Abstract
Bakgrunn
Aktivering av embryonale signalveier stillestående i den voksne bukspyttkjertelen er en funksjon av kreft i bukspyttkjertelen (PC). Disse funnene har ført til utvikling av nye hemmere av trasé som Notch og Hedgehog signale som er i tidlig fase kliniske studier ved behandling av flere krefttyper. Retinoid signalisering er også viktig for bukspyttkjertelen utvikling, og retinoid terapi er brukt med hell i andre kreftformer som leukemi, men lite er kjent om retinoid signalisering i PC.
metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte rollen retinoid signalise
in vitro Hotell og
in vivo
i normale bukspyttkjertelen, bukspyttkjertel skade, regenerering og kreft. Retinoid signalisering er aktiv i sporadiske celler i den voksne bukspyttkjertelen, men er markert utvidet hele parenchyma under skader og regenerering. Både kjemisk induserte og genetisk konstruerte musemodeller av PC oppviser en mangel på retinoid signale aktivitet sammenlignet med normal pankreas. Som en konsekvens av dette undersøkte vi Cellular Retinoid Binding Protein 1 (CRBP1), en nøkkel regulator av retinoid signale kjent for å spille en rolle i utvikling av brystkreft, som et potensielt terapeutisk mål. Tap, eller betydelig nedregulering av CRBP1 var til stede i 70% av menneskelig PC, og var tydelig i de aller tidligste forstadier (Panin-1A). Men,
in vitro
gevinst og tap av funksjonsstudier og CRBP1 knockout mus foreslo at tap av CRBP1 uttrykk alene var ikke nok til å indusere kreftutvikling eller å endre PC følsomhet for retinoid basert terapi.
Konklusjoner /Betydning
i konklusjonen, synes retinoid signalisering til å spille en rolle i bukspyttkjertelen regenerering og kreftutvikling, men i motsetning til brystkreft, er det ikke formidlet direkte av CRBP1
Citation. Colvin EK, Susanto JM , Kench JG, Ong VN, Mawson A, Pinese M, et al. (2011) retinoid signalisering i bukspyttkjertelkreft, skade og Regeneration. PLoS ONE 6 (12): e29075. doi: 10,1371 /journal.pone.0029075
Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA
mottatt: 24 oktober 2011; Godkjent: 20 november 2011; Publisert: 29.12.2011
Copyright: © 2011 Colvin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den Cancer Institute of New South Wales (CINSW), National Health and Medical Research Council of Australia (# 427655), Kreftrådet New South Wales, St. Vincent Clinic Foundation, Royal Australian College of Surgeons, den australske Cancer Research Foundation, The Avner Nahmani Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Foundation, og RT Hall Trust. AVB er CJS, DKC, EAM og EKC støttet av stipend fra CINSW (06 /RSA /1-05, 08 /RSA /1-15, 07 /CDF /1-28, 09 /CDF /2-40; 10 /CRF /1-01). RLS er en Senior Principal Fellow av NHMRC og holder Petre leder Breast Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Økende bevis støtter en sentral rolle for utviklingssignalveier som Notch [1] og Hedgehog [2], [3], [4] i kreft i bukspyttkjertelen, med hemmere av disse banene i dag tidlig fase kliniske studier . Notch og pinnsvin er også involvert i bukspyttkjertelen skade, regenerering og reparasjon [5], forhold som er kjent for å disponere for kreft. Retinoid signalisering er viktig for embryo bukspyttkjertelen formasjon [6], [7], [8], men lite er kjent om dens potensielle rolle i kreft i bukspyttkjertelen.
Retinoider er naturlig forekommende eller syntetiske Vitamin A-analoger, som har vært anvendt med hell ved behandling av akutt promyelocyttisk leukemi (APL) [9]. Til tross for suksessen av retinoid behandling i APL, har behandling av faste tumorer møtt med begrenset suksess [10], [11], og noen bevis tyder på at denne resistens overfor retinoid terapi kan være på grunn av avvik i retinoid signalering. Nedregulering av retinoid reseptorer har blitt rapportert i mange kreftformer, som brystkreft, lunge, prostata og spiserørskreft [11], og nedregulering av oppstrøms komponentene som er involvert i retinoid metabolisme og lagring er fremstår som mulige viktige regulatorer av kreftutvikling og bidragsytere til motstand mot retinoid basert terapi.
Cellular retinoid bindende protein 1 (CRBP1) spiller en viktig rolle i retinoid signalisering og nedregulering av CRBP1 uttrykk oppstår i brystet [12], prostata [13], mage [14] og eggstokkreft [15] kreft. Tap av CRBP1 ekspresjon i brystepitel fører til tap av differensiering og tumorprogresjon ved å interferere med retinoid lagring og dets metabolisme til den aktive metabolitten, retinsyre, som produserer en lokal retinoid mangel [16], med endret retinoid responsivitet [17] og cellulær transformasjon .
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er den fjerde største årsaken til kreftdød i vestlige samfunn med en samlet 5-års overlevelse på mindre enn 5% [18]. Fremskritt innen neoadjuvant og adjuvant kjemoterapeutiske regimer har resultert i en viss bedring i resultatene, men pancreatectomy fortsatt den mest effektive behandlingsform for PC, og tilbyr den eneste muligheten for helbredelse. Bare 20% av pasienter med lokalisert til stede, ikke-metastatisk sykdom som er egnet for reseksjon [19]. De som gjennomgår reseksjon og motta adjuvant behandling har en median overlevelse på 12-22 måneder, og en 5-års overlevelse på 20-25% [20]. Eksisterende systemisk behandling er bare beskjedent effektive og median overlevelse for pasienter med metastatisk sykdom er fortsatt 6 måneder. Derfor er det et stort behov for å utvikle nye terapeutiske strategier for kreft i bukspyttkjertelen.
Her kan vi identifisere en potensiell rolle for retinoid signalisering i bukspyttkjertelkreft og bukspyttkjertel regenerering og som en konsekvens kan utgjøre en målrettbar mekanisme for utvikling av romanen terapeutiske strategier. Tap av CRBP1, en viktig regulator av retinoid signalisering og viktig i brystkreft, selv om hyppig i PC-en, i motsetning til brystkreft var i seg selv ikke tilstrekkelig til å indusere transformasjon.
Metoder
Etikk erklæringen
Etisk godkjenning for dyreforsøk ble innhentet fra Garvan Institute dyreetikk komité (godkjenningsnummer 09/53, 07/10). Multi etisk godkjenning er innhentet fra menneskeforskningsetiske komiteer fra University undervisning sykehus: Westmead Hospital, Concord Hospital, konge Prince Alfred Hospital og St. Vincent Hospital Campus i Sydney for kjøp av fersk og arkiv vev og registrering av clinicopathological data for pasienter med diagnostisering av kreft i bukspyttkjertelen. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
RARE-lacZ mus
RARE-lacZ mus inneholder en LacZ transgen kontrollert av en retinsyre respons element (sjelden). Celler med aktiv reumatoid artritt signale flekk positiv for β-galaktosidase (β-gal). Ubehandlede dyr (n = 8) ble avlivet ved 10-12 ukers alder og deres bukspyttkjertelen høstet for β-gal farging.
Murine Pankreatitt Modell
En caerulein-indusert modell av kronisk pankreatitt var brukes lik tidligere modeller [21]. Mus (n = 16) ble behandlet med gjentatte intra-peritoneal injeksjoner av caerulein (MP Biomedicals, Solon, OH) fem ganger om dagen, to ganger i uken i 10 uker. I denne modellen komplett acinar celle regenerering er rapportert å forekomme ved 6 uker etter seponering av caerulein behandling. Derfor mus ble ofret på 0, 2, 4 og 6 uker etter opphør av caerulein injeksjoner og deres bukspyttkjertel høstet for å undersøke RA signalering ved forskjellige tidspunkter under utvinning perioden.
Murine bukspyttkjertelkreft Modeller
RARE-lacZ mus (n = 10) 10 ukers alder ble behandlet med 7,12-dimetylbenzantracen (DMBA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som tidligere beskrevet [22]. Mus ble ofret da de demonstrerte tegn på sykdom eller 9 måneder etter DMBA behandling og vev samlet for β-gal farging.
LSL-Kras
G12D /+, LSL-Trp
53R172H /+ og Pdx1-Cre mus ble hentet fra mus modeller av kreft hos mennesker Consortium ved National Cancer Institute (Frederick, MD). For å generere pankreastumorer hvor RA signale aktivitet kunne bli vurdert RARE-lacZ mus ble krysset med LSL-Kras
G12D /+; LSL-Trp
53R172H /+; Pdx1-Cre mus til å generere LSL-Kras
G12D /+; LSL-Trp
53R172H /+; Pdx1-Cre, RARE-LacZ avkom (n = 8). Quadruple transgene mus ble overlatt til alder før svulster dannes på hvilket tidspunkt de ble avlivet og vev ble samlet inn for β-gal farging.
β-galaktosidase flekker
4 mikrometer pankreas seksjoner ble de-vokset og rehydrert før avmaskering ble oppnådd ved anvendelse av target-henting løsning (S2367, pH 9,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) i et kokende vannbad i 20 minutter. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset med 3% hydrogenperoksid i metanol. Seksjoner ble inkubert i 1 time med 1:50 anti-β-galaktosidase (AB616) polyklonalt kanin-antistoff (Abcam, Cambridge, UK). En merket polymer pepperrotperoksidase anti-kanin deteksjonssystem ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Envision + anti-kanin, DAKO Corporation, CA). 3,3′-diaminobenzidin ble brukt som substrat. Counter-farging ble utført med Mayers hematoksylin (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).
Pasient Cohort
Vi identifiserte en kohort av 90 pasienter som gjennomgikk bukspyttkjertelen reseksjon eller biopsi fra disse sykehusene. Denne kohorten representerer en undergruppe av en tidligere beskrevet gruppe av 348 pasienter [23], [24].
CRBP1 Immunohistochemistry
bukspyttkjertelen vev mikro arrays (4 mikrometer seksjoner) ble de-voksede og rehydratisert før avsløring ble oppnådd ved anvendelse av target-henting løsning (S1699, pH 6,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) i en trykkoker i 5 minutter. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset med 3% hydrogenperoksid i metanol. Seksjoner ble inkubert i 1 time med 01:50 anti-CRBP1 (FL-135) polyklonale kanin-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). En merket polymer pepperrotperoksidase anti-kanin deteksjonssystem ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Envision + anti-kanin, DAKO Corporation, Carpenteria, CA). 3,3′-diaminobenzidin ble brukt som substrat. Counter-farging ble utført med Mayers hematoksylin (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).
Opp til tre separate prøver av bukspyttkjertelen ble undersøkt per pasient. Farging ble vurdert av to separate observatører for hvert tilfelle (E.K.C. og S.A.O.). Standardisering av scoring ble oppnådd ved sammenligning av score mellom observatører, og ved konferanser, hvor eventuelle avvik ble løst ved konsensus. Skår ble gitt som en prosentandel av celler med positiv cytoplasmatisk farge innenfor det representative område av vevet mikroarray kjerne, og den absolutte intensitet av cytoplasmatisk farge på en skala fra 0 til 3 (0 representerer ingen farging, en som representerer heterogent, cytoplasmatisk farge, 2 representerer homogent, cytoplasmatisk farge, og 3 representerer sterk homogent, cytoplasmatisk farge). En positiv score for CRBP1 ble gitt basert på følgende kriterier:. 50% av celler som har homogen cytoplasma flekker, med en intensitet på 1
Survival analyse ble utført ved hjelp av Kaplan-Meier analyse, med forskjeller i overlevelse vurdert ved hjelp av log-rank test med Statview 5.0 programvare (Abacus Systems, Berkeley, CA)
bukspyttkjertelen cellelinjer
Seks bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble brukt. ASPC-en, BxPC -3, CAPAN-2, VVS, MiaPaCa2 og PANC1 (ATCC, VA, USA). Disse cellelinjene ble dyrket i henhold til ATCC protokoller. Menneskelig bukspyttkjertelen Ductal Epithelial (HPDE og HPDE-EcoRI) celler ble brukt som en normal kontroll (vennlig levert av Ming-Sound-Tsao, Ontario Cancer Institute) og dyrket som beskrevet tidligere [25].
Western blotting
Protein ekstrakter ble visualisert ved hjelp av 4-12% Bis-Tris prefabrikerte gels (Invitrogen, Victoria, Australia) og overført til PVDF membraner i henhold til produsentens protokoll. Filtrene ble blokkert med 5% skummet melk i TBST-buffer. Anti-CRBP1 antistoff (FL-135) ble anvendt ved 1:500 over natten. Membranene ble deretter inkubert med anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) konjugert med pepperrot peroksidase (1:2000) (Amersham, (GE Healthcare), NSW, Australia) i 1 time ved romtemperatur fulgt av forsterket kjemiluminescens-reagens (Perkin Eimer, Waltham , MA).
RNA ekstraksjon og cDNA syntese
RNA fra bukspyttkjertelen cellelinjer ble hentet ved hjelp Trizol® Reagens (Invitrogen, Victoria, Australia) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved anvendelse ABgene® Reverse-IT ™ RTase Blend (ABgene, Surrey, UK) med en blanding av Oligo dT og tilfeldig heksamer hjelp av First Strand Synthesis metode. Etter denaturering av RNA ved 70 ° C, revers transkripsjon (RT) reaksjoner ble utført i et termo DNA motor dyad ™ (MJ Research, Waltham, MA) med den trinnvise program på 25 ° C i 10 minutter, 35 ° C i 30 minutter, 47 ° C i 45 minutter, deretter 75 ° C i 10 minutter.
Kvantitativ real-Time PCR (QPCR)
TaqMan® genuttrykk analyser (Applied Biosystems, Victoria, Australia) av CRBP1 (Hs00161252_m1) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. GAPDH (4326317E, TaqMan® endogen kontroll) ble anvendt som en endogen kontroll. TaqMan® qPCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer med ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Victoria, Australia). Standardkurver ble inkludert for å sikre at reaksjonene ble utført i det lineære området, og ble brukt til å justere effektiviteten av reaksjonen. Sykkel tilstander inkludert innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 95 ° C (30 sek) og 72 ° C (30 sekunder) i 60 sykluser.
knockdown av CRBP1 i HPDE-celler
To kort hårnål RNA (shRNA) konstruerer målretting CRBP1, siCRBP1-A og siCRBP1-B, samt en kryptert kontroll, siCRBP1-kryptert, (vennlig levert av Nicoletta Sacchi, Roswell Park Cancer Institute, NY) ble transfektert inn Phoenix celler ved hjelp Fugene transfeksjon reagens (Roche, NSW, Australia). Retrovirale supernatanter ble oppsamlet og anvendt for å infisere HPDE-EcoRI-celler. Puromycin (1 pg /ml) ble brukt til å velge med hell infiserte celler. Vellykket knockdown av CRBP1 ble bestemt av western blot.
3D kultur HPDE celler
HPDE-ecor celler infisert med shRNA ble dyrket på kammer lysbilder belagt med vekstfaktor redusert matrigel (BD Biosciences, San slange, CA) i keratinocytt serumfritt medium (Invitrogen, Victoria, Australia) supplert med epidermal vekstfaktor, bovint hypofyse-ekstrakt, 10% føtalt kalveserum og 2% matrigel i 20 dager. Media ble endret etter 4 dager. 3D-strukturer ble gjenfunnet på 3, 7, 10, 15 og 20 dager med BD celle gjenopprettingsløsning (BD Biosciences, San Hose, CA) og protein hentet for western blot.
Stabil transfeksjon av MiaPaCa2 celler
Fire forskjellige kloner av MiaPaCa2 celler som uttrykker ulike nivåer av CRBP1 (MP2
CRBP1 celler) og deres respektive kontroller ble opprettet for å evaluere effekten av CRBP1 uttrykk på MiaPaCa2 celler. Cellene ble opprettet ved hjelp av pcDNA ™ 6.2 /GFP plasmid (Invitrogen, Victoria, Australia) og pQCXIP plasmid (Clontech Laboratories, Mountain, View, CA) som inneholder CRBP1 genet. Vektorene ble transfektert hjelp Amaxa Nucleofector® Technology (Lonza Köln AG, Köln, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene transfektert med pcDNA ™ 6.2 /GFP plasmid ble ytterligere sortert for GFP uttrykk ved hjelp av flowcytometri for å berike populasjon av celler som uttrykker GFP /CRBP1. Ekspresjonen av CRBP1 i hver populasjon ble bekreftet ved western blot. Cellene ble behandlet med 2, 5 eller 10 mM av alt
trans
-retinoic syre (ATRA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MA) på dag 1. Cellene ble høstet og telles på dag 1, 2, 4 og 6 for å måle celleproliferasjon.
DNA ekstraksjon
1 mm vev kjernene ble fjernet fra formalin-fikserte parafininnstøpte human PC-prøver, og DNA ble ekstrahert ved hjelp av Gentra Puregene Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA fra cellelinjer ble hentet ved hjelp av en DNA-ekstraksjon kit (Stratagene, Santa Clara, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Bisulfite behandling
Bisulfite behandling ble utført ved hjelp av de tidligere beskrevne metoder [ ,,,0],26] med mindre modifikasjoner. Oppsummert ble 1 mikrogram DNA denaturert ved behandling med 0,3 M NaOH og modifisert med 3 M natrium-bisulfitt i 6 timer. Modifisert DNA ble renset ved hjelp QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Bisulfitt behandling ble avsluttet ved tilsetning av 5,5 ml 3 M NaOH, utfelt med etanol og resuspendert i 50 ml DNA Hydrering Solution (Gentra Puregene Tissue Kit, Qiagen, Valencia, CA).
Metylering spesifikk PCR (MSP )
DNA metylering mønstre i CpG øya CRBP1 i menneskelige bukspyttkjertelen cellelinjer og humane prøver ble bestemt ved MSP hjelp tidligere publiserte primere [26], [27]. PCR-amplifikasjoner ble utført i 12,5 ul reaksjonsblandinger inneholdende 1 til 5 pl av bisulfitt behandlede DNA, dNTP (hver på 200 pM), primere (0,4 mM hver reaksjon), 1,5 mM MgCl
2, 0,75 enhet av AmpliTaq DNA Gold® polymerase (Applied Biosystems, Victoria, Australia), og 1 x PCR buffer II (Applied Biosystems, Victoria, Australia). MSP ble utført ved anvendelse av følgende betingelser: 95 ° C (30 sek), 58 ° C (30 sek), 72 ° C (30 sekunder) i 40 sykluser. Sykkel betingelser omfattet et innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter og endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter. Alle PCR-produkter ble visualisert under anvendelse av 1,5% agarosegel. Myod primere [28] ble brukt som en kontroll for kvaliteten av det behandlede DNA-bisulfitt. Disse primere inneholder ingen CpG sekvenser
5-AZA og TSA behandling
MiaPaCa2 celler ble behandlet som følger: (1). Behandlet på dag 1 med 300 mm 5-AZA-2’deoxycytidine (5-AZA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og høstet på dag 4; (2) Behandlet på dag 1 med 100 nM Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og høstet på dag 4; (3) Behandlet på dag 1 og 3 med TSA og høstet på dag 4; (4) Behandlet på dag 1 med 5-AZA, Days 2 og 3 med TSA og høstet på dag 4; (5) behandlet på dag 1 med 5-AZA, dagene 2, 3 og 5 med TSA og høstet på dag 6. Ubehandlet MiaPaCa2 og HPDE-celler ble brukt som kontroller. Under behandlingen ble mediet skiftet daglig, og cellene ble vasket to ganger med kald PBS før nukleinsyre og /eller protein utvinning.
Resultater
retinoid signalisering i normal bukspyttkjertelen, bukspyttkjertel skade og regenerering
retinsyre responselement (rARE-LacZ) reporter mus som markerer celler med aktiv retinoid signale [29] viste at i normal pankreas, er aktiv retinoid signale begrenset til de Langerhanske øyer og sjeldne enkelt eller små klaser av eksokrine celler med en acinar eller centro-acinar basert på plassering og morfologi (Figur 1). Gjentatte intraperitoneale injeksjoner av cholecystokinin analoge caerulein [30] induserer kronisk pankreatitt i mus med morfologiske endringer som tap av acinar cellemasse og en økning i bukspyttkjertelen fibrose lik den man ser i den menneskelige tilstand. For å undersøke retinoid signalisering i innstillingen av bukspyttkjertelen skade og gjenfødelse, indusert vi pankreatitt i RARE-lacZ mus. Musene ble behandlet i 10 uker med intraperitoneale injeksjoner av caerulein, ofret ved opphør av behandling, eller lov til å komme for 2, 4 eller 6 uker. Musene avlivet umiddelbart etter den siste injeksjon av caerulein (ved tidspunktet for akutt skade) hadde betydelig mindre pankreata grunn acinar celle atrofi og fibrose med dannelsen av «rørformede komplekser», en manifestasjon av acinar til duktal metaplasia, de tidligste morfologiske endringer forbundet med bukspyttkjertelen kreftutvikling (figur 2A) [31], [32].
RA signale aktivitet i pankreata fra RARE-lacZ mus behandlet med caerulein (E), og påfølgende gjenoppretting for 2 uker (F) , 4 uker (G) og 6 uker (H). Økt retinoid signaleringsaktivitet ble observert i en signifikant andel av akinærceller umiddelbart etter opphør av caerulein behandling (E), med retinoid aktivitet topp på 2 uker (F), avtar etter 4 uker (G) og tilbake til nær normale nivåer etter 6 uker av utvinning (H).
på 2 uker etter opphør av caerulein behandling, hadde eksokrin regenerering startet med en økning i acinar cellemasse, men med rest rørformede komplekser og et vedvarende inflammatorisk infiltrat (figur 2B ). Ved 4 og 6 uker, eksokrin pankreata hadde nær fullt ut, men ikke fullstendig regenerert, med sporadiske acinar enheter fremdeles viser i større målestokk Lumena og en omgivende mild inflammatorisk infiltrat (figurene 2C og 2D). β-galaktosidase farging av pankreata fra caerulein-behandlede RARE-LacZ mus vist økte retinoid signaleringsaktivitet i en stor andel av akinærceller umiddelbart etter opphør av caerulein behandling (figur 2E). Retinoid aktivitet nådde 2 uker og redusert ved 4 uker med nær normale nivåer på 6 uker (Tall 2F, G, H).
retinoid signalisering i bukspyttkjertelkreft
For å finne ut om retinoid signalisering i bukspyttkjertelen ble endret under kreft vi undersøkt retinoid signalisering aktivitet i kjemisk indusert (DMBA) [22] og genmanipulerte mus modeller av kreft i bukspyttkjertelen [33]. DMBA behandlet RARE-lacZ mus utviklet dårlig differensiert, sarcomatoid tumorer (figur 3A) med en tydelig fravær av celler som viste aktiv retinoid signalisering til tross for undersøkelse av flere seksjoner (Figur 3B). Pancreas promoter drevet Cre recombinase (Pdx1-Cre) indusert ekspresjon av aktiverte Kras og mutant p53 innenfor bukspyttkjertelen er for tiden den mest hensiktsmessige genmodifisert murine modell av kreft i bukspyttkjertelen. Disse LSL-Kras
G12D /+ /LSL-Trp53
R172H /+ /Pdx1-Cre mus utvikler bukspyttkjertelen forstadier (Panin) at fremgangen til svært invasiv og metastatisk bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom ved median 5 måneder [33 ]. Disse musene ble krysset med RARE-lacZ reporter mus til å generere LSL-Kras
G12D /+ /LSL-Trp53
R172H /+ /Pdx1-Cre /RARE-lacZ mus. Pankreastumorer, som var overveiende moderat differensiert og inneholdt rikelig desmoplastic stroma dannet i alle mus. Det var en gang et fullstendig fravær av retinoid signalisering aktivitet i disse svulstene og i forstadier til tross for flere seksjonering og vurdering av 2 uavhengige observatører, en av disse var en spesialist i bukspyttkjertelen patolog (figur 3D, E, F).
i tumorer fra behandlede DMBA RARE-lacZ-mus, ble en tydelig fravær av enhver celle som oppviser aktiv retinoid signalisering observert (B). I LSL-KrasG12D /+; LSL-Trp53R172H /+; Pdx1-Cre, RARE-lacZ pankreastumorer og forstadier, det var også et fullstendig fravær av retinoid signalise aktivitet (henholdsvis D og F)
Tap av CRBP1 uttrykk er en vanlig og tidlig hendelse i bukspyttkjertelkreft
Cellular retinoid Binding Protein 1 (CRBP1), er en viktig regulator av retinoid signalisering tenkt å spille en betydelig rolle i bryst kreftutvikling [16], [34]. Foreløpige observasjoner også identifisert nedregulering av CRBP1 transkripsjonsnivåer i PC [35] og Panin [36]. Som en konsekvens av dette undersøkte vi tap av CRBP1 som en mulig årsak til redusert retinoid signalisering i PC, og en rolle i bukspyttkjertelen karsinogenese.
I en kohort av 90 pasienter, immunhistokjemi viste betydelig nedregulering av CRBP1 protein ekspresjon i 70 %, med fullstendig tap av ekspresjon i 50% av disse (35% av den totale, figur 4A, B, C, D). Tap, eller nedregulering av ekspresjon CRBP1 forekom tidlig i PC-utvikling og var til stede i 100% av Panins-1A og 1B lesjoner av pasienter som hadde avvikende ekspresjon innenfor deres kreft (figur 4E, F). Tap av ekspresjon CRBP1 også forekom hos 50% av tidlige forstadier (PanIN1A og 1B) forbundet med kronisk pankreatitt, en kjent risikofaktor for PC. Verken tap, eller nedregulering av uttrykket ble assosiert med pasientens utfall (log-rank
P
= 0,3539, figur S1). I tillegg har 4 av de 6 PC-cellelinjene viste tap eller nedregulering av ekspresjon CRBP1 (figur 5A og B).
(C) CRBP1 metylering status i PC-cellelinjer og (D) gjenopprettelse av CRBP1 uttrykk med kombinasjonsbehandling av MiaPaCa2 celler med 5-Aza og TSA. (E) CRBP1 knockdown i stabilt transfekterte HPDE-ecor celler. (F) HPDE celler dyrket i 3D viser ingen endring i morfologi mellom siCRBP1 celler og egge kontroll.
Tap av CRBP1 uttrykk er assosiert med reversible promoter hypermethylation
Metylering spesifikk PCR (MSP ) og bisulfite genomisk sekvensering (BSG) identifisert CRBP1 promoter hypermethylation i 27,3% av 33 menneske PC prøver mangler CRBP1 uttrykk i motsetning til 5 av 5 matchet normale bukspyttkjertel prøvene som ikke ble metylert. CRBP1 promoter hypermethylation ble påvist i MiaPaCa2 celler (figur 5C), og behandling med demethylating midlet 5-AZA alene, eller i kombinasjon med HDAC-inhibitoren TSA, induserte ekspresjon av CRBP1 mRNA (figur 5D). Evnen til å reversere CRBP1 stanse farmakologisk presenterte potensiell mulighet til å bruke retinoider og HDAC hemmere som kombinasjonsterapier til terapeutisk målrette CRBP1.
nedregulering av CRBP1 uttrykk i cellelinjer og musemodeller
For å vurdere rollen til CRBP1 nedregulering i bukspyttkjertelen karsinogenese, udødeliggjort human bukspyttkjertel ductal Epitelceller som uttrykker mus ecotropiske retrovirale reseptoren (HPDE-EcoRI) ble retroviralt transdusert med to shRNA-konstruksjoner målretting CRBP1 samt en kryptert kontroll. Cellene ble deretter dyrket i 3D-kultur i 20 dager. Western blot viste 50% knockdown av CRBP1 uttrykk (figur 5E), men det var ingen merkbar forskjell i morfologi sammenlignet med kontroller (figur 5F). I tillegg pankreata fra 12 måneder gamle CRBP1 knockout mus [37] (vennlig levert av professor Pierre Chambon) viste ingen tydelige morfologiske forskjellene i forhold til å styre mus (data ikke vist).
CRBP1 overekspresjon i MiaPaCa2 celler
for å undersøke effekten av restaurering av CRBP1 uttrykk, ble MiaPaCa2 celler, som normalt ikke uttrykker CRBP1 stabilt transfektert å generere flere kloner uttrykker ulike nivåer av CRBP1 (lav, middels, høy og svært høy) med ingen effekt på spredning priser i forhold til den tomme vektor kontroll (figur S2A) og ikke endre følsomhet for retinoid behandling ved behandling med All-trans retinsyre (ATRA) (Tall S2B og S2C).
Diskusjoner
den nye rollen feilregulert embryonale signalveier som Notch og Hedgehog [4] er å gi muligheter for utvikling av nye terapeutiske strategier for kreft i bukspyttkjertelen. Retinoid signalering er uunnværlig for normal embryoutvikling, inkludert dannelsen av de begynnende bukspyttkjertel [6], [7], [8]. Våre data viser at signaleringsaktiviteten i normal pankreas er begrenset til pankreatiske øyer og sjeldne celler i den eksokrine pankreas, hvorav mange lignet centro-acinar celler, de antatte stamceller i bukspyttkjertelen. En fersk undersøkelse funnet ut at cellene i bukspyttkjertelen som uttrykker RA-syntese enzymet aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1), er centroacinar celler som utviser stamcelleegenskaper [38]. Denne aktivitetsmønster ligner på ekspresjonen av transkripsjonsfaktoren Pdx1 som også er antatt å markere eksokrin progenitor eller «stamme» celler. Funksjonelle avlesninger av
in vivo
retinoid signalise aktivitet ved hjelp reporter mus i vår studie tyder på at utvidet signale spiller en rolle i bukspyttkjertelen regenerering etter skade. Aktiv signalisering, normalt begrenset til spesifikke celletyper blir utbredt til differensiering av ny eksokrint acini er fullført. Behandling av mus med gjentatte doser av caerulein resulterer i en dramatisk økning i ALDH1-positive celler, som antas å representere økt retinoid signalisering [38], noe som ytterligere støtter våre funn.
deregulert retinoid signalisering har blitt identifisert i mange cancertyper [11], og selv om tidligere studier har identifisert avvikende ekspresjon av komponenter av retinoid signale samt nedstrøms mål i PC [35], [39], [40], [41], [42], [43], lite var kjent om retinoid signalisering aktivitet. Vurdering av retinoid signalisering reporter aktivitet både kjemisk indusert kreft i bukspyttkjertelen, og i genetisk konstruerte modeller i vår studie viste en mangel på retinoid signalisering. Basert på disse observasjonene, hypotese vi at mangel på retinsyre signale kan hindre normal differensiering som svar på kreftfremkallende stimuli og bidra til bukspyttkjertelen kreftutvikling, og at restaurering av retinoid signalisering kan gi en roman terapeutisk alternativ.
Som en konsekvens, undersøkte vi rollen som CRBP1, en viktig del av retinoid signalisering, og tenkte å spille en viktig rolle i bryst kreftutvikling [16], [34]. Vi identifiserte tap, eller nedregulering av ekspresjon CRBP1 (som potensielt kan gi tap av retinoid signalisering aktivitet) i 70% av kreft i bukspyttkjertelen prøver, med en høy andel på grunn av promoteren metylering. Tap eller nedregulering av ekspresjon CRBP1 var til stede i de tidligste forstadier av PC, både i forbindelse med PC og ved kronisk pankreatitt, en risikofaktor for utvikling av PC-en. Men knockdown av CRBP1 uttrykk i udødelig bukspyttkjertelen duktale epitelceller fremkalte ikke transformasjon. Tilsvarende hadde CRBP1 knockout mus ikke demonstrere en bukspyttkjertel fenotype på over 12 måneders alder. I tillegg gjorde gjeninnføring av CRBP1 i PC-celler som mangler CRBP1 ikke endre ufølsomhet overfor retinoid terapi. Viktigere, nyere data tyder på at bukspyttkjertelen stel celler kan spille en nøkkelrolle i retinoid signalisering og motstand mot retinoidbehandling
in vivo product: [44]. Dette må tas i betraktning, særlig når de data som presenteres her fokusert på bukspyttkjertelen epiteliale komponenten.
I sammendraget, induserer bukspyttkjertelen skade retinoid signalise aktivitet i bukspyttkjertelen, som er utbredt i løpet av skade og regenerering og potensielt spiller en viktig rolle i denne prosessen.
