Abstract
mikroRNA 130b (MIR-130b) er betydelig dysregulerte i ulike humane tumortyper. I denne studien, ved hjelp av en microarray analyse, preget vi oppregulering av MIR-130b uttrykk i kolorektal kreft (CRC) prøver. Men det er begrenset kunnskap om rollene til avvikende MIR-130b uttrykk i CRC. Våre studier i CRC-celler viste at MIR-130b reduserer signifikant cellemigrering og invasjon, men det har ingen tydeligvis effekter på celleproliferasjon og apoptose. I overekspresjon MIR-130b CRC-celler og CRC-prøver, ble det observert et redusert nivå av integrin β1 protein, som er ansett som et viktig molekyl som er involvert i celle-motilitet. Satsingen på 3′-UTR regionen inte β1 genet ved MIR-130b ble avslørt ved hjelp av en luciferase reporter analysen. Reguleringen av inte β1 av MIR-130b ble videre vist ved hjelp av MIR-130b ligner og hemmer av MIR-130b. Den svekket bevegelighet av Mir-130b overekspresjon celler gjenvinnes delvis av uttrykket av integrin β1 mangler 3′-UTR. I tillegg er knockdown av integrin β1 gir også opphav til en reduksjon i cellemigrering og invasjon, som er lik den hindret motilitet på grunn av overekspresjon av MIR-130b i CRC-celler. Videre ble inverse uttrykk for MIR-130b og integrin β1 observert i CRC prøver. Oppsummert disse dataene viser at Mir-130b nedregulerer sin target-inte β1, som fører til svekket migrasjon og invasjon av CRC celler
Citation. Zhao Y, Miao G, Li Y, Isaji T, Gu J Li J, et al. (2014) mikroRNA 130b undertrykker Migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler gjennom nedregulering av Inte β1. PLoS ONE 9 (2): e87938. doi: 10,1371 /journal.pone.0087938
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 07.11.2013; Godkjent: 03.12.2013; Publisert: 03.02.2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China Grant 81101859, National Natural Science Foundation of China Grant 81270379, National Natural Science Foundation of China Grant 81070231 og Beijing Natural Science Foundation 5102039. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (miRNA) er korte ikke- -kodende RNA-er fra 24 til 25 nukleotider som medierer gen tie gjennom ufullkommen hybridisering til 3 «utranslatert region (3»-UTR) i mål-mRNA [1]. Mirnas spiller viktige roller i praktisk talt alle biologiske aktiviteter hos pattedyr og andre flercellede organismer [2]. Videre har det blitt rapportert at mirnas påvirke en rekke kreftrelevante prosesser som migrering, proliferasjon. Enda viktigere er mikroRNA molekyler allerede inn klinikken som diagnostiske og prognostiske biomarkører for pasientutvelgelse og også som terapeutiske mål og midler [3]. Nylig er MIR-130b avslørt som en av nye kreftrelaterte mirnas og har betydelig dysregulerte i svulster av en omfattende meta-analyse av miRNA uttrykk microarray datasett, som består av 33 sammenligninger og nesten 4000 svulst og tilhørende nontumors prøver [4]. Følgelig har MIR-130b blitt funnet oppregulert i ulike typer kreft: magekreft [5], [6], kutant malignt melanom [7], hode og nakke plateepitelkarsinom [8] og blærekreft [9]. Sammen har det blitt anslått at Mir-130b spiller nøkkelroller i løpet onkogenese.
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og andre kvinner over hele verden. Omtrent 608,000 dødsfall fra tykk- og endetarmskreft er anslått over hele verden, og er den fjerde største årsaken til kreftdød [10]. For tiden er en av hindringene i kreftbehandling er den høye frekvensen av tumormetastase. Den metastatisk prosess følger av en rekke trinn: først, kreftceller i primærtumor bryte vekk fra nabocellene og invaderer basalmembran. Denne lokal invasjon kan ofte være utløst av kontekstuelle signaler som forårsaker kreft celler til å gjennomgå en epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [11]. Etter intravasation, kan cellene ekstravasere fra sirkulasjonen i det omkringliggende vev, hvor de kan forbli sovende eller initiere og opprettholde veksten å danne angiogene metastaser [12], [13]. Metastase er den viktigste dødsårsaken i mange kreftformer, inkludert CRC [14] – [16]. Derfor er en bedre forståelse av molekylære mekanismene bak metastase pålagt å legge til rette for utvikling av effektive terapeutiske strategier for pasienter med CRC.
I vår studie sammenlignet vi miRNA uttrykket i prøver fra CRC pasienter som bruker en mikroRNA microarray og observert betydelig oppregulering av MIR-130b uttrykt i CRC prøver. For å få innsikt i rollene MIR-130b i CRC, undersøkte vi effekten av MIR-130b i CRC celler og CRC prøver. Våre data antydet at inte β1 er et mål gen av MIR-130b og nedregulering av inte β1 av MIR-130b fører til nedsatt migrasjon og invasjon av CRC celler.
eksperimentelle prosedyrer
Clinical eksemplarer
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP og tilstøtende prøver kontroll vev ble oppnådd fra 33 pasienter i Beijing Hospital, Helsedepartementet (Beijing, Kina) etter kirurgisk reseksjon. De tumorvev og tilstøtende normale vev ble frosset i flytende nitrogen etter reseksjon. Ingen pasienter i denne studien fikk cellegift eller strålebehandling før operasjonen. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for bruk av sine vev, i henhold til Helsinkideklarasjonen. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen av Beijing Institute of Geriatri, Helsedepartementet.
mikroRNA microarray analyse
Små RNA ble isolert fra tumorvev og tilstøtende normalt vev. De kvalitetskontroll, merking, hybridisering og skanning prosedyrer ble utført ved CapitalBio (Beijing, Kina), ved hjelp av Affymetrix sin Genechip miRNA rekke chip V1.0. Differensielt uttrykte gener mellom tumorvev og tilstøtende normale vev ble analysert ved hjelp av SAM programvare 3,02. Mirnas som oppfylte kriteriene for q-verdi (%) ≤5 og kaste endring ≥2 eller fold endring ≤0.05 mellom gruppene ble ansett for å være vesentlig annerledes. Heat kartet ble utført ved hjelp Cluster 3.0 pakke programvare. Dataene som presenteres i denne studien har blitt deponert i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), og er tilgjengelig gjennom GEO sjonsnummer GSE53592.
Cell kultur
menneskelige kolorektal kreft cellelinjer SW-480 og SW-620 ble kjøpt fra celle~~POS=TRUNC Resource Center, IBMs, CAMS /PUMS og bestått i mindre enn 6 måneder. Celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) med 10% FBS (Gibco, Paisley, UK) og 2 mmol /L L-glutamin (Gibco, Paisley, UK), 100 U /ml penicillin (Gibco, Paisley, UK), og 100 mikrogram /ml streptomycin sulfat (Gibco, Paisley, UK).
Pri-MIR-130b kloning, lentivirus produksjon og transduksjon
Den menneskelige primære mikroRNA 130b genet (pri-MIR-130b) ble amplifisert ved hjelp av PCR av humant genomisk DNA ved å bruke de følgende primere: 5′-Forward ATATTCTCGAGGGGGATCTCCC-3 «og 5′-revers ATATCGGATCCTCTTACCCCAG-3», og deretter subklonet inn i pLVX-IRES-Hyg vektor ( Takara, Dalian, Kina) til å generere pLVX-MIR-130b. Viruspartiklene ble høstet 48 timer etter transfeksjon av pLVX-MIR-130b i HEK-293T celler ved hjelp av Lenti-HT emballasje mix (Takara, Dalian, Kina). De SW480-celler ble infisert med det rekombinante høstet lentivirus i nærvær av 6 ug /ml polybrene (Sigma, St. Louis, USA). De SW480-celler ble holdt i komplett vekstmedium i nærvær av 1 mg /ml Hygromycin (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). PCR fragment av pri-MIR-130b ble også subklonet inn i pWPI lentiviral vektor (Addgene, Cambridge, MA, USA) for å generere pWPI-MIR-130b. Den tomme pWPI vektor som koder for grønt fluorescerende protein (GFP), ble anvendt som kontroll. Viruspartiklene ble høstet som beskrevet tidligere. De SW620-celler som stabilt uttrykker GFP ble selektert ved fluorescent-aktivert cellesortering (FACS), med bruk av en Vantage SE diva cellesorterer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
RNA reversert transkripsjon og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyser
Den totale RNA, inkludert små RNA ble ekstrahert fra kliniske prøver eller fra CRC celler med en Mirvana mikroRNA Isolation Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) og utsatt for revers transkripsjon. QRT-PCR ble utført ved hjelp av med SYBR Premiks Ex Taq mix (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner, og prøvene ble kjørt på en iQ5 Flerfarget Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, USA) . Termiske reaksjons sykluser med 95 ° C i 30 s, og 45 repetisjoner av 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 20 s ble anvendt. Primerne som ble brukt var som følger: HSA-MIR-130b fremover 5′-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3 «HSA-MIR-130b revers 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6 Videre 5»-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 «; U6 Omvendt 5»-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3 «
luciferase reporter-analyse
Full-lengde 3′-utranslatert region (3′-UTR) fragmenter av integrin β1-genet ble amplifisert ved PCR fra humant genomisk DNA ved hjelp av primere Forward 5′-GTACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 «og bakover 5»-TGCTTTTCCTCAACTTCTTTAATC-3, og ble klonet inn i en pMD18-T vektor (Takara, Dalian, Kina).
Sac
I-
Sal
I-fordøyd produkter ble klonet inn i en pmirGlo Dual-luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor (Promega, Madison, USA) for å danne 3′-UTR-luciferase reporter vektor . De SW480-celler ble transfektert i 24-brønners plater ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) med 3′-UTR-luciferase reporter-vektoren og de angitte mirnas. Tjuefire timer etter transfeksjon, ildflue og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt fortløpende ved hjelp av dual-luciferase assay (Promega, Madison, USA), i henhold til produsentens protokoller. Negativ kontroll vektor ble samlet ved å klone det samme 3′-UTR av integrin β1 genet i motsatt orientering. Aktiviteten av prøvene ble målt i en GloMax 20/20 Luminometer (Promega, Madison, USA). Den ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert ved Renilla luciferaseaktivitet for transfeksjonseffektivitet.
Cell transfeksjon
Plasmidet anvendt for å uttrykke integrin β1 som mangler 3′-UTR (β1-ORF) ble beskrevet tidligere [17]. Vi brukte pWPI vektor som en kontroll. HSA-MIR-130b ligner, HSA-MIR-130b inhibitor (anti-MIR-130b), kontroll etterligner og siRNA mot integrin β1 [18] ble syntetisert ved Ribobio (Guangzhou, Kina). Sekvensene som ble brukt var som følger: HSA-MIR-130b etterligner, 5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3 «; HSA-MIR-130b inhibitor, 5»-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3 «; integrin β1 siRNA, (sense) 5»-GGAACAGCAGAGAAGCUCA-3 «[18]; De SW480 celler ble transfektert hjelp RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, USA) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Cell migrasjon analysen og invasjon analysen
Cell migrasjon analysen ble evaluert med Transwell kamre (8-mikrometer, BD Bioscience, San Jose, USA). 5 x 10
5-celler ble plassert i det øvre kammer av hvert innsats, og 500 ul av fullstendig medium ble tilsatt til den nederste brønnen. Cellene som ikke migrerte ble fjernet fra de øvre overflatene av de filtere ved anvendelse av bomullspinner, og cellene som hadde migrert til de nedre overflater av filtrene ble fiksert med 4% paraformaldehydløsning og farget med 0,1% krystallfiolett. Bilder av tre tilfeldige felt ble tatt fra hver membran, og antallet trekkende celler ble talt. Lignende innsatser belagt med matrigel ble anvendt for å bestemme den invasive potensialet.
celleproliferasjonsanalyse
Celleformering ble bestemt ved anvendelse av en tetrazolium-forbindelse [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) 5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium, indre salt (MTS) (CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) (Promega, Madison, USA), i henhold til produsentens protokoll . I korthet, ved de angitte tider, er analyser utført ved tilsetning av den CellTiter 96 Aqueous One Solution reagens direkte til kulturbrønnene, inkubering i 2 timer og deretter registrering av absorbansen ved 490 nm med en 96-brønners plateleser.
Western blotting
Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (Millipore, Billerica, USA). Membranen ble blokkert med 5% fettfri melk og inkubert med mus anti-inte β1 (1/2500, BD Biosciences, San Jose, USA), mus anti-E-cadherin (1/2000, BD Biosciences, San Jose, USA), kanin-anti-kaspase 3 (1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), kanin-anti-kaspase 8 (1/800, Millipore, Billerica, USA) eller mus anti-GAPDH (1/10000, Sigma , St Louis, USA) antistoffer.
Statistisk analyse
data er presentert som gjennomsnitt ± sD Den statistiske signifikans mellom gruppene ble vurdert av Student
t
-test. En verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikans
Resultater
Påvisning av økt miRNA-130b nivåer i CRC prøver
Ved hjelp av en microarray analyse, preget vi miRNA uttrykket i kolorektal kreft (CRC) vev og marsjerte tilstøtende normalt vev høstet fra 3 pasienter (P1, P2 og P3). Karakteriseringen av CRC pasientene er beskrevet i Tabell 1. Vi testet differensial miRNA som uttrykker hjelp av SAM pakken. De 31 signifikant oppregulert mirnas (Fig. 1a) probe sett (fold≥2) ble identifisert i CRC prøver. Og de 17 signifikant nedregulert mirnas ble vist i tabell S1. I microarray leselig, la vi merke til at MIR-130b er en av betydelig oppregulert miRNAs. Et økende antall studier har rapportert MIR-130b som tumorrelaterte miRNA og MIR-130b spiller en viktig rolle under onkogenese [4]. For bedre å forstå dens potensielle funksjoner i CRC, vi først brukte QRT-PCR for å bekrefte MIR-130b uttrykk i de 3 CRC pasienter (Fig. 1B). I samsvar med microarray leselig i fig. 1A, QRT-PCR resultatene viste forbedret uttrykk for MIR-130b i de 3 CRC tumorvev (Fig. 1B). Vi generert lentiviral vektor uttrykke primær mikroRNA 130b (Lenti-pri-MIR-130b) (Fig. 1C øvre panel), og konstruert SW-480 celler med stabil overekspresjon av MIR-130b (Lenti-MIR-130b celler) og de respektive kontroll (Lenti-vektor-celler). Vi har funnet at nivåene av det modne MIR-130b er betydelig økt i de fire kolonier av Lenti-MIR-130b-celler, sammenlignet med Lenti-vektor-celler (fig. 1C nedre panel).
A
, Heat kart diagram av de 31 betydelig forhøyet mirnas i kolorektal kreft vev sammenlignet med matchede tilstøtende kontroll vev fra 3 pasienter (P1, P2 og P3). De tilstøtende kontroll vev er referert til N1, N2 og N3. Tumorene er referert til T1, T2 og T3. Mirnas er vist i rader. Prøver som er vist i kolonnene. Rødt på fargelinjen indikerer høyere uttrykk og blått indikerer lavere uttrykk. MiR-130b (
Red Arrow
) er en av betydelig oppregulert miRNAs.
B
, Relative uttrykk for MIR-130b (normalisert til U6) i svulster enn tilstøtende kontroll vev (T /N) fra P1, P2 og P3, fastsatt av QRT-PCR (gjennomsnitt ± SD, n = 3).
C
,
Øvre panel
: Prinsippskisse av en lentiviral pLVX-IRES-Hyg vektor som inneholder primær mikroRNA 130b (Lenti-MIR-130b).
Nedre panel
: Relative uttrykk for MIR-130b (normalisert til U6) i SW480 celler som stabilt uttrykker Mir-130b (Lenti-MIR-130b) eller kontroll (Lenti-kontroll), undersøkt ved QRT-PCR ( gjennomsnitt ± sD; n = 3). De fire kolonier av Lenti-MIR-130b cellene blir referert til 1,2,3,4.
MiR-130b reduserer migrasjon og invasjon av CRC celler
neste undersøkt hvordan MIR-130b kan fungere i kolorektal kreft celler. De Lenti-vektor celler og Lenti-MIR-130b celler ble brukt til å analysere virkningene av MIR-130b på CRC celler. Cellene ble først utsatt for migrering og invasjon assay assay, respektivt. Vi observerte at MIR-130b inhiberer migrasjonen av de Lenti-MIR-130b-celler (Fig. 2A) i betydelig grad. Vi undersøkte deretter effekten av MIR-130b på invasivitet av cellene ved hjelp av matrigel invasjon analysesystemet. I samsvar med den følge av migrasjon analysen er invasive betydelig redusert i Lenti-MIR-130b celler (Fig. 2B). Interessant er det ingen signifikant forskjell i spredning mellom Lenti-vektor celler og Lenti-MIR-130b-celler (Fig. 2C). Videre vi ikke observere de åpen ulike uttrykk nivåer av apoptotisk caspases- caspase 3 og caspase 8 mellom Lenti-vektor celler og Lenti-MIR-130b celler (Fig. 2D). Alle disse resultatene antydet at overekspresjon av MIR-130b resulterer i nedsatt cellemotilitet av CRC celler, men det har ingen effekt på spredning og apoptose av CRC celler.
A, B
, Transwell migrasjon (
A
) og invasjon (
B
) analyser av Lenti-kontrollceller og Lenti-MIR-130b celler (skala bar = 100 mikrometer; gjennomsnitt ± sD, n = 4; *
P
0,05; **
P
0,01). Representative bilder av migrerte celler (
A
) og invaderte celler (
B
) vises.
C
, Spredning av Lenti-kontrollceller og Lenti-MIR-130b celler målt ved MTS analysen under tre dagers tid kurs (gjennomsnitt ± s.d .; n = 4).
D
, analyser Western blot av caspase-3 og caspase-8 uttrykk i Lenti-kontrollceller og Lenti-MIR-130b celler fra tre uavhengige eksperimenter. GAPDH brukes som lasting kontroll.
MiR-130b undertrykker inte β1 uttrykk via sin 3′-UTR
Vi undersøkt videre mekanismen som MIR-130b påvirker bevegeligheten av CRC celler . Våre tidligere undersøkelser hadde vist at den post-translasjonell modifikasjon spiller en viktig rolle i integrin-medierte migrasjon [17], [19], [20]. Integriner er en familie av celleadhesjonsmolekyler som omfatter 18α og 8p-underenheter som kombineres til minst 24 heterodimerer. Enda viktigere, cytoplasmaområde av inte β1 transduces toveis signaler fra inne i cellen ved å regulere konformasjon og ligand slektskap av det ekstracellulære domenet (innsiden ut signal), mens formidling nedstrøms signalering og samhandling med cytoskjelettet (utenfor bygd signalering) [ ,,,0],21] – [23]. Så, inte β1 er en viktig regulator involvert i metastaser
in vitro Hotell og
in vivo product: [24] – [27]. I denne studien fant vi at ektopisk uttrykk for MIR-130b i SW480 celler resulterer i en reduksjon i den endogene inte β1 protein nivå på fire Lenti-MIR-130b kolonier av omtrentlig 50%, sammenlignet med de Lenti-vektor celler ( fig. 3A). Konsekvent Resultatet ble observert i SW-620 celler med overekspresjon av MIR-130b (fig. 3B). Imidlertid er det ingen endring i ekspresjonsnivået av E-cadherin (Fig. 3C), som er et nøkkel molekyl involvert i EMT. Og som nevnt før, er EMT det første trinnet i metastasering. Vi undersøkte også ekspresjonen av integrin β1 i 3 par av prøver utsatt for microarray er vist på fig. 1A. I samsvar med dataene i fig. 3A og fig. 3C, er den inte β1 proteinekspresjon ble redusert i tumorvev sammenlignet med de tilsvarende tilstøtende normale vev (Fig. 3D (a)), mens ingen åpenbar forandring av ekspresjon av E-cadherin ble påvist (Fig. 3D (b)) . Det er bemerkelsesverdig at det reduserte nivået av integrin β1 protein ble detektert i overekspresjon MIR-130b CRC-celler (Lenti-MIR-130b celler) og CRC prøver også. Derfor søkte vi å undersøke om MIR-130b kan regulere inte β1
En
,
Øvre panel
. Western blot analyser av inte β1 protein uttrykk i Lenti-kontroll celler og Lenti-MIR-130b celler (SW480 celler) fra tre uavhengige forsøk.
Nedre panel
: Densitometry analyse av Western blot data normalisert med GAPDH (gjennomsnitt ± s.d .; n = 3; *
P
0,05).
B product: (
en
), Relative uttrykk for MIR-130b (normalisert til U6) i SW620 celler infisert med lenti-kontroll virus eller lenti-MIR-130b virus, undersøkt ved QRT-PCR (gjennomsnitt ± sD; n = 3). (
b
),
Øvre panel
: Western blot analyser av inte β1 uttrykk i Lenti-kontroll og Lenti-MIR-130b celler (SW620 celler) fra tre uavhengige forsøk.
Nedre panel
: Densitometry analyse av Western blot data normalisert med GAPDH (gjennomsnitt ± s.d .; n = 3; *
P
0,05).
C
, Protein uttrykk for E-cadherin analysert av immunoblot i Lenti-kontrollceller og Lenti-MIR-130b celler fra tre uavhengige eksperimenter. De fire kolonier av Lenti-MIR-130b celler (SW480 celler) er referert til 1,2,3,4. GAPDH brukes som lasting kontroll.
D
uttrykket nivåer av integrin β1 (
en
) og E-cadherin (
b
) ble bestemt ved Western blot analyser ved hjelp av de matchet de tilstøtende kontroll vev ( N) svulster (T) fra tre kolorektal kreftpasienter (Pasient 1, Pasient 2 og pasient 3). Hvert forsøk ble gjentatt tre ganger uavhengig av hverandre. GAPDH brukes som lasting kontroll.
For det første, for å undersøke om MIR-130b var i stand til å samhandle med 3′-UTR av inte β1, gjennomførte vi en luciferase reporter analyser i SW480 celler. Den komplette 3′-UTR av integrin β1-genet ble klonet inn i pmirGlo Dual-luciferase reporter vektor. SW-480-celler ble ko-transfektert med pmirGlo vektor inneholdende det 3′-UTR av integrin ß1 og MIR-130b etterligner (fig. 4A), vil resultatet viste betydelig lavere ekspresjon av luciferase sammenlignet med celler transfektert med den samme reporteren vektor og kontroll mikroRNA etterligner (NC) (fig. 4A). Effekten av MIR-130b på luciferaseekspresjon ble eliminert når 3′-UTR av inte β1 ble klonet i motsatt retning (3′-ITGB1-rev) (figur 4A.). Neste, for å bekrefte reguleringen av MIR-130b til inte β1 i CRC celler, testet vi den inte β1 proteinnivå i cellene transfektert med MIR-130b ligner og MIR-130b inhibitor (Anti-MIR-130b) henholdsvis (Fig. 4B ). Resultatene viste at ekspresjonen av integrin β1 blir undertrykket etter transfeksjon med MIR-130b etterligner (Fig. 4B (a)). Knockdown endogen MIR-130b med MIR-130b inhibitor øker inte β1 uttrykk (Fig. 4B (b)). Til sammen våre data antydet at inte β1 er et mål gen av MIR-130b.
A
, Den komplette 3′-UTR av inte β1 genet (3′-ITGB1) var klonet inn i pmirGlo Dual-luciferase reporter vektor og co-transfektert med MIR-130b ligner (MIR-130b) og kontrollere Mir etterligner (NC) inn i SW480 celler, henholdsvis. En kontroll Vektoren ble dannet ved kloning av det samme 3′-UTR av integrin β1 genet i motsatt orientering (3′-ITGB1-rev). Firefly luciferase aktiviteten ble målt og normalisert til Renilla luciferase aktivitet (gjennomsnitt ± s.d .; n = 3; *, P 0,05).
B
, analyser Western blot av inte β1 uttrykk i SW480 celler transfektert med NC, MIR-130b ligner (
panel en
) og Mir inhibitor kontroll (Anti-NC) eller MIR-130b inhibitor (Anti-MIR-130b) (
panel b
) fra tre uavhengige forsøk. Densitometry analyse av Western blot data normalisert med GAPDH (gjennomsnitt ± SD, n = 3; *
P
0,05)
MiR-130b hemmer celle migrasjon og invasjon. gjennom nedregulering av uttrykket av inte β1
for ytterligere å undersøke at undertrykkelse av inte β1 av MIR-130b resulterer i nedsatt motilitet av Lenti-MIR-130b celler, utførte vi en inte β1 redning eksperiment ved hjelp av Lenti- MIR-130b celler. Vi anvendte en ekspresjonskonstruksjon som koder for integrin β1 åpen leseramme (β1-ORF) som mangler 3′-UTR [17], som gir en mRNA som er motstandsdyktig mot miRNA-mediert undertrykkelse. Vi har observert en klar økning i integrin β1 ekspresjon i Lenti-MIR-130b-celler transfektert med β1-ORF, sammenlignet med cellene med kontroll-vektor (Fig. 5A). Videre celle migrasjon analyser viste at ektopisk ekspresjon av integrin β1-ORF var i stand til delvis utvinning av motiliteten av Lenti-MIR-130b-celler med 76% (Fig. 5B og 5C).
En
,
Venstre panel
: Western blot analyser av inte β1 uttrykk i Lenti-kontrollceller, Lenti-MIR-130b celler, Lenti-MIR-130b celler transfektert med kontroll vektor eller β1-ORF vektor fra tre uavhengige forsøk.
Høyre panel
: Densitometry analyse av Western blot data normalisert med GAPDH (gjennomsnitt ± s.d .; n = 3; *
P
0,05).
B, C
, Transwell migrasjon analyser av cellene (skala bar = 100 mikrometer; gjennomsnitt ± s.d .; n = 3; *
P
0,05). Representative bilder av migrerte celler er vist. Lenti-MIR-130b + kontroll vektor: de Lenti-MIR-130b celler transfektert med kontroll vektor. Lenti-MIR-130b + β1-ORF: de Lenti-MIR-130b celler transfektert med β1-ORF vektor. ORF. Åpne leserammen
Vi har senere hemmet inte β1 uttrykk ved hjelp av en bestemt siRNA [18] i SW-480 celler (figur 6A.). Vi fant at cellevandring (Fig. 6B) og invasjon (Fig. 6C) blir merkbart redusert ved å inhibere integrin β1 uttrykk med en spesifikk siRNA. Derfor er reduksjon av celle motilitet oppnådd gjennom undertrykkelse av integrin β1 uttrykk. Samlet utgjør disse funn viste at MIR-130b undertrykker cellemigrering og invasjon, i hvert fall delvis, gjennom nedregulering av integrin β1 i CRC-celler.
A
, Western blot-analyser vurderes proteinet nivået av integrin β1 i SW480-celler transfektert med et siRNA mot integrin β1 (ß1 siRNA) eller negativ kontroll siRNA (scramble) ved 20 nM og 50 nM respektivt. Hvert forsøk ble gjentatt tre ganger uavhengig av hverandre.
B, C
, Transwell migrasjon (
B
) og invasjon (
C
) analyser av SW480 celler transfektert med β1 siRNA eller krafse på 50 nM (skala bar = 100 um, gjennomsnitt ± sD, n = 3; **
P
0,01). Representative bilder av migrerte celler (
B
) og invaderte celler (
C
) vises.
Inverse sammenheng mellom MIR-130b og inte β1 uttrykk i CRC prøver
for ytterligere å teste sammenhengen mellom integrin β1 og MIR-130b, utvidet vi vår analyse i en kohort av 33 matchede-par av kliniske tilstøtende normal (N) og tykktarms tumorvev (T). Vi analyserte uttrykk for MIR-130b ved QRT-PCR og uttrykket nivået av inte β1 av Western blot. Som vist på fig. 7, ved å sammenligne tumorer til normalt vev, en invers korrelasjon mellom MIR-130b og integrin β1 ekspresjon ble funnet i 23 av 33 (69,7%) par av kliniske prøver. Av de 23 par, 12 par viste økt MIR-130b og redusert inte β1; 11 parene demonstrerte redusert MIR-130b og forhøyet inte β1.
uttrykk for MIR-130b ble målt ved QRT-PCR, uttrykket av inte β1 ble målt ved Western blot analyse i en kohort av 33 matchet a’T tilstøtende normal (N) og tumor (T) vev. Den relative uttrykk forholdet mellom MIR-130b (normalisert til U6) i T løpet N (T /N) ble representert som en fold forskjell (kolonner i mørk grå). Den relative uttrykk forholdet av integrin β1 (normalisert til GAPDH) i T i løpet N (T /N) var representert som en fold forskjell (kolonner i lys grå). gjennomsnitt ± s.d. Hver analyse ble uavhengig gjentatt tre ganger.
Diskusjoner
mikroRNA 130b (MIR-130b) er betydelig dysregulerte i mange humane tumortyper. Imidlertid er rollen til MIR-130b i CRC ikke godt forstått. I denne studien undersøkte vi mikroRNA uttrykk i tykk- og endetarmskreft (CRC) med mikroRNA microarray profilering av svulster og tilstøtende prøver normalt vev. Vi identifiserte 48 signifikant forskjellig uttrykt mirnas forbundet med CRC. MiR-130b er en av de oppregulert miRNAs. Disse data ble ytterligere bekreftet ved QRT-PCR. For å teste potensielle roller økt uttrykk av MIR-130b i CRC, utførte vi funksjonelle analyser etter å konstruere CRC cellelinje med stabil overekspresjon av MIR-130b. Våre data viser at MIR-130b utøver en betydelig hemmende effekt på motilitet av CRC-celler (fig. 2), men har ingen effekt på celleproliferasjon og apoptose. Det har blitt rapportert at i
TAp63
knockout mus modell, nedregulering av MIR-130b ved tap av TAp63 resulterer i en økning i tumormetastase [28]. Undertrykkelse av MIR-130b av en p53 mutant resulterer i forbedring av ZEB1 avhengig EMT og celle invasjon i livmorkreftceller [29]. Alle disse dataene foreslo anti-metastatisk rollen MIR-130b. I tillegg nedregulering av MIR-130b ensidige multiresistent fenotype eggstokkreft celler [30]. Imidlertid har en annen rapport antydet at overekspresjon av MIR-130b i CD133 (+) levertumor initiere celler øker deres selvfornyelse kapasitet og chemoresistance [31]. Disse resultater antyder at MIR-130b kan ha en dobbeltfunksjon som en tumor suppressor eller et onkogen, som avhenger av krefttype og cellulær kontekst.
I denne studien identifiserte vi at integrin β1 er et nytt mål av MIR-130b. En redusert nivå av integrin β1 protein ble observert på grunn av overekspresjon av MIR-130b i CRC-prøver (fig. 3D) og i CRC-celler (fig. 3A og 3B) også. Luciferase reporter-analysen viste at MIR-130b binder til 3′-UTR av integrin β1 og undertrykker dets ekspresjon (Fig. 4). En økning i MIR-130b av MIR-130b ligner transfeksjon fører til redusert uttrykk av inte β1, mens knockdown MIR-130b med MIR-130b inhibitor fører til økt inte β1 uttrykk. Videre er svekket motilitet av MIR-130b overekspresjon celler reddet delvis ved ekspresjon av integrin β1 som mangler 3′-UTR (fig. 5). I tillegg knockdown av integrin β1 gir også opphav til en reduksjon i cellemigrering og invasjon (fig. 6). Disse data indikerte at MIR-130b undertrykker cellemigrasjon og invasjon av CRC-celler, i det minste delvis, gjennom nedregulering av integrin β1. Videre ble omvendt korrelasjon mellom MIR-130b uttrykk og inte β1 uttrykk funnet i 23 av 33 par (69,7%) av CRC kliniske prøver. Inhibering av migrering og invasjon av CRC-celler ved direkte målretting av integrin β1 er i overensstemmelse med den anti-metastatisk rolle er foreslått for MIR-130b [28], [29]. En stor mengde av eksperimentelle bevis støtter en viktig rolle for integrin β1 i løpet av tumorfremkallelse og invasivitet [32] – [36].
