Abstract
Bakgrunn
lysosome-assosiert protein trans 4b-35 (LAPTM4B-35) er et medlem av pattedyr 4-tetratransmembrane dekkende protein super, som er overuttrykt i flere solide maligniteter . Imidlertid er det uttrykk for LAPTM4B-35 og dens rolle i progresjonen av prostatacancer (PCA) ukjent. Hensikten med denne studien var å undersøke LAPTM4B-35 uttrykk ved PCA og dets potensial relevans for clinicopathological variabler og prognose.
Metoder
Immunohistochemistry ble brukt til å bestemme uttrykket av LAPTM4B-35 protein i 180 PCA vev sammenlignet med 180 normale benign prostatahyperplasi (BPH) prøver. Sammenhengen mellom ekspresjonen av LAPTM4B-35-protein, og de clinicopathologic karakteristika for pasienter med PCa ble analysert.
Resultatene
Statistisk analyse viste at LAPTM4B-35 ekspresjon ble betydelig forhøyet i forhold til PCa de BPH kontroller. Høy LAPTM4B-35-farging var til stede i 71,11% av alle tilfellene med PCa. Overekspresjon av LAPTM4B-35 var signifikant forbundet med lymfeknutemetastase, sædvæske invasjon, PCA scenen, høyere Gleason score, høyere preoperativ PSA, og biokjemisk tilbakefall (BCR). Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at den høye uttrykk for LAPTM4B-35 var knyttet til dårlig total overlevelse og BCR overlevelse av pasienter med PCa. Multivariat Cox analyse viste at LAPTM4B-35 var et uavhengig prognostisk faktor for både total overlevelse og BCR-overlevelse av pasienter med PCa.
Konklusjoner
Overekspresjon av LAPTM4B-35 kan være forbundet med tumor progresjon og dårlig prognose ved PCA og dermed kan fungere som en ny molekylær markør for å forutsi prognosen for PCA pasienter
Citation. Zhang H, Wei Q, Liu R, Qi S, Liang P, Qi C, et al. (2014) Overuttrykte LAPTM4B-35: A Novel Marker av dårlig prognose av prostatakreft. PLoS ONE 9 (3): e91069. doi: 10,1371 /journal.pone.0091069
Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 25 august 2013; Godkjent: 07.02.2014; Publisert: 20 mars 2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (NO: 81172451), Tianjin Major Anti-Cancer Project (12ZCDZSY17200), og stiftelsen av Tianjin Medical university Science. (NO: 2009GSI18). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Som den mest vanlige ondartede svulster hos menn, er prostatakreft (PCA) den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA [1]. Selv om prognosen for pasienter med lokalisert eller regional sykdom er bra, for pasienter i USA som utvikler metastatisk sykdom, er det 5-års overlevelse bare 29% [2]. Men de molekylære mekanismene bak kreftutvikling og progresjon av PCa ennå ikke er fullt ut explicated. Derfor arbeidet med å identifisere flere molekylære markører som kan brukes til å oppdage PCa samt individual både pasient prognose og terapi er av stor klinisk betydning.
Vanlige prognostiske faktorer som Gleason score, preoperativ PSA nivåer eller forhold på involverte biopsier bare utilstrekkelig forutsi pasientens utfall for tiden tilgjengelig behandling. De er enda mer begrenset i å identifisere ubetydelig prostatakreft, dvs. kreft som kan stå ubehandlet uten forkorte pasientens levetid, men skåner ham sykelighet av uberettiget behandling. Derfor ytterligere innsats for å finne nye diagnostiske stier og behandlingsalternativene er sterkt etterspurt for å optimalisere pasientoppfølging [3] – [6]. Identifisering av nye prostata kreft biomarkører bør være av første kliniske prioritet, når man tar i betraktning den problematiske heterogenitet av prostatakreft og de løsningene som personlig medisin kan gi. Disse biomarkører bør være i stand til å øke differensialdiagnose og indikerer forløpet av PCa sykdom så tidlig og så nøyaktig som mulig, noe som til syvende og sist å begrense mengden av ikke-essensielle medisinske prosedyrer [7] – [10]. Tissue biomarkører kan berike betydelig denne tilnærmingen ved å gi meningsfull informasjon for forvaltningen av PCa via utnyttelse av prøver fra biopsier eller prostatectomies [8], [11].
Nylig LAPTM4B (lysosomal protein transmem-Brane 4A) , som opprinnelig ble identifisert som en ny gen oppregulert på humane leverkreft [12], [13], ble vellykket klonet ved fluorescens differensial display, rask amplifikasjon av cDNA-ender, og revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon. Det har blitt demonstrert at LAPTM4B genet er kartlagt til kromosom 8q22.1 med et mRNA som består av 7 eksoner og koder for et 35 kDa-protein, LAPTM4B-35, som er en type-III-transmembranprotein med fire antatte transmembranområdene. Studier har vist at aktiviteten av LAPTM4B-35 er forhøyet i flere humane kreftformer. Videre er overekspresjon av LAPTM4B-35 assosiert med en dårlig prognose og bidrar til cellulær transformasjon, tumorgenesis, og metastatisk progresjon i disse kreftformene [14] – [18]. Men clinicopathologic betydning og biologisk rolle LAPTM4B-35 ved PCA fortsatt uklare.
Til dags dato har det ikke vært noen publiserte rapporter som evaluerer rollen LAPTM4B-35 uttrykk ved PCA. Dermed er målet med denne studien var å undersøke uttrykket av LAPTM4B-35 ved PCA og å analysere dens forhold til ulike clinicopathologic egenskaper, herunder PCa pasientens utfall.
Materialer og metoder
Pasient og vevsprøver
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene. Godkjenning fra Medical Ethics Committee of Tianjin Medical University ble oppnådd for det formål forskning (TMUhMEC2012015). Etter Institutional Review Board godkjenning, arkivert formalinfiksert, ble parafininnstøpte prøver innhentet fra 180 pasienter med PCa og 180 pasienter med benign prostatahyperplasi (BPH), som ble kirurgisk behandlet på andre sykehus i Tianjin Medical University, Tianjin, Kina mellom januar 1999 og desember 2010 [19] – [21]. Alle vevsprøver og lysbilder ble undersøkt av erfarne patologer. Ingen av pasientene har mottatt kjemoterapi, immunterapi, eller radioterapi før kirurgi. De clinicopathological funksjonene pasienter, inkludert preoperativ PSA, Gleason score, PCA scenen, lymfeknute status, angiolymphatic invasjon status, kirurgisk margin status, sædvæske invasjon status, og BCR er oppsummert i tabell 1.
immunhistokjemisk farging
ble oppnådd Fire-mikrometer seksjoner på formalinfiksert, parafininnstøpte prøvene, fulgt av hematoxylin og eosin farging for PCa patologi bekreftelse. Vi tok delene umiddelbart tilstøtende hematoksylin og eosin-farget deler for immunhistokjemi og deparaffinized de utvalgte vev i xylen og rehydrert med graderte alkoholkonsentrasjoner i henhold til standard prosedyrer. Deretter ble deparaffinized seksjonene neddykket i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0) og oppvarmes i femten minutter i en mikrobølgeovn. Etter sekvensiell inkubasjon med 3% hydrogenperoksid og 10% normalt geiteserum i ti minutter hver for seg, endogen peroksidaseaktivitet og ikke-spesifikk immunoglobulin binding ble blokkert etter hverandre i nevnte rekkefølge. Deretter ble avidin-biotin immunoperoxidase teknikk tatt i bruk for å utføre immunhistokjemisk farging. Seksjoner ble inkubert i en time med primært kanin-anti-humant polyklonalt antistoff LAPTM4B-35-antistoff (fortynning, 1:100) (LAPTM4BN199-Pab; Abcam Co) ved romtemperatur, skylt og inkubert i 30 minutter med biotinylert sekundært antistoff. Etter at delene ble vasket grundig med vann, ble de inkubert med en biotin-merket sekundært antistoff, etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert streptavidin i tretti minutter hver. Inkubering med 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid i 0,01% H2O2 i 10 minutter levert fargeutvikling. Deretter ble platene motfarget med hematoksylin Meyer for tretti til seksti sekunder, og ble montert i vandig medium montering. Til slutt, immunhistokjemi ble utført med en immunhistokjemi kit, etter produsentens anvisninger. Negative slides ble farget med kaninserum.
Farging Evaluering
LAPTM4B-35 protein uttrykk nivåer ble klassifisert semikvantitativt basert på den totale kombinerte score til andelen positive-flekker tumorceller og fargeintensitet [21]. Prosentandelen av positive celler, målt som omfanget av farging, ble bedømt som følger: 0, mindre enn 5% fuktighet; 1, 5% til 50%; og 3, 50% farging. Den fargeintensitet ble scoret som følger: 0, ingen flekker eller bare svak farging; 1, moderat farging; og 2, sterk farging. Fargingsintensitet pluss prosenten av positiv farging ble anvendt for å definere uttrykket nivåer: 0 til 2, lav ekspresjon og 3 til 4, høy ekspresjon [21]. Scoringen prosedyren ble utført i duplikat av 2 uavhengige patologer som har erfaring i å vurdere immunhistokjemi og hadde ingen kunnskap om clinicopathologic informasjon eller tilsvarende hematoxylin og eosin lysbilder. Den samstemmighet mellom de to primære patologer var større enn 96%. I tilfeller med betydelig uenighet, lysbildene aktuelle gjen anmeldt samtidig av de opprinnelige to patologer, sammen med en tredje patolog ved et mangehodet mikroskop, for å løse delt mening.
Statistical Analysis
chi-kvadrat test ble brukt til å analysere forskjeller i kategoriske variabler. Total overlevelse og BCR overlevelse ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier metoden og evaluert av log-rank test. Cox regresjon (proporsjonal risikomodell) ble utført for multivariat analyse av prognostiske prediktorer. P 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 programvare.
Resultater
LAPTM4B-35 protein er overuttrykt i PCA vev
LAPTM4B-35 uttrykk ble overuttrykt i PCA tilfeller sammenlignet med BPH , og forskjellen var statistisk signifikant (P 0,001) (tabell 1). Som vist i figurene S1, S2, S3, S4, den LAPTM4B-35 ekspresjon ble lokalisert i cytoplasma av prostataceller. Av de 180 prøvene med PCa undersøkt, LAPTM4B-35 ekspresjon var lav i 52 (28,89%) av 180 pasienter med PCa og høy i 128 (71,11%) av 180 pasienter. LAPTM4B-35 uttrykk var betydelig høyere i de høyere PCA scenen og sædvæske invasjon tilfeller; LAPTM4B-35 uttrykk ble også betydelig økt i PCA pasienter med lymfeknutemetastaser, høyere preoperativ PSA, høyere Gleason score, og BCR. Videre ble det observert noen signifikant sammenheng mellom LAPTM4B-35 immunoreaktivitets og alder, angiolymphatic invasjon, og kirurgisk margin status. Sammenhengen mellom LAPTM4B-35 uttrykk og clinicopathologic faktorer er vist i tabell 2.
Virkningen av LAPTM4B-35 uttrykk på BCR overlevelse ved PCA
For å undersøke om LAPTM4B- 35 ekspresjonsnivået er en signifikant prediktor for BCR-frihetstiden etter radikal prostatektomi, ble Kaplan-Meier-kurver plottet mellom høy eller lav LAPTM4B-35 og BCR-fri tid. Den lave LAPTM4B-35-ekspresjon var signifikant lenger BCR-frihetstiden etter radikal prostatektomi sammenlignet med pasienter med høyt LAPTM4B-35 uttrykket (P 0,001; fig S5). I univariat analyse, høy uttrykk for LAPTM4B-35, høyere Gleason score, og sædvæske invasjonen var knyttet til en dårlig BCR overlevelse for pasienter med PCa. Multivariat analyse viste at høy LAPTM4B-35 uttrykk, Gleason score, og sædvæske invasjon var de uavhengige prognostiske faktorer for BCR overlevelse. Resultatene er til stede i tabell 3.
Virkningen av LAPTM4B-35 uttrykk på total overlevelse ved PCA
For å undersøke effekten av LAPTM4B-35 overekspresjon på total overlevelse, vi urfremført univariat analyse av tradisjonelle clinicopathologic variabler for prognose. Vesentlige variablene i total overlevelse analyse inkludert LAPTM4B-35 uttrykk, PCA scenen, Gleason score, sædvæske invasjon, og preoperativ PSA. Multivariat Cox regresjonsanalyse melde ovennevnte viktige parametere viste at LAPTM4B-35 uttrykk, PCA scenen, Gleason score, og preoperativ PSA var uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse av pasienter med PCa. Resultatene er vist i tabell 4.
Diskusjoner
I denne studien analyserte vi LAPTM4B-35 uttrykk ved immunhistokjemi ved PCA bruker 180 kirurgiske prøver. Vi analyserte sammenhengen mellom LAPTM4B-35 uttrykk og tradisjonelle clinicopathogical kjennetegn ved PCA. De foreliggende data viste at LAPTM4B-35 overekspresjon var assosiert med dårlig overlevelse ved å analysere total overlevelse og BCR overlevelse. Høy LAPTM4B-35 uttrykk var signifikant korrelert med høyere PCa scenen, sædvæske invasjon, lymfeknutemetastase, høyere preoperativ PSA, høyere Gleason score, og BCR, men ikke med alderen, kirurgisk margin status, og angiolymphatic invasjon. Videre våre data viste også at pasienter med høyt LAPTM4B-35 uttrykk hadde signifikant dårlig total overlevelse og BCR overlevelse ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og log-rank test. Multivariat analyse viste at LAPTM4B-35 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for både total overlevelse og BCR overlevelse hos pasienter med PCa. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som viser i detalj en sammenslutning av clinicopathologic parametere og prognostisk betydning av LAPTM4B-35 overekspresjon ved PCA. Disse resultatene tyder på at høye LAPTM4B-35 ekspresjon spiller en avgjørende rolle i utviklingen av PCa, og er signifikant assosiert med en dårlig prognose uavhengig av andre faktorer. Dette øker muligheten for at LAPTM4B-35 kan være en prognostisk parameter for PCa som er like eller mer pålitelige enn de clinicopathologic faktorer som er i bruk og antyder muligheten for å bruke LAPTM4B-35 i individualisering av både pasient prognose og behandling. Våre resultater er konsistente med tidligere rapporter om rollene til LAPTM4B-35 i tumorprogresjon, inkludert galleblæren karsinom, ovarialcancer, leverkreft, brystkreft, og ekstrahepatiske kolangiokarsinom, og støtter en sammenheng mellom høy uttrykk for LAPTM4B-35 protein og ugunstig biologisk atferd ved PCA.
Men om LAPTM4B-35 er effektiv for klinisk anvendelse som erstatning for, eller i tillegg til, prognostiske parametre som er i bruk er fortsatt uklart, og videre undersøkelser er kalt til å finne ut om kombinert deteksjon av LAPTM4B-35 sammen med noen av disse andre molekyler ville være verdifulle i å forbedre prognostisk effektivitet. Det nære forholdet mellom LAPTM4B-35 overekspresjon og clinicopathological funksjoner spådd at LAPTM4B-35 kan spille en viktig rolle i kreftutvikling og tumorprogresjon. Foreløpig har det vært noen ledetråder som er i stand til å bidra til å forklare dens mekanismer. Ifølge publiserte data fra enkelte forfattere, overekspresjon av LAPTM4B-35 resulterer i aktivering av noen protooncogener, for eksempel c-myc, c-jun, og c-fos, og malign transformasjon i enkelte cellelinjer [22], [23] . Så LAPTM4B genet kan tjene som en protoonkogenet gjennom sin oversettelse produkt, LAPTM4B-35. Disse dataene gir et viktig bevis for explicate mekanismen som LAPTM4B ekspresjon bidrar til karsinogenese og tumorprogresjon, selv om rollen til LAPTM4B i signaltransduksjonsveiene i tumorceller er absolutt verdt videre forskning.
Videre er den betydelige rolle LAPTM4B i kreft antyder muligheten for å gjøre det et potensielt mål for anticancer behandling. Det er blitt åpenbart at transfeksjon av LAPTM4B genet promoforankrings-uavhengig vekst og kolonidannelse av HLE cellene, mens anti-sense-oligonukleotider mot LAPTM4B inhiberte proliferasjon av BEL-7402, en leverkreft cellelinje hvori LAPTM4B ekspresjon ble funnet. Videre er en høy homologi med LAPTM4A indikerte at LAPTM4B kan ha en tilsvarende funksjon i multimedikamentresistens [24], [25]. Videre den viktige rollen LAPTM4B i kreft antyder muligheten for å gjøre det et potensielt mål for anticancer behandling. Noen tidligere studier indikerte at LAPTM4B kan være et nytt mål for terapi. Alle disse resultater indikerer muligheten for å foreta LAPTM4B som et potensielt mål for behandling av PCa. Definitivt, er fortsatt sterk støtte fra grunnleggende undersøkelser nødvendig.
Vår studie har noen begrensninger. Utvalgsstørrelsen er ikke stor nok. For å løse dette problemet, bør en randomisert studie som undersøkte sammenhengen mellom LAPTM4B-35 uttrykk og prognose bli gjennomført for å bekrefte om LAPTM4B-35 kan brukes som en roman prediktor for PCa prognose. Oppsummert er dette den første studien som viser en sammenheng mellom LAPTM4B-35 overekspresjon og PCa. Vi viste at LAPTM4B-35 er overuttrykt i en stor andel av pasientene med PCA og høy LAPTM4B-35 uttrykk korrelert med PCa progresjon og dårlig prognose ved PCA. Videre kan LAPTM4B-35 være et attraktivt mål for behandling PCa. Men disse funnene gjenstår å bli bekreftet av fremtidige studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Representant fotografi som viser høy LAPTM4B-35 uttrykk ved PCA ved immunhistokjemi. Original forstørrelse, × 200
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Representant fotografi som viser lav LAPTM4B-35 uttrykk ved PCA ved immunhistokjemi. Original forstørrelse, × 200
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Representant fotografi som viser lav LAPTM4B-35 uttrykk i BPH ved immunhistokjemi. Original forstørrelse, × 200
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Representant fotografi som viser ingen LAPTM4B-35 uttrykk ved PCA ved immunhistokjemi (negativ kontroll). Original forstørrelse, × 200
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Sammenhenger mellom LAPTM4B-35 uttrykk og BCR-fri tid etter radikal prostatektomi i PCA pasienter. Pasienter med høy LAPTM4B-35 uttrykk viste signifikant kortere BCR overlevelse enn de med lav LAPTM4B-35 uttrykk (P 0,001, log-rank test)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091069.s005
(TIF)
