Abstract
Telomerase er en revers transkriptase assosiert med mobilnettet udødelighet gjennom telomere vedlikehold. Dette enzymet er aktivert i 90% av humane kreftformer, og inhibitorer av telomerase er for tiden i kliniske forsøk for å motvirke tumorvekst. Mange aspekter av telomerase biologi har blitt undersøkt for behandling, spesielt hemning av enzymet, men lite ble gjort hensyn til subcellulære skytteltrafikk. Vi har nylig vist at mutasjoner i den kjernefysiske eksport signal om hTERT, katalytisk komponent av telomerase, førte til en mutant (
NES-hTERT) som ikke klarte å forevige celler tross kjernefysiske lokalisering og katalytisk aktivitet. Uttrykk for
NES-hTERT i grunnskolen fibroblast resulterte i telomer-baserte tidlig alderdom og mitokondriell dysfunksjon. Her viser vi at uttrykket av
NES-hTERT i LNCaP, SQ20B og HeLa celler raskt og betydelig reduserer deres spredning rate og evne til å danne kolonier i soft agar samtidig som det ikke forstyrrer endogen telomerase aktivitet. Kreftcellene viste økt DNA skade på telomeric og ekstra telomeric områder, og ble følsomme for ioniserende stråling og hydrogen peroxide eksponeringer. Våre data viser at uttrykket av
NES-hTERT motvirker effektivt kreft celle vekst
in vitro
i minst to forskjellige måter, og foreslå manipulering med NES av hTERT eller dets subcellulære skyt som en ny strategi for kreft behandling
Citation. Kovalenko OA, Kaplunov J, Herbig U, deToledo S, Azzam EI, Santos JH (2010) uttrykk for
NES-hTERT i kreftceller Forsinkelser cellecyklusprogresjonen og øker følsomheten til Gentoksisk Understreke. PLoS ONE fem (5): e10812. doi: 10,1371 /journal.pone.0010812
Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 13 april 2010; Godkjent: 03.05.2010; Publisert: May 25, 2010
Copyright: © 2010 Kovalenko et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av The New Jersey Commission on Cancer Research (NJCCR), tilskudd nummer 808 033 (JHS), 09-1124-CCR-EO (UH) og 10-2412-CCR-E0 (JF), Army Research Office, gi nummer 56027LS (JHS), Ellison Medical Foundation gi AG-NS-0387-07 (UH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En viktig egenskap av ondartede svulster er deres evne til å spre seg på ubestemt tid. Dette er mediert, i 90% av tilfellene, ved reaktivering av telomerase, en revers transkriptase ansvarlig for å vedlikeholde telomerer [1], [2]. Telomerase består minimalt av to forskjellige subenheter, en katalytisk kjerne (hTERT) og en RNA komponent (HTR), som jobber sammen for å etterfylle telomerer med hver celledeling. hTERT har nylig blitt vist å erverve egenskapene for en RNA-avhengig RNA-polymerase da i et kompleks med den RNA-komponenten av mitokondriell endoribonuclease MRP [3]; slik aktivitet ikke er involvert i vedlikehold av telomerer. Mens HTR er til stede i både somatiske og bakterieceller konstitutivt, er ekspresjon av hTERT strengt regulert. Telomerase aktivitet er høy under embryogenesen og i de aller fleste av svulster, men er lav eller ikke-eksisterende i de fleste voksne somatiske celler [1]. Av den grunn har inhibere telomerase blitt en lovende strategi for behandling av kreft.
Flere forskjellige fremgangsmåter er blitt utviklet for å blokkere aktiviteten til telomerase holoenzyme, som strekker seg fra inhibitorer av hTERT til G-quadruplex stabiliserende midler til nedbrytning av målrettet den tilhørende HTR [4] – [17]. I alle tilfeller, for å direkte eller indirekte telomerase hemming resulterer i manglende evne av cellene opprettholde telomerer og til slutt celler stanse vekst eller dø. Et problem med disse metodene er at flere uker til måneder er nødvendig for effekter som de for det meste er avhengige av omfattende telomerer forkortes [5]. Likevel, telomerase-hemmere er for tiden i kliniske studier [18].
Vi har nylig vist at en mutant hTERT defekt i sitt atom eksport signal (
NES-hTERT) ikke klarte å opprettholde telomerer og «sunn» mitokondrier i både primær- og SV40-transformerte humane fibroblaster [19]. Til tross for nukleær lokalisering og katalytisk aktivitet in vitro, det mutante proteinet var biologisk inaktivt in vivo fører til for tidlig senescens med aktivering av den klassiske telomer-relaterte DNA-skade respons (DDR), når det uttrykkes i primære celler. Uttrykk av mutant protein var også assosiert med mitokondriell dysfunksjon og DNA skade både telomeric og ekstra-telomeric nettsteder [19]. Gitt den raske og dramatiske effekter observert, hypotese vi at ektopisk uttrykk for
NES-hTERT kan også være et effektivt middel for å motvirke kreft cellevekst. I den foreliggende undersøkelse uttrykte vi
NES-hTERT i forskjellige cancercellelinjer og viser en rask og effektiv forsinkelse i cellesyklusprogresjon uten noen påvisbar endring i nivået av endogen telomeraseaktivitet enzymatisk aktivitet. Ekspresjon av det mutante proteinet reduseres i betydelig grad evnen som celler for forankrings-uavhengig vekst in vitro. Vi fant at ektopisk uttrykk for
NES-hTERT førte til atom telomeric, ekstra telomeric og mitokondrie DNA (mtDNA) skade på kreftceller og sensitivisert minst én type kreftceller til både oksidativt stress og γ-stråling. Til sammen foreslår våre resultater rettet mot NES av hTERT eller dets intracellulære bevegelse som en roman strategi for å effektivt motvirke svulstcellevekst.
Resultater
Overuttrykte
NES-hTERT i huden og prostatakreftcellelinjer raskt blokker cellecyklusprogresjonen
Vi har nylig vist at ektopisk uttrykk for en mutant hTERT der NES har blitt avbrutt (
NES-hTERT) forårsaker for tidlig alderdom i telomerase-negative humane fibroblaster [19]. Primære celler uttrykker
NES-hTERT sluttet å vokse innen 5-20 populasjonsdoblinger etter innføringen av mutant protein, som ble assosiert med klassiske tegn på mobilnettet senescence som blokade i G1 til S overgang, oppregulering av p21
waf1 , p16 og positivitet for begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase (β-gal) aktivitet [19]. Gitt disse effektene, spurte vi om uttrykk for
NES-hTERT vil også påvirke cellecyklusprogresjonen av telomerase-positive kreftceller. For å løse dette spørsmålet, vi stabilt uttrykt
NES-hTERT i SQ20B (plateepitelkarsinom – hudkreft) og LNCaP (prostatakreft) celler og fulgt veksten i masse kulturer i flere uker; kontrollceller ble enten forlatt non-smittet eller infisert med tom vektor. Det ble ikke observert forskjeller mellom ikke-infiserte og tom-vektor transduced celler (data ikke vist). Celler ble valgt med antibiotika i 2 uker før oppstart av forsøkene. Virale transductions ble gjentatt minst to uavhengige ganger med hver cellelinje som viser reproduserbare resultater. Alle eksperimenter er presentert her er avhengig av data oppnådd med celler avledet fra minst to uavhengige virale infeksjoner
Det fanget snart oppdaget at ved virale overførings endringer i fenotypen av cellene fant sted.; ble observert slike endringer mens cellene fortsatt ble valgt. En fraksjon (~30-50%) av SQ20B celler uttrykker
NES-hTERT hadde flatet ut og forstørret morfologi med noen av disse cellene som viser flere kjerner (Fig. 1A, øvre paneler), som minner om de effektene som er observert i de primære celler [19]. I motsetning til i de primære fibroblaster, ble ingen positiv β-gal-farging observert i SQ20B-celler som uttrykker
NES-hTERT (data ikke vist), noe som tyder på at de forstørrede cellene ikke var senescent. Disse cellene var heller ikke apoptotisk som de var verken blebbing eller løsne fra retter (data ikke vist). Forstørret morfologi ble ikke observert i LNCaP celler som uttrykker mutant hTERT; Men mens disse cellene har en tendens til å vokse i klynger /foci uavhengig av deres løpet (se også ATCC), uttrykk for
NES-hTERT trykkes denne fenotype (Fig. 1A, midtre paneler).
(A ) SQ20B (øverste panelene) LNCaP (midtre paneler) og deres derivater som stabilt uttrykker
NES-hTERT ble sådd ut på retter i like mange og analysert 72 timer senere. Fase kontrast bildene ble tatt på en Olympus IX70 mikroskop. Merk forstørret morfologi SQ20B
NES-hTERT og celler som flere kjerner (piler). Clustering er observert i LNCaP (se boks), men ikke sett i LNCaP
NES-hTERT. Bottom panelene viser HeLa celler som ble transient transfektert med
NES-hTERT mutant. Bilder ble tatt 48 timer etter trans. Pilene viser forstørret og multinucleated celler (i midten) observert bare ved transfeksjon med mutant hTERT. (B) SQ20B, LNCaP og deres
NES-hTERT derivater ble platet og lov til å vokse i opptil 144 timer. På forskjellige tidspunkter ble cellene høstet og telt ved bruk av et hemocytometer. I tilfelle av LNCaP, ble celler utsådd og telles på nytt 72 timer senere. Gjennomsnitt av tre analysene er vist, feilfelt representerer standardavvik (* P≤0.05) (C) Prosent av celler i hver fase av cellesyklusen ble beregnet ved hjelp av strømningscytometri basert på PI farging. (D) Celler ble serum sultet over natten, og deretter frigjøres ved tilsetning serum. Celler ble merket med [
3H] -tymidin og analysert på fastsatte tidsintervaller for tymidin inkorporering. Gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter er vist, feilfelt er standardavvik
Det er mulig at disse morfologiske endringene bare er et resultat av ikke-spesifikk integrering av
NES-hTERT pBabe vektor. For å utelukke denne mulighet, vi transient transfektert det mutante protein i HeLa-celler (adenokarsinom). HeLa-celler ble valgt på grunn av den høye effektiviteten av forbigående transfeksjoner (-60%) sammenlignet med både SQ20B og LNCaP-celler (~10-20%; data ikke vist), og fordi de også uttrykker endogene telomerase. For å sikre at cellene analysert ble uttrykker det muterte proteinet,
NES-hTERT ble subklonet inn i pCMV-vektoren og enten transfektert alene eller ko-transfektert med GFP; Resultatene var sammenlignbare med begge tilnærminger. Celler transfektert med tom pCMV-vektor (+ eller – GFP) ble anvendt som negative kontroller. Som det kan ses i fig. 1A (høyre bunnplater), innen 48 timer etter ekspresjon av det mutante protein, en fraksjon av HeLa-celler viste også i større målestokk og avflatet morfologi, som ikke ble observert i celler transfektert med vektor kontroll (Fig. 1A, nedre venstre panel). Disse data tyder på at de morfologiske endringene som er observert var knyttet spesielt med uttrykk av
NES-hTERT. Interessant nok var det ingen endring i celle nummer påvist for første 96 timer etter transfeksjoner med konstruksjon av det mutante protein (data ikke vist), mens HeLa-celler transdusert med vektorkontroll ble en fordobling 48 timer etter transfeksjon (fig. 1A, venstre nedre panel) .
Neste, vi definert enten
NES-hTERT endret cellecyklusprogresjonen av SQ20B og LNCaP celler ved hjelp av tre ulike tilnærminger. Først podes vi lik antall celler som stabilt uttrykker eller ikke det mutante proteinet og etterfulgt deres vekst i et tidsrom på 6 dager. Ved hvert tidspunkt (24, 72 og 144 timer) ble cellene trypsinert og telt ved bruk av et hemocytometer. Som vist på fig. 1B, ekspresjon av
NES-hTERT forandret formeringshastigheten av begge celletyper. Under disse forholdene, SQ20B cellene gjennomgikk en befolkning dobles hvert 28 timer mens SQ20B uttrykker mutant hTERT dobles hver ~36 timer. Tider for dobling i tilfelle av LNCaP-celler og sin
NES-hTERT-derivatet ble estimert til henholdsvis 36 og 57 timer (34 timer er doblingstiden LNCaP-celler i henhold til leverandøren (ATCC)). Vi overvåket deretter cellesyklusutvikling ved strømningscytometri. Celler ble synkronisert med serum trekning i 16-18 timer. Ved 8 timer etter serum tillegg ble cellene samlet og inkubert med RNase A og propidiumjodid (PI). Dataene i fig. 1C er representative for fire uavhengige analyser; i begge cellelinjer uttrykk for
NES-hTERT økte prosentandelen av celler i G1, mens den reduserte fraksjon av celler i S (fig. 1C). Disse data førte oss å kvantifisere spesifikt brøkdel av celler i S-fasen basert på tritiert tymidin inkorporering. Konfluente cellepopulasjoner ble subkultivert til lavere tetthet og ble inkubert i nærvær av [
3H] -tymidin. Bevegelse inn i S-fasen ble overvåket ved autoradiografi ved flere tidspunkter opp til 72 timer etter subkultur. Disse eksperimentene ble gjengitt to uavhengige ganger og tydelig viste en signifikant reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen ved ekspresjon av det mutante protein (Fig. 1D), i samsvar med resultatene oppnådd ved strømningscytometri. I gjennomsnitt, ved ~20-70 timer etter subkultur, SQ20B og LNCaP-celler som uttrykker
NES-hTERT hadde 40% og 60-80% mindre celler i S-fasen, respektivt, når sammenlignet med deres respektive kontroller.
Man kan argumentere for at høye nivåer av hTERT kan være drivkraften cellesyklus effekter, som tidligere hevdet [20]. Men vi ikke favorisere denne hypotesen som ektopisk uttrykk for villtype (WT) eller R3E /R6E hTERT, en mutant hTERT som er i stand til å gå inn mitokondriene [21], hadde ingen effekt på spredning rate av cellene (data ikke vist ). Andre grupper har også ectopically uttrykt WT hTERT stabilt i ulike typer kreftceller og ingen defekter i cellecyklusprogresjonen ble rapportert [22], [23]. Til sammen dataene i fig. 1 viser at uttrykket av
NES-hTERT effektivt og raskt forsinker progresjon av SQ20B og LNCaP celler gjennom cellesyklusen.
Overuttrykte
NES-hTERT i hud og prostata kreft celler avtar kolonidannelse potensial
in vitro
en rekke transformasjoner er nødvendig for celler til å bli tumorigent, blant annet økt vekst og evne til å vokse i en anker-uavhengig måte [22] – [24]. Muligheten av transformerte celler til å danne kolonier i soft agar er en nyttig in vitro prediktor for tumordannelse in vivo [24]. Vi ønsket å undersøke om de observerte virkninger på proliferasjonsrate etter innføringen av
NES-hTERT i hud og prostata kreft celler vil påvirke deres evne til å danne kolonier i myk agar. For å oppnå dette, belagt vi likt antall SQ20B, LNCaP og deres respektive
NES-hTERT derivater i triplikater i myk agar og tillater dem å vokse i opptil 3 uker; kolonier ble talt hver uke ved hjelp av krystallfiolett flekken. Gitt det høye antallet kolonier dannet i uke 2 og 3, spesielt i kontrollene, scoret vi vekst etter en uke med vekst der enkelte kolonier var fortsatt lett gjenkjennelig. Resultatene ble gjengitt to uavhengige ganger. Øvre paneler på fig. 2 viser antall kolonier dannet, nedre paneler viser representative bilder av platene. I begge kreftcelletyper, innføring av
NES-hTERT betydelig redusert antall kolonier dannet, noe som tyder på redusert tumorigent potensialet i disse cellene i forhold til de respektive tomme vektor uttrykke kontroller.
5 × 10
3 celler /brønn SQ20B, LNCaP og deres
NES-hTERT derivater ble dyrket i myk agar i opptil tre uker. Kolonivekst ble evaluert hver uke og kolonier telte basert på krystallfiolett farging. Grafene viser resultater fra koloniene telles på en uke da enkelte kolonier, særlig i kontrollcellene, var fortsatt lett gjenkjennelig. Kolonier ble scoret av to uavhengige observatører. Dataene som vises er gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter utført in triplo. Barer representerer gjennomsnitt ± SD. Representative bilder av platene er vist under hver graf.
Uttrykk for
NES-hTERT endrer ikke de endogene nivåer av telomerase enzymatisk aktivitet, men øker nivået av telomeric og ekstra telomeric DNA-skader
Ektopisk uttrykk for en katalytisk inaktiv mutant hTERT som oppførte seg som en dominerende negativ ble vist å effektivt hemme telomerase enzymatisk aktivitet, fører til telomere erosjon og redusert spredning av ulike kreftcelletyper. Økt spontan apoptose, redusert kolonivekst i bløt agar og redusert tumordannelse i nakne mus ble også observert [9], [17]. Selv
NES-hTERT er enzymatisk aktive in vitro, er det ikke å forlenge telomerer in vivo [19]. Det er således mulig at i telomerase-positive SQ20B og LNCaP-celler,
NES-hTERT oppfører seg på en dominant negativ måte, til syvende og sist fører til nedsatt formeringshastigheten nevnt ovenfor (fig. 1). For å teste denne muligheten, vi analyserte nivåer av hTERT mRNA og telomerase aktivitet i hele mobilnettet ekstrakter av celler som uttrykker eller ikke
NES-hTERT bruker henholdsvis RT-PCR og telomeric gjenta amplifikasjonsprotokoll (TRAP). Som forventet, ble RNA-nivåer av hTERT øket i cellene ectopically som uttrykker mutanten (fig. 3A). Det ble imidlertid ingen endringer i telomerase enzymatisk aktivitet observert av uttrykk for mutant protein som bedømmes av TRAP (Fig. 3B), noe som indikerer at
NES-hTERT ikke utøve en dominant negativ effekt på endogent protein i hvert fall i form av enzymatisk aktivitet.
(A) Nivåer av hTERT RNA ble måles ved RT-PCR. GAPDH ble forsterket og brukt som lasting kontroll. (B) 100 ng av det totale celleekstrakter ble brukt til å utføre den TRAP. Pilen angir intern kontroll for analysen. Positive og negative kontroller er ikke vist.
I telomerase negative fibroblaster, uttrykk for
NES-hTERT fører til telomeric og ekstra telomeric DNA-skade [19]. Dermed en annen mulig forklaring på nedgangen i proliferasjonsrate er at
NES-hTERT induserer DNA-skader i kreftcellene, som igjen bremser ned sin evne til å komme seg gjennom cellesyklusen. Vi testet denne hypotesen ved å evaluere nærværet av den fosforylerte form av histon H2A varianten, γH2AX, og 53-bindende protein 1 (53BP1). Vi har også oppdaget DNA skade direkte på telomerer av immuno-fluorescens in situ hybridisering (immun-FISH) i enkeltceller, ble mtDNA skader vurdert av gen-spesifikk kvantitativ PCR (QPCR) [25] -. [27]
En form for histon H2A fosforylert på serin 139 (S139 av γH2AX) er avgjørende for effektiv anerkjennelse av DNA dobbel tråd pause (DSB) nettsteder. Hundrevis eller tusenvis av γH2AX molekyler generere atom foci som kan bli funnet på stedet av hver begynnende DSB ved farging med antistoffer mot γH2AX [28] – [30]. 53BP1 aktiveres som en del av DNA-skade respons (DDR) og også danne foci [28], [29], [31]. Vi utførte enkelt celle analyse i SQ20B, LNCaP celler og deres respektive
NES-hTERT derivater som vi tidligere beskrevet [19], [29]. Celler ble scoret som å ha DNA-skader hvis de var positive for både γH2AX og 53BP1 foci. Antall og størrelse av foci som detekteres i hver enkelt celle ble kvantifisert og er representert i fig. 4A. I begge cellelinjene mengden av foci ble betydelig økt med uttrykk for
NES-hTERT (
p
= 0,006 for SQ20B og 0,034 for LNCaP celler). Det er bemerkelsesverdig at ekspresjon av det mutante protein førte til en betydelig økning i celler som presenterer større foci. For eksempel antall SQ20B
NES-hTERT celler viser 6 foci eller mer var tre ganger høyere enn i SQ20B kontrollceller (
p
= 0,004) (fig. 4A).
(A) Cellene ble immunostained med antistoffer mot γH2AX og mot 53BP1. DNA ble kontra med DAPI. Grafen viser prosentandelen av celler som var positive for både γH2AX og 53BP1 foci, og antallet og størrelsen av brennpunkter per celle (representert ved forskjellige farger i henhold til diagrammet merking). Barer er gjennomsnitt ± standardavvik (B) ImmunoFISH flekker å visualisere samtidig DNA skade foci og telomerer. DAPI ble brukt til å counterstain DNA. Grafen viser andel av DNA-skader foci lokaliserte på telomerer (TIF) per enkelt celle. (C) mtDNA integritet ble analysert ved QPCR i tre uavhengige forsøk. Graf viser estimert lesjon frekvens ± standardavvik
Neste, vi evaluert nivåer av telomer-indusert foci (TIF), som har blitt beskrevet som DNA-skader foci presentert på telomeric nettsteder. TIF kan oppstå ved gradvis telomere erosjon på grunn av kontinuerlig celleformering eller ved stokastisk telomeric DNA-skade [31] – [34]. Vi har tatt i bruk en protokoll som vi tidligere beskrevet [29], og antallet TIF-positive celler ble beregnet basert på det totale antall celler som ble analysert. En celle ble ansett TIF-positive når 50% av høyeste av DNA-skader samlokalisert med telomerer. Som vist på fig. 4B, nivåene av TIF-positive celler ble signifikant økt med uttrykk for mutant hTERT. Faktisk, TIF-positive celler økt ca 2 ganger i LNCaP bakgrunnen mens i SQ20B dette ekstrautstyret var mindre uttalt (Fig. 4B). I SQ20B celler, basalnivået TIF var høy: omtrent 45% av cellene var TIF-positive. Så høy basal nivå av telomerer skadene var uventet siden disse cellene uttrykker endogen telomerase som antagelig opprettholder sine telomerer. Men innføring av
NES-hTERT førte til en ytterligere økning i TIF som ble oppdaget i ca 70% av alle celler analysert (Fig. 4B, barer til venstre).
Til slutt analyserte vi mtDNA integritet ved QPCR, som vi tidligere viste at uttrykk for
NES-hTERT var assosiert med mitokondriell dysfunksjon, inkludert tap av mtDNA integritet i primær fibroblaster. Slike effekter ble intimt knyttet til den detekterte atom DNA-skade ved telomeric og ekstra-telomeric sider [19].
Under forutsetning av at skaden er tilfeldig fordelt, tillater QPCR et samlet bilde av integriteten av genomet som studeres [25 ] – [27]. Analysen måler integriteten av DNA ved hjelp av lange PCR-mål, i dette tilfelle 8,9 kb i lengde, som er omtrent 2/3 av hele mtDNA. Gitt identiske betingelser, DNA fra kontroll og behandlede prøver forsterke forskjellig avhengig av antallet av lesjoner til stede på malen ved tidspunktet for reaksjonen. For eksempel, DNA fra celler som er utsatt for UV-forsterker mindre enn DNA fra de respektive ikke-behandlede kontroll [35]. Hvor mye skade kan uttrykkes som antall lesjoner per 10 kb forutsatt en Poisson fordeling av lesjoner på malen. Tilstedeværelse av lesjoner reflekterer at prøven av interesse forsterker mindre enn dens kontroll, mens negativ antall lesjoner kan observeres når DNA av en gitt prøve forsterker bedre enn sine respektive kontroll. For å overvåke eventuelle endringer i mtDNA kopitall, er en kort fragment av mitokondrie genome også forsterkes for å normalisere dataene. Følsomhet grensen av teknikken er en lesjon /10
5 baser (for mer informasjon om analysen, se referanser [25] -.. [27] og [35]
Dataene i figur 4C reflektere Gjennomsnittlig ± sem av 3 uavhengige analyser. Basal nivåer av lesjoner i kontrollene ble beregnet basert på gjennomsnittet forsterkning av kontrollprøver av hver cellelinje, som så ble brukt som en referanse for å sammenligne hver individuell kontroll (for flere detaljer se metoder avsnitt). som forventet, både i mobilnettet bakgrunn uttrykk for
NES-hTERT betydelig økt basal nivåer av mtDNA skade (fig. 4C), noe som tyder på at mitokondrie dysfunksjon er også forsterket i kreftcellene ved uttrykk av det muterte proteinet.
til sammen dataene presentert i fig. 4 viser at uttrykket av
NES-hTERT i telomerase-positive SQ20B og LNCaP celler fører til DNA-skader på telomeric og ekstra telomeric områder, som ikke er forårsaket av en reduksjon i nivåene av aktivt enzym i kjernen, men kan være assosiert med dysfunksjonell mitokondrier.
NES-hTERT øker følsomheten til genotoksiske stress i hud kreftceller
Expression of telomerase har vært forbundet med modulering av celledød indusert av genotoksiske midler. Sensibilisering, markedsføring og ingen effekter på apoptose og /eller nekrose er blitt rapportert, som synes å stole på den type celler som studeres, den genotoksiske middel og, spesielt, på lengden av telomerer [17], [36] – [45]. Gitt den betydelige økningen i basale nivåer av kjernekraft og mtDNA skader observert ved ekspresjon av mutant hTERT undersøkte vi om cellene vil bli ytterligere sensibilisert for gentoksisk stress. For disse eksperimentene, har vi valgt SQ20B celler, som er kjent for å være meget radioresistant både når det gjelder DNA-skade og tap av proliferativ kapasitet [46], [47].
I et første sett av eksperimenter, vi eksponert cellene til
137Cs gammastråler. SQ20B celler og sin
NES-hTERT-derivatet ble platet ut ved like tall og ble anriket på G1 i 48 timer før bestråling ved vedlikehold i sammenflytende tilstand. Dette er viktig fordi celler i forskjellige faser av cellesyklusen varierer i sin strålesensitivitet [48]. Celler ble utsatt for en Gray (Gy) av γ- stråling (0,65 Gy /min), og vi analyserte nukleær DNA (nDNA) skade ved QPCR umiddelbart etter eksponeringen ved å overvåke integriteten av et 13,5 kb fragment av β-globin-genet [ ,,,0],25] – [27]. Resultatene presentert i fig. 5A tydelig viser en betydelig økning i mengden av γ-ray-indusert DNA-skader i SQ20B
NES-hTERT celler. Mens det i kontroll SQ20B celler, blir en lesjon observert i hver 50 kb av genomet, nivået av feil funnet i SQ20B
NES-hTERT-celler er 5 ganger større, oversette til en lesjon hver 10 kb av dobbelt-trådet DNA ( fig. 5A).
(A) Nuclear DNA-skade ble anslått i SQ20B og dens
NES-hTERT derivat umiddelbart etter eksponering for en Gy av gammastråling bruker QPCR. Resultatene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± standardavvik (B) Cellene ble behandlet med 200 uM av H
2o
2 i 60 minutter og tillatt å komme seg i 24 timer i kondisjonert medium. På dette tidspunkt ble cellene høstet, og antallet av apoptotiske død og levende celler ble evaluert ved flow cytometri ved bruk av PI og YOPRO-1. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Samme mengde levedyktige celler (500000) ble replated etter H
2o
2 eksponeringer og deres vekst ble fulgt i 2 uker. Antall celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer ved 24 timer og hver gang celler ble sammenflytende etterpå. Ettersom antallet behandlede SQ20B
NES-hTERT endret ikke i følgende 2 uker, kun data i 24 timer etter behandling vist. Resultatene er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± S.E.M. (* P≤0.05).
Neste vi fastslått om cellene vil bli gjort oppmerksomme på andre typer påkjenninger. For dette formål utsettes vi dem til hydrogenperoksyd (H
2o
2) og analysert celledød ved strømningscytometri. Vi valgte H
2o
2 på grunn av vår erfaring med dette oksidativt stressor; Forsøkene ble utført som beskrevet av oss tidligere [21], [49], [50]. I korthet, ble likt antall SQ20B celler utsådd 16 timer før H
2o
2 eksponeringer. Celler ble behandlet med 200 pM H
2o
2 i 60 minutter i basal medium i fravær av FBS og ble høstet enten umiddelbart etter eksponering for H
2o
2 eller tillatt å komme seg i 24 timer i kondisjonert vekstmedium. På begge punkter, ble mengden av døde og apoptotiske celler mottok basert på propidiumjodid opptak (PI) og YOPRO-1-farging. YOPRO-1 er et grønt-fluorescerende fargestoff som gjenkjenner spesifikt apoptotiske celler [51] – [55]. Celler ble analysert ved flowcytometri å kvantifisere med større sikkerhet hvor stor prosentandel av levedyktige, døde og apoptotiske celler. Som ingen vesentlige endringer i disse parametrene ble observert umiddelbart etter H
2o
2 behandling, de data som presenteres nedenfor er knyttet til 24 timer gjenopprettingspunkt.
Figur 5B illustrerer eksperimenter som er representative for tre uavhengige analyser. En stor økning i mengden av YOPRO-1 og PI-positive celler ble observert i den behandlede SQ20B bakgrunnen som uttrykker den mutante hTERT (Fig. 5B). Kvantifisering av antall levende, døde og apoptotiske celler viste at mens en 2-ganger økning i antall døde celler (enten Pl-positive bare eller PI og YOPRO positiv) ble observert i SQ20B 24 timer etter behandlingene, var denne økning ca 5 ganger i SQ20B uttrykke
NES-hTERT (fig. 5B). Ingen signifikante forskjeller i basaldosen av døde /apoptotiske celler ble detektert ved sammenligning av ubehandlet SQ20B med mutant-uttrykk derivat (Fig. 5B, øvre paneler).
Å se for langsiktige effekter av behandlinger, vi deretter fulgte spredning priser for kontroll og behandlet SQ20B og SQ20B
NES-hTERT for 2 uker etter at H
2o
2 eksponering. Like mange levedyktige kontroll og behandlede celler (0,5 × 10
6) ble belagt og deres antall telles ved hjelp av en hemocytometer i de første 24 timene, og hver gang celler nådd 100% samløpet etterpå. Mens kontroller og behandlet SQ20B doblet i antall minst en gang i de første 24 timene, ble ingen endring i celle nummer observert i behandlet SQ20B
NES-hTERT (Fig. 5C). Bemerkelsesverdig, disse cellene forble hvilende i ytterligere 2 uker når de til slutt begynte en dobling (data ikke vist). Disse resultatene er spesielt interessant i betraktning at SQ20B havn en mutert p53 som er i stand til å indusere G1-S sjekkpunktet på DNA-skade [46], [47].
Tatt sammen dataene som er vist i fig. 5 viser at uttrykk for
NES-hTERT er i stand til å bevisstgjøre SQ20B til y-stråling og mot oksidativt stress forårsaket av H
2o
2.
Diskusjoner
I studien viste vi at innføringen av
NES-hTERT, en mutant som er defekt i atom cytoplasma skyt, til plateepitel karsinom (SQ20B) og prostatakreft (LNCaP) celler fører til store forsinkelser i cellecyklusprogresjonen, redusert spredning hastighet og forankrings-uavhengig vekst (figur 1, 2). Disse effektene ble ikke assosiert med redusert endogen telomeraseaktivitet enzymatisk aktivitet, siden ekspresjon av det mutante hTERT endret ikke TRAP-aktivitet (Fig. 3). Vi har også observert økt DNA skade i telomeric og ekstra telomeric nettsteder, og høyere antall mtDNA lesjoner under normale forhold ved ekspresjon av
NES-hTERT (Fig. 4). Bemerkelsesverdig, den hTERT mutant sensibilisert SQ20B celler som ellers er svært motstandsdyktig mot ioniserende stråling-indusert DNA-skade og celledød indusert av H
2o
2 (fig. 5). Til sammen våre data tyder manipulere NES av hTERT eller telomerase er subcellulære skyt som roman og effektivt betyr å motvirke svulstcellevekst.
NES-hTERT påvirker cellesyklus og tumorigenicity av kreft celler
i
