Abstract
Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) er en epigenetisk regulator indusert i mange kreftformer. Det er tenkt å kjøre tumorigenesis ved å undertrykke divisjon, stemness, og /eller utviklings regulatorer. Kreft unngå immundeteksjon, og ulike immun regulatorer trengt på forskjellige svulster. Det er uklart hvordan en slik celle-spesifikke effekter koordineres. Her viser vi en dyp og kreft-selektiv rolle for PRC2 i undertrykke flere cytokin veier. Vi finner at PRC2 undertrykker hundrevis av IFNy stimulert gener (ISGs), cytokiner og cytokin reseptorer. Dette målet repertoar er betydelig utvidet i kreft vs ikke-cancerceller, og er forskjellig i forskjellige krefttyper. PRC2 er derfor et høyere orden regulator av immunsystemet i kreftceller. Hemme PRC2 med enten RNAi eller EZH2 hemmere aktiverer cytokin /cytokin reseptor arrangører merket med bivalent H3K27me3 /H3K4me3 kromatin, og forsterker reaksjonsevne til ulike immun signaler. PRC2 hemming redder immun geninduksjon selv i fravær av SWI /SNF, en tumor suppressor defekt i ~ 20% av humane kreftformer. Denne romanen PRC2 funksjon i tumorceller kan dypt påvirke virkningsmekanisme og effekt av EZH2 hemmere i kreftbehandling
Citation. Abou El Hassan M, Huang K, Eswara MBK, Zhao M, Song L, Yu T , et al. (2015) Kreftceller Hijack PRC2 å endre flere cytokin Pathways. PLoS ONE 10 (6): e0126466. doi: 10,1371 /journal.pone.0126466
Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 29 desember 2014; Godkjent: 03.04.2015; Publisert: 01.06.2015
Copyright: © 2015 Abou El Hassan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelig fra GEO-databasen under aksesjonsnummer GSE67766. Dette er en superseries nummer, og innen den datasettet er det individuelle filer for hele microarray, Chip-chip, og RNAseq data
Finansiering:. Denne studien ble støttet av RB: 703079 Canadian Cancer Society (http: //www.cancer.ca/research), RB: MOP 74570 Canadian Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html), RB: KF12-02 Krembil Foundation (http : //www.krembilfoundation.ca/), JJ: R01GM103893 National Institutes of Health (US) NIH (https://www.nih.gov/)
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP i bruk ulike strategier for å unngå immunsystemet, inkludert regulering av cytokiner eller andre skilles faktorer /reseptorer som styrer immunresponsen [1]. Spesielt, den typen, plasseringen og graden av immun infiltrat i en tumor (det «Immunoscore») forutsi utfallet bedre enn et mangfold av tradisjonelt benyttes tumor-sentrisk patologi parametre, slik som tumor grad [2]. De faktorene som styrer immun overvåking varierer kontekstuelt og detaljene er komplisert, fordi midler som fremmer immun klaring i en situasjon fremme immunsuppresjon i en annen (anmeldt i [3]). En tiltalende oppfatningen er at svulster kan utnytte en felles mekanisme for å manipulere uttrykk av immun regulatorer, og at hver svulst skreddersyr denne strategien for å passe deres individuelle miljøet. Forstyrre slik et høyere nivå regulatoriske nettverk kan gi en generell strategi for å øke immun påvisning og rydding av mange kreftformer. Men mekanismene som styrer myriade av immungener som påvirker overvåking er ikke godt forstått.
Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) er epigenetisk regulator som innskudd undertrykkende histone H3 lysin 27 (H3K27me3) merker på kromatin. To av de viktigste komponentene inkluderer den katalytiske subenhet EZH2, og SUZ12, stillaset protein som kreves for komplekse stabilitet [4]. PRC2 er en del av Polycomb familie av regulatorer som motvirker de positive transkripsjons effektene av Trithorax familiemedlemmer under utvikling, slik som SWI /SNF kromatin remodelle kompleks [5]. PRC2, som ofte er overuttrykt i kreft, er antatt å fremme tumorgenese gjennom regulering av cellesyklusen, DNA-replikasjon, overlevelse, alderdom og /eller stemness [5-7]. Om, og i hvilken grad PRC2 kan påvirke immunforsvaret i tumorer er uklart.
Tidligere har vi og andre viste at BRG1, ATPase motoren som driver SWI /SNF, er nødvendig for respons av IFNy stimulert gener (ISGs ) [8-11]. På
CIITA
locus, fant vi at BRG1 koordinerer handlingen av mange distale enhancers. Men til tross for å være avgjørende på den endogene locus og en stor 190 kb reporter, er BRG1 unnværlig for IFNy induksjon av korte
CIITA
journalister, som fører til den oppfatningen at det kan dempe virkningene av en ekstern repressor. I siste arbeid, parallelt med denne studien, viste vi at PRC2 og H3K27me3 dekorere
CIITA
locus, både arrangøren og mellom eksterne forsterkere [12]. Fjerne PRC2 lindret kravet til BRG1, og klar til en ekstern -50 kb Enhancer, akkurat som sett med BRG1. Vi lurte på om denne motsetningen mellom BRG1 og PRC2 kan utvide til andre IFNy mål. IFNy spiller en viktig rolle i immun overvåking [13-20]. 20% av humane kreftformer mangler funksjonell SWI /SNF [21], og denne defekten eller opp-regulering av PRC2 kan gi en generell mekanisme for immun flukt i kreft. Videre satsing på PRC2 å tydelig loci kan hjelpe forme det spesifikke immun program som kreves i ulike kreftformer.
Her viser vi at PRC2 har en bred rolle i å undertrykke ISGs og uventet at den også har en dramatisk og kreft -selektiv rolle i regulering av mange andre cytokin veier. Hemme PRC2 med RNAi eller lite molekyl EZH2 hemmere reaktivert ISG respons, selv i SWI /SNF-mangelkreftceller. Videre omfattende RNAseq analyse viste at forstyrre PRC2 aktiverer flere cytokin og cytokin reseptor veier. Denne funksjonen ble betydelig utvidet i kreft
vs
. ikke-cancerceller, og kan bli blokkert ved farmasøytiske midler. PRC2 er dermed en høyere orden regulator av immun trasé i kreft, og er rettet cytokiner, deres reseptorer og nedstrøms mål, og det tilpasser dette programmet i henhold til krefttypen. Cytokiner har pleiotrope effekter på tumordannelse [3,22], og kan ha en stor innvirkning på effekten av EZH2 hemmere i kreft hos mennesker.
Materiale og metode
Cell Kultur og adenovirus
Celler ble dyrket som beskrevet [9] og behandlet med humant IFNy (Invitrogen) ved en konsentrasjon på 0,1 mg /ml. SW-13 celler ble transduced med adenovirus uttrykker GFP (Ad-GFP) eller GFP-BRG1 fusjonsprotein (Ad-BRG1) beskrev [9]. AdBRG1 virus ble titrert slik at BRG1 uttrykk matchet i HeLa celler [9].
Små interfering RNA (siRNA)
siSUZ12, siEZH2 og siCtrl ble hentet fra Qiagen, og siBRM fra Thermo Scientific . SW-13 celler på 2×10
6 per 10-cm tallerken ble transfektert med 50 nM siCtrl, siSUZ12 eller siEZH2 alene eller med 75 nM siBRM i 3-4 dager ved hjelp DharmaFECT-en (Thermo Scientific). Cellene ble sub-dyrket ved 2×10
6 per 10 cm plate, og underkastet en andre syklus transfeksjon, noe som sikrer bedre H3K27me3 uttømming. Deretter ble cellene behandlet med 0,1 mg /ml human IFNy i 6 timer.
Western
Western ble utført som beskrevet [23]. For antistoffer se S4 tabell.
RT-PCR og Expression Arrays
RNA ble revers-transkribert og analysert ved hjelp av kvantitativ PCR. Verdier ble normalisert til p-aktin [9]. Primere er i S4 tabell. For uttrykk arrays, ble RNA kvalitet kontrolleres ved hjelp Bioanalyzer (Agilent Inc.), konvertert til cDNA, etterfulgt av 2
nd tråd syntese og cRNA forberedelse på Ambion kit (Applied Biosystems). cRNA var kolonne-renset kvalitetssikret ved hjelp av Agilent Bioanalyzer. 1,5 ug ble hybridisert til Illumina hel-genom uttrykk matriser. AdGFP /BRG1 og siCtrl /siSUZ12 prøver ble hybridisert til Human-WG6 Expression BeadChips og Human-HT-12 Expression BeadChips, henholdsvis (Illumina, Inc.). Differensial uttrykk analyse ble utført ved bruk av gjennomsnittlige normalisering av BeadStudio programvare (Illumina Inc). Tre biologiske replikater ble inkludert for hver behandlingsgruppe.
ChIP qPCR, chip på chip, og chip-seq
ChIP-qPCR DNA ble utført som beskrevet [10,24]. Antistoffer og primere er i S3 S4, respektivt. Antistoffer ble tidligere validert [25] og vi ytterligere bekreftet H3K27me3 og H3K79me3 antistoffer ved hjelp av punkt blotter. For Chip-chip, ble immunopresipitert DNA forsterket, merket og hybridisert til humant 1M arrangøren flislegging arrays (Agilent). TileMap ble anvendt for å definere regioner med betraktelig anriket H3K27me3 [26], og intensiteter ble normalisert til interne standarder. Peaks ble rangert etter sin test statistikk verdi (maksimal TileMap-MA statistikk: maxM /P [26]). Metoder for å sette en maxM /P cutoff er beskrevet i S1 tekst (Supplerende metoder). For detaljer om analyse av Chip-seq data, se S1 tekst (utfyllende metoder).
RNA-sekvense
RNA kvalitet ble testet ved hjelp av BioAnalyzer (Agilent). Oligo-dT-perler ble anvendt for å isolere poly (A)
+ mRNA, og etter vilkårlig fragmentering ~ 300bp RNA-fragmenter ble anvendt for å fremstille cDNA-bibliotek ved bruk av multipleksede Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit. Høy throughput sekvensering av bibliotekene ble utført ved hjelp av Illumina HiSeq 2000 LTRI. Sekvense leser av hver prøve i fastq format ble vurdert med FASTQC, og per basesekvensen kvalitet og per sekvens GC innhold indikert data av høy kvalitet. Data ble kartlagt på det humane genom (hg19) ved hjelp av Hat 1.4.1 som gjør det mulig for opptil to mistilpasninger [27]. Ikke entydig leser ble filtrert ut. Den leser count (eller montering) for hvert gen ble beregnet ved hjelp av en tilpasset R-basert rørledning ((https://www.r-project.org). For ytterligere informasjon om hvordan datakvalitet og differensielt uttrykte gener ble undersøkt se S1 Text (supplerende metoder og resultater)
Gene Set Enrichment Analyse
Vi hentet gener med log
2Fold endre . 0 og differensialsannsynlig 0,5 og rangert de SUZ12 trykkes gener ved å redusere differensialsannsynlighetsverdier. Vi brukte GSEA Preranked funksjonen til å analysere berikelse av de rangerte gener på C2 gensettene eksportert fra KEGG sti versjon 3.1 med genene i gensettene identifisert av HUGO genet symbol. Vi valgte beriket veier med høy berikelse Score (ES) med en cutoff av nominell P-verdi (NOM p-val) 0,01 og FDR q-val. 0,05 for «cytokin-cytokin reseptor interaksjon» (CCRI) vei, vi videre anvendt GSEA ledende analyse å trekke pathway medlemmer som forklarer berikelse. Vi gruppert genene deres dE sannsynlighet over seks kreftcellelinjer på vanlige og annerledes berørte gener i ulike kreftceller i samme bane. Vi brukte sti kart over CCRI pathway (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html, kart 04060) den KEGG å generere skjemaer. Clustering analyse og visualisering ble gjennomført med MeV (https://www.tm4.org/mev.html).
cytokin Detection
For Suz12 knockdown, A549 celler ble behandlet for to sykluser som per ovenfor. For narkotika hemming av Ezh2 ble cellene behandlet for to fire dagers sykluser med 2 um GSK343 eller UNC1999. Ved slutten av hver behandling, ble cellene sådd ut @ 3×10
4 /brønn i 96-brønners skåler. Celler ble tillatt å sedimentere i 4 timer og deretter de angitte konsentrasjoner av ulike stimuli (LPS, IFNy, IL1β og TNFa) ble tilsatt. Kultursupernatanter ble samlet opp etter 24 timer og frosset inntil bruk. ELISA ble utført i duplikat hjelp IL6-, IL8- og CXCL10-ELISA Max Deluxe kits fra Biolegend. Multiplex analyse av cytokiner i kultursupernatantene ble utført ved hjelp av Human Primary cytokin Array /chemokin Array 41-Plex analysen fra Eve Technologies Corporation, Canada. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. Western blot analyse ble utført for å sikre Suz12 slå ned og nedregulering av H3K27me3 etter hvert forsøk.
Resultater
Genome-Wide antagonisme mellom BRG1 og PRC2 på IFNy Targets
SWI /SNF regulerer ISGs [8-11,28-30], men det funksjonelle forholdet til PRC2 er ukjent. Å sammenligne målene genom-wide, ble BRG1-mangel SW-13 celler transduced med adenovirus vektorer som uttrykker BRG1 (Ad-BRG1) eller GFP (Ad-GFP), eller transfektert med siCtrl eller siSUZ12, ubehandlet eller IFNy-stimulerte til 6 timer og microarrays brukes til å vurdere mRNA nivåer. SUZ12 er en kjerne subenhet av PRC2 og dens tap resulterer i nedbrytning av den enzymatiske subenheten, EZH2 [4]. Vi har fokusert på gener der AdBRG1 eller siSUZ12 indusert uttrykk ≥ 2 ganger (for en samlet data sammendrag, se kakediagrammer i figur 1). En detaljert beskrivelse av data og genet klassene er gitt i S1 tekst (se første del av supplerende resultater); sistnevnte gir omfattende informasjon om i hvilken grad BRG1 og PRC2 regulere basal og IFNy indusert genekspresjon. Påfallende, BRG1 tilberedning eller siSUZ12 behandling forbedret induksjon av 87% (95/109) av ISGs, men påvirket basal uttrykk for bare ~ 2% av alle gener (fig 1). Videre på 2% av alle gener som basal uttrykk ble påvirket, 14% (48/342) var co-regulert av SWI /SNF og PRC2, mens 34% (32/95) av ISGs var co-regulert. Effekten av SWI /SNF og PRC2 på co-regulert gener var antagonistiske. Real time PCR-analyse av 52 ISGs bekreftet den dominerende BRG1-avhengighet i dette genet klasse (figur A i S1 File), og siSUZ12 reddet responsen på 5/7 BRG1 avhengig ISGs, mens BRG1 uavhengig ISGs eller kontrollgener var upåvirket (Fig B, Panel B i S1 File). Et annet SUZ12 siRNA også reddet BRG1 avhengige ISGs (Fig C i S1 fil). PRC2 uttømming marginalt indusert BRG1 relaterte protein BRM (Fig B, Panel A i S1-fil). For å vurdere om dette svak induksjon kan forklare induksjon av noen ISGs vi slått ned BRM. Denne ekstra trinn hadde ingen eller bare en liten effekt på redning av BRG1 avhengig ISGs av siSUZ12 (figur B, D i S1 File). Rescue of ISG-respons var også ikke på grunn av induksjon av endogene IFN, fordi RNAi behandling hadde ingen virkning på STAT1 fosforylering eller IRF1 proteinnivåer, enten i SW13-celler [12], eller i flere andre cellelinjer (se nedenfor).
Mikromatriser ble utført med RNA fra SW-13 celler for å vurdere effekten av BRG1-tilberedning eller SUZ12 knockdown på basal uttrykk for alle genene (A, 465 berørte gener) eller IFNy respons (B, 109 ISGs). Behandlinger er angitt i rødt og blått over hver heatmap, er genet klasser indikert med fargede søyler til venstre for hver heatmap, og pai grafer oppsummere% av gener i hver klasse (In (A) grå = upåvirket gener). En ekstra diagram til høyre for heatmap i (A) klassifiserer gener basert på: 1. IFNy respons (ISGs = 12), eller gå vilkår: 2. Utvikling (n = 118); 3. Cell signale (n = 64); 4. Cell migrasjon (n = 24). Gene Class Forkortelser: EXPN: Expression; Br: Brg1, Z: Suz12; S: Stimulert; R: trykt; I: Interferon-γ; G:. Gene
Hvis PRC2 direkte regulerer ISGs, disse målene skal fremvise H3K27me3. Først adressert vi dette problemet ved hjelp av chip qPCR, etablere konsentrasjon for påfølgende genom-wide analyse. Vi studerte 30 arrangører: 10 ISGs reddet av siSUZ12 eller BRG1, 6 ISGs reddet av siSUZ12 bare 6 ISGs reddet av BRG1 bare, 3 ISGs upåvirket av siSUZ12 eller BRG1, og 5 positive kontroller for H3K27me3. IRF1, upåvirket av enten PRC2 eller BRG1, manglet H3K27me3 og fungerte som baseline (figur E i S1 File). H3K27me3 ble oppdaget på 15/16 av siSUZ12 regulert ISG arrangører, men bare 4/9 av ISGs upåvirket av siSUZ12 (figur E, Panel A i S1-fil) (p 0,05, Fisher eksakt test), og H3K27me3 var signifikant høyere ved tidligere (figur E, Panel B i S1 File).
Genome-wide chIP-chip avslørt ~ 1/5
th av arrangører hadde noen H3K27me3 (minst en 100 bp bin 1,5x ovenfor kontroll). Den gjennomsnittlige H3K27me3 intensitet toppet seg +/- 1 kb rundt TSS av alle genene (Fig F Paneler A, B i S1 File), og H3K27me3 nivåer anti-korrelert med basal uttrykk (bilde F, Paneler C, D i S1 File), i samsvar med andre celletyper (anmeldt i [6]). Med fokus på gener der BRG1 og /eller siSUZ12 stimulert uttrykk, ble de med høyest H3K27me3 nivåer trykt av PRC2 (BRS /ZRG ZRG, Fig G, paneler A-E i S1 File). Den gjennomsnittlige nivået på H3K27me3 på ISGs var lik som sett på alle tause gener (jfr figur 2A og 2F, Panel A i S1 File). ~ 40% av ISGs hadde noen H3K27me3 (Fig 2B), som er ~ 2x mer enn alle genene (jfr figur F, Panel B i S1 File). Som ved alle gener, nivå og hyppigheten av H3K27me3 korrelert med basal ekspresjon (Fig 2C og 2D). Videre på basalt tause ISGs, nivået og hyppigheten av H3K27me3 var signifikant høyere ved loci hvor siSUZ12 forbedret IFNy respons (Fig 2E-2I, ZR-ISGs, BRS /ZR-ISGs).
Genome-wide ChIP -chip data ble brukt for å vurdere H3K27me3 nivåer på ISG arrangører. (A) ChIP-chip signalintensitet per 100 bp binger innenfor +/- 5 kb av TSS av alle 109 ISGs definert i figur 1B. (B) Prosent av H3K27me3 positive og negative ISG arrangører. (C) ChIP-chip signalintensitet som i (A), men gruppert etter ISG basal uttrykk. (D) Histogram av prosentandelen av positive og negative H3K27me3 ISGs i forhold til basal genekspresjon. (E) Fargekode for basalt tause ISGs analysert i (F) – (H). (F) Heatmap viser basal H3K27me3 ChIP-chip signal innenfor +/- 1 kb av TSS på de angitte basalt tause ISG klasser. (G) ChIP-chip signalintensitet per 100 bp binger innenfor +/- 1 kb av TSS av basalt tause ISGs. (H) fiolin plottet viser nivået av gjennomsnittlig spon chip signal. Stjernene indikerer signifikant forskjell (P 0,05, Mann-Whitney-test) mellom de indikerte gruppene. (I) Histogram viser prosentandelen av H3K27me3 positive arrangører i hvert indikert ISG klasse. *: Betydelig høyere% av H3K27me3 positive ISGs mellom de angitte gruppene (P 0,05, Fisher eksakt test). Gene Class Forkortelser: Br: Brg1, Z: Suz12; S: Stimulert; R: trykt; I: Interferon-γ; G: Gene
Sammen uttrykket ovenfor og kromatin bindende data utsette en omfattende, antagonistisk rolle for SWI /SNF og PRC2 i IFNy respons
PRC2 undertrykker flere immun Pathways i.. kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
for å vurdere den generelle relevansen av funnene våre, utførte vi RNAseq analyse etter PRC2 uttømming i 8 kreft og 3 ikke-kreft-avledede cellelinjer (Cancer: A549, lunge adenokarsinom, Panc.04.03 AsPC1 , bukspyttkjertelen adenokarsinomer, PC3, prostatakreft, MCF-7 MDA-MB-231, brystkreft, HeLa, livmorhalskreft, og SW-13, adrenokortikal kreft, ikke-kreft: 184-A1, bryst, BPH-en prostata , og Beas-2B lunge). Western avslørte at SUZ12, EZH2 og /eller H3K27me3 nivåene ble vanligvis forhøyet i cancerlinjer sammenlignet med ikke-cancerlinjer (fig H i S1-fil). BRG1 /BRM nivåer varierte mellom kreft og ikke-kreft linjer med lavest i A549, AsPC1, Panc.04.03 og 184A1 (fig H i S1 File). EZH2 og SUZ12 nivåer korrelert med hverandre, men ikke med bulk H3K27me3, og PRC2 og BRG1 eller BRM nivåene var ukorrelerte (Fig H, Panel B i S1 File). Disse variable funnene understreker viktigheten av funksjonelle studier for å utlede effekten av PRC2 på genekspresjon fordi bare vurdere nivåer av komplekse eller merket avslører litt om sin rolle i kreft eller ikke-kreftceller.
Celler ble behandlet med siCtrl eller siSUZ12 og ubehandlet eller utsatt for fysiologisk relevante konsentrasjoner av IFNy (0,2 ng /ml), kan sammenlignes med at utskilt av NK-celler eksponert for kreftceller [31,32]. SUZ12-uttømming redusert H3K27me3 i alle celletyper, og økt H3K27ac i noen (HeLa, MDA-MB-231, PC3), men ikke påvirke SWI /SNF subenheter (Fig jeg i S1 File). Neste RNA-seq Analysene ble gjennomført for å vurdere effekten av SUZ12 knockdown på basal eller IFNy-indusert genekspresjon (44 analyser, 4 forhold x 11 linjer), og resultatene ble validert ved hjelp av prinsippet komponentanalyse og korrelasjonsanalyse. Effekten av å slå ned SUZ12 på genekspresjon ble også bekreftet med en backup siRNA mot SUZ12. For en full diskusjon kan du se avsnittet «Validering av RNAseq data» i S1 tekst (Supplerende resultater), som refererer til valideringsdata i figurene J-M i S1 Fil, og S2 tabell.
I samsvar med en bred rolle for PRC2 på ISGs, SUZ12-Fortrenger ISGs (ZR-ISGs) ble observert på tvers av flere cellelinjer (figur 3, fig N i S1 File, S2 tabell). Blant de to mest tallrike ISG kategorier (ZR-ISGs og ISGs ikke påvirket av SUZ12 (N-ISGs)), var det cellespesifikke forskjeller i absolutte tall av ZR-ISGs (range 13-152, mener 70, median 43), men siSUZ12 forbedret induksjon på mellom 13% og 77% (gjennomsnittlig 45%, median 43%) i 7/8 cellelinjer (Fig 3). Disse verdiene er konservative, da det var andre mer komplekse lavere overflod genet klasser hvor SUZ12 berørt ISG uttrykk (S1 tabell). Mest N-ISGs (68%) og ZR-ISGs (72%) ble bestemt for hver celletype (fig O i S1 File), noe som indikerer at, i tillegg til en grunnleggende sett, induserer hver linje en distinkt ISG cocktail. Dette er i overensstemmelse med den kontekst spesifikke natur av immunovervåkning [3], og med celle-spesifikk binding av kromatin PRC2 [33]; faktisk av genene fortrengte ved SUZ12 alene (ZRG-N), 77% var unike for en cellelinje (fig O i S1-fil). Også brøkdel av ZR-ISGs var lavere i ikke-kreft versus kreft linjer, med de tre ikke-kreft linjer rangert
th 7,
th 8 og 11
th blant alle 11 linjer vurderes ( S1 tabell).
Heatmaps vise virkningen av de fire behandlinger (kolonnene 1-4, nøkkel i tabellen til høyre) på ISG ekspresjon i et panel av lunge, bukspyttkjertel, bryst, cervix, adrenokortikal og prostata kreftcelle linjer. Celler ble transfektert med siCtrl eller siSUZ12 og ubehandlet eller stimulert med IFNy i 6 timer. ISGs er sortert i SUZ12-trykt ISGs (Zr-ISGs, gul) og ISGs som ikke er regulert av PRC2 (N-ISGs, grønne). Prosentandelen av Zr-ISGs og N-ISGs er vist i kakediagram over hver heatmap, og det totale antallet ISGs per linje er angitt under hver heatmap.
Deretter snudde vi til effekten av PRC2 uttømming på basal genuttrykk. Vår microarray analyse i SW13 binyrekarsinom celler ikke avsløre en fremtredende effekt på immungener før vi behandlet med IFNy (figur 1), men vi lurte på om det kan være en mer fremtredende effekt på basal uttrykk av immun baner i andre krefttyper. For å dechiffrere de viktigste trasé berørt, brukte vi Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [34]. Påfallende, siSUZ12 indusert basal uttrykk for flere immunkomponenter i 6/8 kreft linjer, hvorav «cytokin /cytokin reseptor interaksjon» (CCRI) genet settet ble berørt i alle 6 linjer (Fig 4 og 5), og i 4 linjer den CCRI klassen var den høyeste eller nest rangert gen set (* i figur P i S1 File). Disse funnene ble validert for flere gener med to sirnas mot SUZ12 (S2 Table). Blant de seks cancerlinjer hvor den CCRI genet settet ble indusert, 61% av genene som var oppregulert spesifikt i en eller to av de cellelinjer (Fig Q i S1-fil). Således PRC2 ikke bare regulerer ISGs, men dens effekt på immun program i kreftceller strekker seg til en rekke cytokiner og cytokinreseptorer, og beslektet med ISGs, påvirker forskjellige CCRI gener i forskjellige kreft sammenhenger.
Oppsummering av GSEA analyse av gener differensielt indusert ved siSUZ12 forhold til siCtrl i 6 kreft og 4 ikke-cancer avledede cellelinjer. Cellelinjer som inngår i varmekart er vist til høyre; et betydelig signal er angitt i grått. Lignende biologiske mekanismer er gruppert, og markert med en tydelig farge til høyre, og deres generelle klassenavn er angitt til venstre.
A. Heatmap av CCRI gener betydelig indusert av siSUZ12 (Differential Sannsynlighets 0,9) i 11 cellelinjer (ikke-kreft grønn, kreft blå). For cellelinjenavn som svarer til hver nummer Se (F). Blå stjerner i denne og påfølgende paneler indikerer cellelinjer hvor CCRI veien ble betydelig beriket ifølge GSEA. BE Heatmaps av undergrupper av data i (A) adskilt av vevstype: B. bryst (184 ikke-kreft
vs
MCF7 og MDA-MB-231 kreft.), C. Lung (Beas-2B non -cancer
vs
. A549 kreft), D. prostata (BPH-en ikke-kreft
vs
. PC-tre kreft), og E. en annen fire kreftcellelinjer av bukspyttkjertelen (Panc .04.03 og AsPC1), cervical (HeLa) og adrenocortical (SW-13) opprinnelse. F. Frekvens av indusert CCRI gener på tvers av alle 271 CCRI gener i hver cellelinje.
I sterk kontrast til kreft linjer, gjorde siSUZ12 ikke berike for immun gensettene i ikke-kreft brystkreft, prostatakreft og lungekreft linjene (fig 4, fig Q i S1 File). For å utvide denne analysen brukte vi GSEA å analysere publiserte RNAseq data fra SUZ12-knockdown i humane HEK-293T celler [35]. Disse er ikke-kreft-avledede celler av neural opprinnelse som uttrykker virale onkogener, men ble transformert
in vitro
, uavhengig av immunsystemet [36]. GSEA avdekket at PRC2 uttømming ikke signifikant innvirkning CCRI eller andre immun trasé (fig 4). Dermed PRC2 endret CCRI veier betydelig i 6/8 kreftcellelinjer, men 0/4 ikke-kreft sammenhenger. PRC2 uttømming oppregulert noen CCRI gener i ikke-kreft avledet cellelinjer, men færre enn i kreftceller, tilstrekkelig til å oppnå betydning i GSEA, og de berørte genene var tydelig i kreft vs ikke-kreft linjer fra tilsvarende vev (fig 5) . Disse data indikerte en bred rolle for PRC2 i å regulere immunforsvaret, noe som er endret og utvidet betydelig i kreft.
SUZ12 knockdown Induserer Gener med Toverdige Arrangører
For å definere om PRC2-mediert undertrykkelse av siSUZ12-induserte gener, spesielt CCRI underklasse, er direkte, utvunnet vi H3K27me3 ChIP-Seq data tilgjengelig for A549 lungekreft celler, og sammenlignet det med vår RNAseq data +/- siSUZ12 (fig 6A). Parallelt sammenlignet vi H3K4me3 distribusjon, som markerer aktive eller klar arrangører. Unsupervised clustering identifisert 10 forskjellige H3K27me3 /H3K4me3 mønstre. Mest sterkt indusert siSUZ12 gener, inkludert CCRI undergruppe var i klynger 1-4, med omfattende H3K27me3 promoter dekning (fig 6A-6D). Men, de fleste gener med høy arrangøren H3K27me3 ikke svare på siSUZ12 (Fig 6A), og understreker viktigheten av å måle effekten på genuttrykk. Spesielt den gjennomsnittlige H3K4me3 signalet var betydelig høyere over siSUZ12-responsive gener, inkludert CCRI undergruppe, sammenlignet med gener som var upåvirket av siSUZ12 eller 1000 tilfeldige gener sett (figur 6E). Dermed gener som er indusert følgende PRC2 avbrudd har et toverdig H3K27me3 /H3K4me3 signatur, og siSUZ12-indusert CCRI gener er typisk for denne gruppen.
Chip-seq data fra A549 celler ble brukt for å vurdere kromatin merkene på siSUZ12 induserte gener. A. Unsupervised k-means ble utført på H3K27me3 og H3K4me3 signaler, og plottet som heatmaps rundt TSS (for flere detaljer se «chip-seq dataanalyse i S1 tekst, utfyllende metoder). De 10 resulterende klynger (Cluster ID (CID) 1-10) er vist i størrelsesorden gjennomsnittlig log2Fold forandring i gen-ekspresjon etter siSUZ12 behandling som vist i dot plots til høyre. På prikkplott, alle gener (venstre) eller CCRI gener (til høyre) viser log2Fold endring for hvert gen; røde prikkene indikerer gener betydelig indusert av siSUZ12 (Differential sannsynlighet 0,9). Basal uttrykk er vist til høyre (Lysegrå: lav, grå: medium; mørk grå: høy). B. Viser gensamlingene avdekket i panel A. Andel av alle genene indusert av siSUZ12 (rød) i KBS 1-4 eller 5-10 (som vist på punkt tomter i A). C. Andel CCRI pathway gener indusert av siSUZ12 (rød) i KBS 1-4 (rødt omriss) eller 5-10 (blå omriss). D. Gjennomsnittlig H3K27me3 ChIP signal rundt TSS for de angitte grupper av gener (Key til høyre, ZR-Genes: alle SUZ12 trykt gener, N-Genes: ikke berørt av siSUZ12, ZR-CCRI: CCRI gener som er SUZ12-trykt N-CCRI: CCRI gener ikke er berørt av SUZ12, Rand: 1000 tilfeldige gensettene, n = median av de andre fire genet sett). E. Samme som (D), bortsett H3K4me3 chip signaler i KBS 1-4 (dvs de med høy H3K27me3).
Små Molecule EZH2 hemmere Augment Multiple Immune Pathways
Våre data øke muligheten for at legemidler som hemmer PRC2 kan øke immun pathway aktivering i kreftceller. Når fire kreftcellelinjer ble behandlet med 2 mikrometer av GSK343 [37] eller UNC1999 [38], enten stoffet kraftig redusert H3K27me3 nivåer (Fig R i S1 File). RT-PCR-analyse viste at 8 SUZ12-fortrengte ISGs (ZR-ISGs) i fire cellelinjer (32 tilfeller) UNC1999 augmented IFNy-respons i 30 tilfeller (94%) og GSK343 gjorde det på 15 (50%) (fig S i S1 File). Behandling hadde ingen effekt på ikke-ISGs som
PITX2
eller
HPRT
eller på mRNA eller protein nivåer av IRF1, en PRC2 uavhengig ISG (figur R, S i S1 File). UNC1999 indusert mRNA i større grad enn GSK343 tross tilsynelatende lignende virkninger på bulk H3K27me3 nivåer. Dette kan gjenspeile små forskjeller i kinetikken og /eller antall H3K27me3 utarming på bestemte forsterkere eller promotorer, som ikke ville åpenbart ved Western-analyse av total H3K27me3. Uansett, disse dataene viser at EZH2 hemmere, som siSUZ12, øke mRNA induksjon av PRC2-trykt ISGs.
Til slutt vurderte vi om PRC2 hemming øker cytokininduksjon i respons til andre immun signaler og om disse effektene er observert på proteinnivået. For dette, behandlet vi A549 lungekreftceller med TNFa, IL1β,
E
.
coli
lipopolysakkarid (LPS), så vel som IFNy, og vurderes sekresjon av cytokiner CXCL10, IL6 og IL8 . I motsetning til mRNA-induksjon, PRC2 hemming alene ikke forbedre proteinnivåer, men når cellene ble utsatt for en av de fire immun signaler, siSUZ12 eller UNC1999 augmented cytokin proteiner induksjon (fig 7A-7C, figur T in S1 Fil, S2 tabell). Disse data er i samsvar med den veletablerte, post-transkripsjonell regulering av cytokinproduksjon for å forhindre uønskede immunreaksjoner, så som kronisk betennelse. For eksempel, i tillegg til gentranskripsjon (innen direkte kontroll av PRC2), cytokiner er også strengt regulert på nivået av mRNA-stabilitet og /eller translasjon gjennom motiver som AU-rik Element (ARE), Konstitutiv Råte Element (CDE ), Coding Region Determinant av Ustabilitet (CRD) og flere andre [39]. Våre resultater tyder på at PRC2 regulerer transkripsjonen komponent, men ikke det post-transkripsjonelle kontroll, noe som krever et ytterligere signal fra immunsystemet.
