Selv om beslektet epimorphin reseptoren og dens nedstrøms signal mekanismen er ikke ennå blitt identifisert, og epimorphin blitt funnet å binde til αV integrinreseptorer på bryst epitel-celler [10] og EGF-reseptorer på intestinale epitelceller [11] som aktiverer transkripsjonsfaktorer CCAAT /forsterker bindingsprotein (C /EBPα og β) [12], [15] og NF-kB [13]. Interessant, krueppel-lignende faktor 4 (KLF4), en sink-finger transkripsjonsfaktor uttrykt i epitelceller hos flere organer [16], er blitt vist å binde direkte til C /EBPβ promoteren [17] og samhandle med NF-kB-subenhet p65 [18], som regulerer lunge epitelial differensiering under organ [19] og melke epitelial forgrening [20], respektivt. Videre undersøkelser har indikert at epimorphin kan indusere epitelial morfogenese ved å regulere urokinase-plasminogen-aktivator (uPA) [13], [14] samt involucrin og cytokeratin [15].
Med den foreslåtte rolle som en epimorphin pro-epitelial faktor i forskjellige vev [5] – [8], evaluert vi hvorvidt epimorphin signalering kan være i stand til å indusere eggstokkreft celler med mesenchymale trekk mot epitelcelle avstamning og hvorvidt denne konverteringen kan føre til økt sensitivitet til standard kjemoterapeutika .
Materialer og metoder
Reagenser
Fetal Bovine Serum, SYBR Green, Reference Dye for kvantitativ PCR, og proteasehemmer Cocktail ble hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Medium RPMI 1640 ble erholdt fra Gibco /Invitrogen. RNeasy Mini Kit, Sensiscript® revers transkriptase Kit, QIAamp DNA Micro Kit, og QIAquick Gel Extraction Kit ble alle kjøpt fra Qiagen (Valencia, California). AmpliTaq gull med GeneAmp 10X PCR Buffer og MgCl
2-løsning ble oppnådd fra Applied Biosystems (Foster City, CA).
Cell Culture and Treatment
Den menneskelige eggstokkreft celler (OCCS) , A1847, A2780 og OVCAR10 er blitt beskrevet tidligere [21] og ble anvendt i alle forsøk. Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% (v /v) føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 0,2 enheter /ml humant insulin, 50 enheter /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i henhold en fuktet tilstand på 95% luft og 5% CO
2. A1847 og A2780 ble platet ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml i 24-brønners plater og ble behandlet med enten 10 ug /ml eller 20 pg /ml epimorphin (R . Cell Signa Tech, Danvers, MA) i en fuktig kammer over natten ved 4 ° C. På neste dag ble cellene renset med PBS. Etter flere vasker, ble dekk inneholder celler montert på lysbilder i VECTASHIELD® monteringsmedium med DAPI (Vector Labs, Inc, Burlingame, CA). Fluorescens digitale bildene ble tatt med et Nikon Eclipse 80
i
(Melville, New York) mikroskop festet med et Nikon Q-økende kamera adapter. MetaMorph Bildeanalyse (versjon 7.7.0.0) ble brukt til å erverve og analysere bildene.
SDS-PAGE og Western Blot analyse
Proteiner ble separert på en 10% Tris-HCl Ready Gel ( Bio-Rad, Hercules, CA), overført på nitrocellulosemembraner, og inkubert med monoklonalt muse [ab6276] p-aktin ved en fortynning på 1/5000, muse-monoklonalt [ab28081] til mucin-en ved en fortynning på 1/1000 , musemonoklonalt [ab7754] for å cytokeratin 19 (CK-19) ved en fortynning på 1/1000 eller kanin polyklonale [ab31721] til occludin ved en fortynning på 1/250 i 2 timer ved RT. Alle Western blot-antistoffer ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). Etter inkubasjon ble membranene vasket 3 ganger i 15 minutter i vaskebuffer (PBS-0,05% Tween 20) og inkubert med et sekundært anti-mus (β-actin, mucin-1, vimentin, Adin, og cytokeratin 19) eller anti- kanin (occludin) antistoff koblet til pepperrotperoksidase (Vector Labs, Burlingame, CA) for en time ved RT. Deretter ble membranene vasket 3 ganger i 15 minutter i vaskebuffer, og immunoreaktivitet ble normalisert ved kjemiluminescens (Amersham ECL + Plus Kit) i henhold til produsentens instruksjoner. Membranene ble utsatt for Kodak vitenskapelig bilde filmer (Rochester, NY) innen 1 min for gjenkjenning. Pixel tettheter av blot bildene ble beregnet ved hjelp av Image-J-programvaren (NIH). Endringer i proteinnivåer ble normalisert til kontroller og uttrykt som ganger endring i forhold til kontrollene.
Måling av cytokiner
For å screene for epimorphin-indusert ekstracellulære matrise sekresjon, A1847 OCCS (4 × 10
4 celler /ml i 24-brønners plater) ble inkubert med media alene (negativ kontroll), 10 ug /ml eller 20 pg /ml epimorphin i 3 dager. Laminin (Millipore, Temecula, CA) og MMP3 (R OVCAR10 ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /ml i 48-brønners plater og ble dyrket med epimorphin ved en konsentrasjon på 20 mikrogram /ml i 3 dager. Epimorphin-behandlede og ubehandlede celler ble deretter dyrket med en seriell dose av karboplatin (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) for ytterligere 3 dager. Karboplatin doseområde for epimorphin-behandlede og ubehandlede A1847 var 1 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 200 uM, og 400 uM. Karboplatin doseområde for epimorphin-behandlede og ubehandlede A2780 var 1 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 150 uM, og 200 uM. Karboplatin doseområde for epimorphin-behandlede og ubehandlede OVCAR10 var 50 uM, 100 uM, 150 uM, 200 uM, 400 uM, og 500 uM. Celleviabilitet ble bestemt ved å måle metabolsk aktivitet ved hjelp CellTiter-Blue® av Promega og plater ble fotografert på Tecan fluorometer. Data ble deretter normalisert til prosentvise inhibering og IC
50 konsentrasjoner av karboplatin ble bestemt for epimorphin-behandlede og ubehandlede celler av Sigmaplot plotteprogram (Systat Software). Celledød eller apoptose ble kvantifisert ved hjelp av Guava nexin Annexin V analysen via en Guava EasyCyte HT flowcytometer (Guava Technologies, Hayward, CA). Den nexin-analysen benytter to farvestoffer: 7-AAD, en celle impermeant fargestoff, som en indikasjon på membran strukturell integritet og Annexin V-PE for å detektere fosfatidylserin på den ytre membran av apoptotiske celler. Prøver ble fremstilt i henhold til produsentens spesifikasjoner. Data ble normalisert til kontrollene og er representert som betyr ± standardavvik
Statistical Analysis
Data ble analysert ved hjelp av Microsoft Office Excel 2010 og uttrykt som betyr ± S.D. der det er hensiktsmessig. To gruppesammenligninger ble evaluert ved hjelp av uparet t-test. Verdier av p. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
morfologiske og molekylære effekter av Epimorphin Associated med MET i eggstokkreft celler
Tidligere arbeider har innblandet epimorphin som formidlere av epithelial morfogenese i forskjellige organer og celler [4] – [13]. Likevel, lite er kjent om den mekanismen som epimorphin mediere slike effekter i eggstokkreft celler. Vi først benyttet en ELISA Kit for å sammenligne nivåene av epimorphin i forskjellige ovarie cancer cellelinjer med adipose-avledede stamceller som ble brukt som positive kontroller. Den endogene produksjonen epimorphin var forholdsvis lav (område: 0,1 til 0,3 ng /ml) på tvers av alle ovarie cancer-cellelinjer som ble testet i forhold til adipose-avledede stamceller (område: 10-12 ng /ml) (data ikke vist). Vi deretter bestemt den optimale tid og dose epimorphin behandling for å indusere MET i eggstokkreft cellelinje, A2780. Nyere studier har vist at 20 ug /ml epimorphin var i stand til å aktivere MEK-ERK1 /2 pathway (11) og indusere differensiering MMP’er (13). For å vurdere doseavhengig respons på eggstokkreft celler, må vi først gjennomført en bred dose-respons (2-20 ug /ml) av epimorphin hjelp A2780 celler. Vi har funnet etter 3-dagers ved 20 ug /ml av epimorphin, A2780 celler gjennomgikk vesentlige morfologiske endringer (fra mesenchymale til epitel) og analysert ved hjelp av fasekontrast lysmikroskopi, immunoblotting og real-time kvantitativ RT-PCR, mens 2 pg /ml epimorphin fremkalte ingen cellulære responser (data ikke vist). Vi evaluerte ved den optimale dose av epimorphin og fant at både A2780 og A1847 behandlet med den lavere dose (10 mg /ml) av epimorphin oppviste et mer stel og langstrakt mesenchymale-lignende utseende (figur 1B 0,056) (Fig. 2B) og KLF4 (~28 ganger ↑
p
. 0,002) (figur 2C), ble funnet å være signifikant forhøyet, noe som tyder på at C /EBPβ og KLF4 kan være viktige regulatorer av epimorphin mediert MET. Tilsvarende mRNA nivåer av β-catenin (~6 ganger ↑,
p
0,004) (Fig. 2D), occludin (~15 ganger ↑,
p
0,004 ) (figur 2E) og EpCAM (~6-fold ↑,
p
.. 0,0002) (figur 2F) ble funnet å være sterkt oppregulert ved den høyeste dosen av epimorphin, igjen indikerer støtter omdannelse til en epitel-lignende fenotype. Molekylære markører for mesenchymale fenotype, for eksempel TWIST1 (fig. 2G), ble vimentin (fig. 2H), dystroglycan (fig. 2I) og Adin (fig. 2J), undertrykket med 20 ug /ml epimorphin men økte signifikant ved stimulering av A1847 med en lavere dose av epimorphin, noe som tyder på at bryteren mellom mesenchymale og epitel-fenotyper er sannsynlig å være doseavhengig.
A2780 og A1847 ble inkubert med 10 ug /ml eller 20 pg /ml epimorphin for tre dager. A-F: Epimorphin (20 ug /ml) induserte en avrundet brostein, epitel-lignende utseende både A2780 (C) og A1847 (F). Til sammenligning epimorphin ved 10 ug /ml føre til en mer langstrakt mesenkymale morfologi i begge A2780 (B) og A1847 (E) sammenlignet med ubehandlede kontroller (A og D). Bilder av celle morfologi ble tatt på 10X forstørrelse, med minst 3 bilder per brønn, ved hjelp av en oppreist fasekontrastmikroskop (T3.15A; Fisher Scientific)
A og B:. ΑV-inte reseptor (A) og C /EBPβ (B) viste markert økning av mRNA-nivåer i respons til 20 ug /ml av epimorphin. C-F: Epithelial markører som KLF4 (C), β-catenin (D), occludin (E), og EpCAM (F) ble funnet å være oppregulert ved eksogent 20 ug /ml av epimorphin. G-J: Ekspresjon av mesenchymale markører TWIST1 (G), vimentin (H), dystroglycan (I) og Adin (J) ble nedregulert etter behandling med epimorphin (20 ug /ml). Imidlertid ble alle fire mesenchymale markører (G-J) funnet å være oppregulert ved 10 ug /ml av epimorphin (gjennomsnitt ± SD, n = 3) [*
p
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen].
effekter av Epimorphin på genekspresjon fenotyper i A1847
i et forsøk på å ytterligere bekrefte induktive effekten av epimorphin på fenotypiske endringer, immunoblotting og ELISA ble utført for å bestemme protein uttrykk profilen både epiteliale og mesenchymale markører. Kvantitativ analyse av occludin protein i A1847 viste at behandling med høyere doser epimorphin øket occludin ekspresjon av fem-folder (fig. 3) i forhold til ubehandlet, i samsvar med det resultat som observeres med de mRNA-nivåer (fig. 2E). Likeledes, ble tilsvarende økninger oppnådd for CK-19 og mucin-1 (fig. 3), igjen impliserer at epimorphin-behandlede A1847 gjennomgå fenotypiske forandringer forbundet med MET. Men uttrykket av mesenchymale gener, Palladin og vimentin (figur S1) økte med 1- og 2-fold, henholdsvis i A1847 behandlet med 10 mikrogram /ml epimorphin, igjen tyder på at induksjon av EMT eller MET svar på epimorphin er toveis avhengig av den påførte dose. Vi neste utført ELISA-analyser for å bestemme utgivelsen av proteiner assosiert med epiteliale og mesenkymale fenotyper. Interessant, sekresjon av laminin (fig. 4A), et ekstracellulært glykoprotein essensiell for utviklingen av epitelcelle polaritet, ble funnet å være forhøyet i betydelig grad ved behandling av A1847 med epimorphin. Omvendt, produksjon av MMP3 (Fig. 4B), en mesenchymale markør viktig for kreftcelleinvasjon og migrasjon, ble funnet å bli redusert etter 20 pg /ml epimorphin behandling, men sterkt oppregulert ved 10 ug /ml. Samlet utgjør disse data viser at det er progressiv engasjement ovarietumorceller mot en epitelial avstamning når dyrket med en tilstrekkelig dose av epimorphin.
Protein uttrykk for epitel-assosiert markører, f.eks mucin-1, CK -19 og occludin ble evaluert av immunoblotting og bandet tettheter ble kvantifisert av Image-J programvare. Fold økning i protein ekspresjon av behandlede (20 pg /ml epimorphin) i forhold til ubehandlet A1847: 2,5-ganger økning i CK-19; 1,5 ganger økning for mucin-1, og 4,5 ganger økning for occludin. β-actin tjente som lasting kontroll. (Gjennomsnitt ± S.D., n = 3). [*
p
0,05 sammenlignet med kontroll]
Utskillelse av laminin (epithelial markør) og MMP-3 (mesenchymale markør) var tiltaket ved ELISA etter behandling av A1847 eggstokkene. kreftceller med epimorphin i 3 dager (ved 10 eller 20 ug /ml). Eksponering for epimorphin (20 ug /ml) signifikant øket produksjon laminin og føre til en reduksjon i MMP-3-sekresjon når sammenlignet med kontrollen. Til sammenligning ble MMP-3 frigivelse forsterkes når A1847 ble behandlet med den lavere konsentrasjon av epimorphin (10 ug /ml), igjen antyder epimorphin kan indusere fenotypiske forandringer i eggstokkreft celler på en doseavhengig måte (gjennomsnitt ± SD, n = 3 ) [*
p
0,05 sammenlignet med kontroll]
Epitelial Differensiering i Response til eksogene Epimorphin
β-catenin, en nøkkelfaktor i Wnt. signalveien, er blitt vist å bestemme epitelcelle skjebne under embryonal utvikling av eggstokk [23]. Tap av β-catenin sent i fosterutviklingen førte til dyptgripende feil i epitel modning ved voksen alder [24]. For ytterligere å undersøke hvorvidt den epimorphin-mediert MET er forbundet med økt ekspresjon av endogen β-catenin, benyttet vi farging for β-catenin for å vurdere epitelcelle-differensiering av epimorphin-behandlede A1847. Både ubehandlet A1847 og OVCAR10 hadde få β-catenin-positive celler; men viste fremtredende utvidelse av området ved og rundt celle-celle veikryss, spesielt i epimorphin behandlet A1847 og OVCAR10 (Fig. 5). En økning i β-catenin-positive celler sett i epimorphin-behandlede A1847 og OVCAR10 representerte en form av dose-responsen til disse cellene til 20 mikrogram /ml epimorphin. Denne eksperimentelle bevis peker på en rolle for epimorphin signalering i induksjon av β-catenin differensiering, som kan være en viktig bestemmende faktor for epitelisk linjen engasjement i ovarietumorceller. Videre FACS-analyse identifiserte en underfraksjon av A1847-celler med oppregulert EpCAM (epitelial markør) og vimentin nedregulert (mesenchymale markør) etter behandling med 20 ug /ml epimorphin (figur S2 epimorphin-behandlede A1847 (D-F) og OVCAR10 (J-L). Immunfarging analyse viste økt ekspresjon av β-catenin-positive celler i epimorphin-behandlede A1847 (D L) sammenlignet med ubehandlede kontroller (C I).
Cell Livskraftig og Annexin-V aktivitet i carboplatin-indusert apoptose i Epimorphin behandlet OCCS
for å finne ut om carboplatin kan fortrinnsvis drepe eggstokkreft celler med flere epitelceller lignende morfologi, sammenlignet vi evne carboplatin å indusere celledød følgende epimorphin- behandling. Som vist i figur 6, karboplatin eksponering føre til en betydelig reduksjon i antall levedyktige celler etter epimorphin indusert MET for A1847 (
p
= 0,005) (Fig. 6A) og A2780 (
p
= 0,007) (fig. 6B) sammenlignet med kontroller. Selv om utviklingen var lik endringen i følsomheten for OVCAR10 (fig. 6C), med eller uten epimorphin var ikke statistisk forskjellig (
p
= 0,170), muligens på grunn av mangel på doseskala ved den høyere enden av området for plotting og modellering responsdata. Fluorkrom-merket Annexin V ble anvendt for å identifisere apoptotiske celler [25], [26]. Som vist i figur 6D-6F, ble induksjon av apoptose er observert i de tre epimorphin behandlede OCCS, inkludert mer karboplatin-resistent cellelinje, OVCAR10 sammenlignet med de ubehandlede OCCS. Prosentandelen av apoptotiske celler økte i epimorphin-behandlede celler med økende konsentrasjoner av karboplatin (fig. 6D-6F). Disse resultatene tyder på at OCCS med mesenchymale funksjoner blir mer følsomme for karboplatin-indusert apoptose etter epimorphin forbundet differensiert til en epitelial-lignende tilstand. Viktigst er at når evaluert ved anvendelse av 10 ug /ml epimorphin, som ikke klarer å indusert MET, de tre ovarian cancer-cellelinjer undersøkt (det vil si, A1847, A2780 og OVCAR10) viste økt motstand mot karboplatin som målt ved CellTiter® blå (figur S4). Disse resultatene understreker at reversering av EMT kan tjene til å hjelpe ytterligere bevissttilbakevendende sykdom til Frontline terapi. Siden øket celleproliferasjon kan dramatisk innvirkning karboplatin motstand og platina stoffer bare skader cellene i S-fasen av cellesyklusen, er manuelle celletellinger ved bruk av et hemocytometer blitt utført for å kontrollere spredning ved slutten av kulturen. Lite til ingen endring på cellevekstrater ble observert for epimorphin behandlet sammenlignet med ubehandlede OCCS (data ikke vist)
AF. A1847, A2780, og OVCAR10 ble behandlet med 20 mikrogram /ml epimorphin for 3 dager. Etter 3 dager epimorphin-behandlede og ubehandlede OCCS ble dyrket i triplikat med serie doser av karboplatin i ytterligere 3 dager. Cellelevedyktigheten ble kvantifisert ved anvendelse av en CellTiter Blue® assay (A-C). Apoptose ble kvantifisert ved anvendelse av en Guava nexin assay (D-F). A-C: IC
50 verdier indikerer karboplatin-indusert mer celleviabilitet tap i alle tre epimophin-behandlede OCCS enn de ubehandlede kontroller i en doseavhengig måte. D-F: Påvisning av apoptotiske respons ble funnet å øke i alle tre epimorphin behandlet OCCS med økende konsentrasjoner av cisplatin i forhold til de av de ubehandlede kontroller. Data ble normalisert til kontrollene og er representert som middel ± S.D. [*
p
0,05 sammenlignet med kontroll]. Bilder av apoptotiske celler ble tatt på 10X forstørrelse, med minst 3 bilder per brønn, ved hjelp av en oppreist fasekontrastmikroskop. (T3.15A; Fisher Scientific)
Diskusjoner
montering bevis støtter den kritiske rollen EMT i orkestre embryogenese, vev gjenfødelse, og kreft metastase [1] – [3], [16], [27], [30] – [35]. Genetisk endring og morfologiske endringer moduleres under kreft metastasering, for eksempel tap av epitelceller identitet (f.eks occludin og EpCAM) og kjøp av mesenchymale funksjoner (f.eks vimentin og TWIST1) [1] – [3], [27]. I utvikling, EMT og den motsatte prosessen, MET er en viktig mekanisme i reguleringen av fenotypisk plastisitet som er karakterisert som de cellulære og molekylære hendelser som er involvert i omdannelsen mellom epitel og mesenchyme under embryonal montering og ombygging. Imidlertid, i cancer, kan fenotypisk plastisitet påvirke tumorprogresjon og medikament-effektivitet ved å opprettholde den mesenchymale, invasive fenotype av tumorceller som har gjennomgått EMT i respons til et mangfoldig utvalg av ekstracellulære stimuli eller vekst derivater.
Primær epitelovarialcancer kreft er for det meste utsøkt følsomme overfor platinabaserte terapier. Videre tilbakevendende sykdom reagerer ofte til flere runder med kjemoterapi; men blir progresjonsfrie intervall kortere etter hver syklus, som chemoresistance øker før sykdommen blir uhelbredelig. Mekanismene som fører til resistens er sammensatte; Men nyere studier tyder på at EMT er nært knyttet til respons på behandlingen og generell eller progresjonsfri overlevelse. Det er antatt at indre faktorer avledet fra tumor mikromiljøet indusere epitel-OCCS å gjennomgå dyp fenotypisk omdannelse fra epitel (rund-formet) for å mesenchymale (spindel-formet) morfologi i samsvar med EMT [16], [27], [30] – [ ,,,0],35]. Nyere studier har avdekket at OCCS med epiteliale funksjoner er mer følsomme for kjemoterapiregimer i forhold til mesenchymale kreftceller [1], [2]. Men epithelial OCCS gjennomgår EMT er sannsynlig å indusere ervervet resistens og ikke svarer til konvensjonell medikamentell behandling [1] – [3], [35]. Således hypoteser vi at reversering av EMT fenotype kunne bidra til å løse platina-forbundet motstand.
Noen strategier har blitt benyttet for å fremme omdannelsen av mesenchymale kreftceller mot et mer epitel-lignende fenotype som kjennetegnes ved tap av mesenchymale fenotypiske trekk og oppkjøpet av epiteliale markører [28] – [30]. Park og kolleger [28] har vist at ektopisk uttrykk microRNAs (mirnas), som MIR-200, kan føre til oppregulering av E-cadherin i kreft cellelinjer og redusert bevegelighet via rettet mot E-cadherin transkripsjons repressors,
ZEB1 product: (TCF8 /δEF1) og
ZEB2
(SMAD-samspill protein 1 [SIP1] /ZFXH1B) transkripsjoner. De rapporterte også en signifikant sammenheng mellom E-cadherin og Mir-200 uttrykk i to sett med pasientprøver som stammer fra primær serøs papillær kreft i eggstokkene [28]. Lignende resultater har blitt rapportert når MIR-429 er overuttrykt metastatisk eggstokkreft celler [29].
