Abstract
Pramanicin (PMC) er en soppdrepende middel som tidligere ble demonstrert til å stille antiangiogenic og kreft egenskaper i noen
in vitro
studier. Vi først screenet en rekke PMC-analoger for deres cytotoksiske effekter på HCT116 humane kolonkreftceller. PMC-A, den analoge med de mest potente antiproliferative virkning ble valgt for ytterligere å avhøre den underliggende virkningsmekanisme. PMC-A førte til apoptose via aktivering av caspase-9 og -3. Den apoptotiske arten av celledød ble bekreftet ved oppheving av celledød med forbehandling med spesifikke kaspaseinhibitorer. Stress-relaterte MAPKs JNK og p38 ble begge aktivert concomittantly med den iboende apoptotiske sti. Videre farmakologisk inhibering av p38 viste seg å dempe celledødsinduksjon mens forbehandling med JNK-inhibitor ikke utvise en beskyttende effekt. Resistance of Bax – /- celler og beskyttende natur caspase-9 hemming indikerer at mitokondriene spiller en sentral rolle i PMC-A indusert apoptose. Tidlig etter eksponering heving av mobilnettet Bim og Bax ble etterfulgt av en marginal BCL-2 uttømming og Bud cleavage. Ytterligere analyse viste at Bcl-2 nedregulering skjer på mRNA-nivået, og er kritisk for å formidle PMC-A indusert apoptose, som ektopisk Bcl-2-ekspresjon i det vesentlige spart cellene fra døden. Omvendt, tvunget ekspresjon av Bim vist seg å øke betydelig celledød. I tillegg analyser av p53 – /- celler viste at Bcl-2 /Bim /Bax modulering og MAPK aktive finne sted uavhengig av p53-ekspresjon. Til sammen p53-uavhengig transkripsjonen BCL-2 downregulation og p38 signal synes å være de viktigste regulerende hendelser i PMC-A indusert apoptose
Citation. Bodur C, Kutuk O, Karsli-Uzunbas G, Isimjan TT, Harrison P, Basaga H (2013) Pramanicin Analog induserer apoptose i Human Colon kreft celler: Kritisk Roller for BCL-2, Bim, og p38 MAPK signalnettverk. PLoS ONE 8 (2): e56369. doi: 10,1371 /journal.pone.0056369
Redaktør: Jose Vina, Universitetet i Valencia, Spania
mottatt: 22 oktober 2012; Godkjent: 08.01.2013; Publisert: 18 februar 2013
Copyright: © 2013 Bodur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midlene for arbeidet ble gitt av Sabanci University fakultet forskningsmidler. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Et mangfold av naturlig forekommende eller syntetiserte molekyler har blitt undersøkt for deres terapeutisk bruk i menneskelig eller veterinærmedisin. Etter å ha lenge vært utnyttet som desinfeksjonsmidler og konserveringsmidler i bransjen, har soppdrepende midler ikke vært unntak fra dette. Pramanicin (PMC) er en fungal gjæring produkt som hører til en klasse av antisoppmidler som er definert ved et høyt functionilized polart hode og en alifatisk sidekjede. Den forrige
in vitro
analyser på kultivert endothelial og leukemiske T-celler bekreftet sin terapeutiske potensial både som en antiangiogen og antikreftmiddel [1], [2].
Langvarig eksponering for
in vitro
effektive doser av PMC ble tidligere vist å redusere cellenes levedyktighet og utløse caspase-avhengig apoptose [2]. PMC-indusert celledød, ble vist å være mediert av aktivering av stressrelatert kinaser p38-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK) mens ekstracellulære regulert kinase (ERK) aktivitet ble rapportert å signifikant reduksjon ved eksponering til agenten. Selv om en forbigående økning intracellulært kalsium ble rapportert å følge PMC eksponering i dyrkede endotelceller pulmonale, ble dette fenomen ikke er synkronisert med enten endotelial dysfunksjon eller celledød [1].
fysisk eller kjemisk miljømessige påkjenninger, inkludert stråling, osmotisk stress , og oksidativt stress eller celleoverflate-reseptor-ligander som for eksempel vekstfaktorer, inflammatoriske cytokiner eller død reseptorligander kan aktivere en kinase kaskade som til slutt stimulerer stress aktiverte MAPK p38 og JNK. Upstream serin /treonin kinaser MAP kinase kinase kinaser (MEKKs) og MAP kinase kinaser (MKKs) er ansvarlig for aktivering av fosforylering og påfølgende atomtranslokasjon av JNK og p38 [3]. Når den er aktivert, blir JNK og p38 er kjent for å være i stand til apoptotisk modulering gjennom aktivering /deaktivering av en serie av transkripsjonsfaktorer.
Apoptose er en tett regulert celledød mekanisme som aktiveres som reaksjon på forskjellige intra- /ekstracellulære stimuli slik som oksidativt stress og elektromagnetisk stråling som skader cellulære makromolekyler eller signaler inklusive inflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer. Apoptotisk utførelse antas av en familie av cystein proteaser kalt caspases som aktiveres i en veldefinert måte [4]. Mens den indre reaksjonsveien er utløst av apoptogenic molekyl frigjøring fra mitokondrier er den ytre vei aktiveres ved ligandbinding til døden reseptorer på celleoverflaten. Hvorvidt den indre eller ytre apoptotisk reaksjonsvei vil være i aksjon er generelt bestemt av arten av stimulus. Uavhengig av veien som ble aktivert i utgangspunktet, både de indre og ytre trasé kan være involvert for å forsterke den apoptotiske signal i ulike situasjoner.
Cytokrom c utgivelse fra mitokondrier som markerer point of no return for iboende apoptotiske aktivitet er intrikat regulert av interaksjoner mellom BCL-2 familien av proteiner. Den delikate balansen mellom anti- og proapoptotiske medlemmer av familien bestemmer apoptotiske lasten inne i cellen. Multidomain proapoptotiske Bcl-2-proteiner og Bax Bak har evnen til homo- /heterooligomerization ved den ytre mitokondriemembranen (OMM) som bevirker permeabiliseringen av OMM og frigjøring av apoptogenic molekyler inkludert cytokrom c inn i cytosol. Mens antiapoptotic BCL-2 proteiner som BCL-2, BCL-XL, A1 og Mcl-en holde proapoptotiske Bax /Bak Sequestered hindre dem fra å innlede OMM permeabilization, proapoptotiske BH3 (BCL-2 homologi 3)-bare proteiner inkludert Bim, bud, Noxa, Bad og Puma kunne arbeide for å nøytralisere antiapoptotic medlemmer av familien [5], [6]. Selv om den eksakte mekanismene moduler BCL-2 proteiner fortsatt uklar i stor grad, er balansen mellom relative celle mengder og aktiviteter i pro- og antiapoptotic BCL-2 proteiner kjent for å være strengt kontrollert på gen- og proteinnivået hos friske pattedyrceller . I denne forbindelse, cellulære nivåer av proapoptotiske BH3-bare Bcl-2-protein i forhold til deres motparter antiapoptotic er kritisk for å sette Bax /Bak fri til å initiere den indre apoptotiske reaksjonsvei.
I tillegg til dets rolle i DNA-reparasjon og cellesyklusregulering, har den kjente tumor suppressor p53 vist å være i stand til direkte å regulere apoptose. Så langt har denne reguleringen er vist å skje via modulering av Bcl-2 familien protein eller død reseptor uttrykk. I tillegg til å transkripsjonelt oppregulering Bax, Bud, Puma, Noxa, Bak og transmembrane reseptorer død som en transkripsjonsfaktor, ble p53 også rapportert å være i stand til direkte å aktivere Bax på proteinnivået [7] – [13]. Nyere bevis indikerer også at p53 i seg selv kan også oppføre seg som et BH3-bare proapoptotiske protein til å antagonisere antiapoptotic BCL-2-proteiner, så vel som å forårsake transrepression av antiapoptotic Bcl-2 gentranskripsjon [14] -. [17]
i denne studien, definerer vi en mekanisme for å oppnå egen apoptotisk reaksjonsvei aktivering utløst av PMC-A, er en potent PMC analog hvor epoksygruppen på sidekjeden av PMC er erstattet av et alken (fig. 1). PMC-A mediert apoptose gjennom p53-uavhengig aktivering av p38 og BCL-2 downregulation i HCT-116 humane tykktarmskreftceller. Samtidig, Bax og Bim ble både akkumulert i celler eksponert for PMC-A med påfølgende bud avkutting.
Materialer og metoder
Cell Kultur og behandlinger
Wild- type (vekt), p53 – /- og Bax – /- HCT116 humane tykktarm kreft celler ble vennlig levert av Bert Vogel (Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University, USA) [18], [19], dyrket i McCoys 5A supplert med 10% FBS HI og 100 IE /ml penicillin /streptomycin. Kulturer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Etanol (maks 0,5%, v /v) ble tilsatt til alle kontrollbrønner /plater i hvert eksperiment. Celler ble samlet opp, kvantifisert i fullstendig medium og utsådd (100.000 celler /ml) i 12-brønners, 6-brønn eller 60 mm dyrkningsskåler, avhengig av forsøket. Pramanicin og analoger ble tilsatt i dyrkningsplatene 36 timer senere. Pre-behandlinger med hemmere ble gjort for 30 minutter før PMC-A behandling.
Reagenser og Analog Synthesis
Generelt.
Proton NMR spektra ble registrert i CDCh
3 eller CD
3OD på et Bruker AC-200 eller AC-600-spektrometer og er angitt på følgende måte: kjemisk skift δ (ppm); antall protoner, multiplisitet, koblingskonstant J (Hz), og tildeling. Rest protiske løsningsmidler CHCI
3 (δ = 7,26 ppm) og CH
3OH (δ = 3,30) ble anvendt som intern referanse.
13C NMR-spektra ble registrert i CDCh
3 eller CD
3OD ved 50 MHz på et Bruker AC-200 og 150 MHz på et Bruker AC-600 spektrometer, ved hjelp av den sentrale resonans av CDCh
3 (δ = 77,16 ppm) som indre referanse. Infrarøde spektra ble registrert på et Perkin-Elmer 983G maskin. Massespektra ble oppnådd på et Micromass Quattro Ultima (LC-ESI /APCI Triple kvadrupol Mass Spectrometer) ved Kjemisk institutt, McMaster University. De følgende ioniseringsteknikker ble anvendt: elektron ionisering (EI), og elektrospray (ES). Smeltepunktene ble bestemt på et Reichert hot scene apparat. Optiske rotasjoner ble tatt opp på et Perkin-Elmer (241 MC Polarimeter, λ = 589, Na-lampe).
Pramanicin (PMC) og pramanicin A (PMC-A) ble fremstilt som tidligere beskrevet [20]. Flash-kolonnekromatografi ble utført på silikagel (silikagel 60). Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført på forbelagte silikaplater (ALUGRAM SIL G /UV
254) og visualisert ved UV, vanillin eller ceriumammoniumnitrat løsning. Vandige løsninger ble mettet med mindre annet er angitt. Forholdet mellom løsningsmidler i blandinger henviser til de volumer som benyttes. Alle reaksjoner ble utført under en nitrogen- eller argonatmosfære i ovnstørket glassgjenstander, som ble avkjølt under en kontinuerlig nitrogenstrøm umiddelbart før bruk, med mindre annet er angitt. THF ble destillert fra natriumbenzofenon-ketyl, CH
2 Cl
2 og toluen fra kalsiumhydrid, og EtOAc fra kaliumkarbonat. Andre løsemidler og reagenser ble brukt som leveres.
3-tetradekanoyl-en-vinylpyrrolidin-2-on (2).
Fersk destillert
N
-vinylpyrrolidin-2- en (1) (0,96 ml, 9 mmol) ble tilsatt til NaH (1,44 g, 36 mmol) i tilbakeløpskokende THF (15 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 90 ° C, og deretter etyl myristat (4,3 ml, 10,3 mmol) ble tilsatt. Etter 3 timer ble oppløsningen oppvarmet til romtemperatur, reaksjonen ble stanset med mettet, vandig NH
4Cl, og ekstrahert med eter. Ekstraktene ble tørket (Na
2SO
4), filtrert og konsentrert. Det resulterende faste stoff ble oppløst i CH
2 Cl
2, filtrert og konsentrert og renset ved kromatografi (CH
2 Cl
2 /EtOAc, 01:01) for å gi 2 i form av hvite krystaller (3,54 g , 82%): smp 39-40 ° C; IR (film) 2920, 2851 (C-H, str.), 1685, 1637 (C = O, str.), 1459 (C = C, bend.), 1391, 861 cm
1;
1 H NMR (CDCh
3, 200 MHz) δ 7,01 (1H, dd,
3J = 9,0,
3J = 16,0, NCH = CH
2), 4,46 (2H, m , NCH = CH
2), 3,68 (1H, dd,
3J = 9,0,
3J = 6,0, COCHCO), 3,54 (1H, ddd,
2J = 9,0,
3J = 8,5,
3J = 5,5, CH
2 N), 3,47 (1H, ddd,
2J = 9,0,
3J = 8,5,
3J = 5,7, CH
2 N) , 3,01 (1H, m, CH
2CH
2CO), 2,68 (1H, m, CH
2CH
2CO), 2,67 (1H, dddd,
2J = 13,8,
3J = 5,7,
3J = 8,5,
3J = 6,0, CH
2 CH
2 N), 2,12 (1H, dddd,
2J = 13,6,
3J = 8,5,
3J = 9,0,
3J = 5,5, CH
2CH
2 N), 1,57 (2H, m, CH
2CH
2CO), 1,24 (20H, m, C
10 H
20), 0,87 (3H, t,
2J = 6,7, CH
3CH
2);
13C NMR (CDCh
3, 50 MHz); δ 204,2 (CH
2CO), 169,9 (CON), 130,0 (NCH = CH
2), 94,5 (NCH = CH
2), 57,3 (COCHCO), 44,0 (CH
2 N) 43,5 (CH
2 CH
2CO), 32.7, 30.4, 30.2, 29.8, 24.1, 23.5 (C
10H
20), 20,1 (CH
2 CH
2 CH
2), 14,9 (CH
3); MS (EI
+) m /z = 321 (M
⋅ +), HRMS (EI) beregnet for C
20 H
35NO
2 (M
⋅ +) 321,2668 , funnet 321,2679.
3-Tetradecanoylpyrrolidin-2-on (3).
forbindelse 2 (520 mg, 1,6 mmol) ble oppvarmet ved 90 ° C i en blanding av 95% C
2 H
5OH (35 ml) og konsentrert HCl (0,5 ml). Reaksjonen ble overvåket ved TLC. Løsningen ble avkjølt til værelsestemperatur, tørket (Na
2SO
4), filtrert og konsentrert. Det resulterende faste stoffet ble renset ved kromatografi (CH
2 Cl
2 /EtOAc, 01:01) for å gi 3 i form av hvite krystaller (241 mg, 50,4%): smp 73-74 ° C; IR (film) 3226 (N-H str.), 2920, 2851 (C-H, str.), 1716, 1671 (C = O, str.), 1468, 1375, 1278 cm
1;
1 H NMR (CDCh
3, 600 MHz) δ 5,73 (1H, brs, NH), 3,50 (1H, dd,
3J = 9,0,
3J = 6,0 COCHCO), 3,44 (1 H , ddd,
2J = 9,0,
3J = 8,5,
3J = 5,5, CH
2 N), 3,34 (1H, ddd,
2J = 9,0,
3J = 9,0
3J = 5,4, CH
2 N), 2,95 (1H, ddd,
2J = 17,4,
3J = 7,4,
3J = 7.5 CH
2 CH
2CO ), 2,57 (1H, ddd,
2J = 17,4,
3J = 7,2,
3J = 7,2 CH
2CH
2CO), 2,65 (1H, dddd,
2J = 11,0,
3J = 5.4,
3J = 9,0,
3J = 9,0, CH
2 CH
2 N), 2,17 (1H, dddd,
2J = 11,0,
3J = 8,5,
3J = 9,0,
3J = 5,5, CH
2CH
2 N), 1,59 (2H, m, CH
2CH
2CO), 1,23 (22H, m, C
11 H
22), 0,88 (3H, t,
3J = 6,8, CH
3CH
2);
13C NMR (CDCh
3, 150 MHz) δ 205,9 (CH
2CO), 171,6 (CONH), 53,9 (COCHCO), 42,9 (CH
2CO), 40,6 (CH
2N), 32,1 (CH
3 lm
2 CH
2), 29.8~29.2, 23,5 (CH
2 CH
2 CH
2CO), 22,9 (CH
2 CH
2CH
2 NH), 14,9 (CH
3); MS (EI
+) m /z = 295 (M
⋅ +), HRMS (EI) beregnet for C
18 H
33NO
2 (M
⋅ +) 295,2511 , funnet 295,2554.
(2R, 5S) -2- (p-fluorfenyl) -3-oksa-1-azabicyklo [3.3.0] oktan-8-on (4).
En oppløsning av 5-hydroksymetylpyrrolidin-2-on (580 mg, 5 mmol) og
p
-fluorobenzaldehyde (810 mg, 6,5 mmol) i toluen (20 ml) inneholdende PPTS (30 mg) ble oppvarmet ved refluks i 13 timer ved bruk av en Dean-Stark-vannseparator. Etter avkjøling ble løsningen fortynnet med EtOAc, vasket med mettet NaHCOs
3, vandig løsning, deretter saltløsning, tørket (MgSO
4) og inndampet under redusert trykk for å gi en brun olje. Kromatografisk separasjon på silikagel ved eluering med CHCh
3 ga 4 som en blek gul olje (586 mg, 53%): IR (film) 2920, 2851 (CH, str.), 1701 (C = O, str. ), 1559, 1507, 1437 (aromatisk C = C bend) 1301, 1099, 821, 668 cm
1.;
1 H NMR (CDCh
3, 200 MHz) δ 7,34 (2H, dd,
3J = 8,0,
4J = 5,5, H-Ph), 6,95 (2H, dd,
3J = 8,6,
4J
HF = 8,6, H-Ph), 6,20 (1H, s, OCHPh), 4,15 (1H, dd,
2J = 7,4,
3J = 6,4, CH
2o), 4,04 (1H, m, NCHCH
2o), 3,40 (1H, t,
2J = 7,4,
3J = 7,6, CH
2o), 2,74 (1H,
2J = 17,4
3J = 9.6,
3J = 9,4, CH
2CO), 2,47 (1H, ddd,
2J = 17,4,
3J = 3,7,
3J = 9,8, CH
2CO), 2,31 (1H, dddd,
2J = 20,2,
3J = 3,7,
3J = 7,6,
3J = 7,0, CH
2CH
2CHN), 1,87 (1H, dddd,
2J = 20,2,
3J = 4,7,
3J = 9.4,
3J = 9,8, CH
2 CH
2CHN) ;
13C NMR (CDCh
3, 50 MHz) δ 178,2 (CON), 163,5 (1C, d,
1J
CF = 244,4, CF), 129,5 (2C, d,
3J
CF = 8,2, CHCHCF), 115,4 (2C, d,
2J
CF = 21,5, CHCF), 86,7 (OCHPh), 71,8 (CH
2o), 58,9 (NCH), 33.6 (COCH’er
2), 23,1 (COCH
2 CH
2).
(2R, 5S) -2- (p-fluorfenyl) -7-tetradekanoyl-3-oksa- 1-azabicyklo [3.3.0] oktan-8-on (5).
til en oppløsning av beskyttet laktam 4 (222 mg, 1 mmol) og HMPA (5 ml) i THF (15 ml), LiN (TMS)
2 (1,0 M, 1,3 ml, 1,3 mmol) i THF ble tilsatt ved -78 ° C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 minutter, og deretter etyl myristat (0,4 ml, 1,2 mmol) ble tilsatt. Oppløsningen ble langsomt oppvarmet til romtemperatur. Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen stoppet med mettet NH
4Cl vandig løsning, ekstrahert med eter, og ekstraktet ble tørket (Na
2SO
4) og konsentrert. Det resulterende produkt ble renset ved kromatografi (heksaner /EtOAc, 02:01) for å gi 5 som hvite krystaller (233 mg, 53%) som ble dannet som en blanding av to diastereomerer: smp 60-62 ° C; IR (film) 2918, 2851 (CH, str.), 1716, 1681 (C = O, str.), 1559, 1512 (aromatisk C = C bend.), 1401, 1240, 1035, 802 cm
– 1; MS (EI
+) m /z = 431 (M
⋅ +), HRMS (EI) beregnet for C
26H
38NFO
3 (M
⋅ +) 43,2913 , funnet 431,2914.
(5R) -5- (hydroksymetyl) -3-tetradecanoylpyrrolidin-2-on (6).
En oppløsning av beskyttet laktam 5 (50 mg, 0,15 mmol) i 5 ml AcOH /THF /H
2O (03:07: 1) ble oppvarmet ved 90 ° C i 3 timer. Benzen (30 ml) ble tilsatt til blandingen, og inndampet under redusert trykk. Flash-kromatografi ble utført (EtOAc /CH
3OH, 10:01) for å gi 6 som hvite krystaller (22 mg, 60%) av en blanding av diastereomerer: smp 73-76 ° C; IR (film) 3385 (NH str.), 3307 (OH, str.), 2920 (C-H, str.), 1699, 1653 (C = O, str.), 1457, 1119 cm
1; MS (EI
+) m /z = 325 (M
⋅ +), HRMS (EI) beregnet for C
19H
35NO
3 (M
⋅ +) 325,2617 , funnet 325,2599.
(2S, 5S, 7R) -7-hydroksy- (4-fluorfenyl) -3-oksa-1-azabicyklo [3.3.0] oktan-8-on (7).
forbindelse 6 (200 mg, 0,46 mmol) ble tilsatt til en suspensjon av CeCl
3.7H
2O (5,6 mg, 0,015 mmol) i 2 ml
i
PrOH. Suspensjonen ble blandet ved å boble luft gjennom det i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert. Flash-kromatografi ble utført (CH
2 Cl
2 /EtOAc, 01:01) for å gi 7 som en fargeløs olje (120 mg, 57%): (. OH, str) IR (film) 3384, 1715, 1698 (C = O, str.), 1511, 1230, 1156 cm
1; [Α]
D
23 = -0,05
0 (c = 0,8 g /100 ml; CH
3OH);
1 H NMR (DMSO-d
6, 600 MHz) δ 7,41 (2H, dd,
3J = 8,9,
4J = 5,5, H-Ph), 7,23 (2H, dd,
3J = 8,9,
4J
HF = 8,9, H-Ph), 6,62 (1H, s, OH), 6,11 (1H, s, H-Ph), 4,28 (1H, dd,
2J = 8.1,
3J = 8,4, CH
2o), 4,01 (1H, dddd,
3J = 6,8,
3J = 7,0,
3J = 8,4 og
3J = 6,0, NCHCH
2), 3,51 (1H, t,
2J = 8,4,
3J = 8,1, CH
2o), 2,75 (1H, dd,
2J = 13,0,
3J = 6,8, CH
2CHN), 2,69 (2 H, dd,
2J = 18,5,
3J = 7,2, CH
2 CH
2CO), 1,90 (1H, dd
2J = 13,0,
3J = 7,0, CH
2CHN);
13C NMR (DMSO-d
6, 150 MHz) δ 209,3 (CH
2CO), 172,3 (CON), 162,2 (
1J
CF = 244,4, C-Ph), 134,7 (C-Ph), 128,3 (2C,
3J
CF = 8,4, C-Ph), 115,2 (2C,
2J
CF = 21,7, C-Ph), 87,7 (C- OH), 85,6 (CH-Ph), 72,2 (CH
2o), 54,6 (CH
2CHN), 37,2 (CH
2CHN), 36,2 (CH
2 CH
2CO) , 22,6 (CH
2 CH
2CO), 22.05~31.25, 13,9 (CH
3 lm
2); MS (EI
+) m /z = 447 (M
⋅ +), HRMS (EI) beregnet for C
26H
42FN
2o
4 [(M
⋅ + NH
4)
+] 465,3129 funnet 465,3126.
(3S, 5R) -3-hydroksy-5- (hydroksymetyl) -3-tetradekanoyl pyrrolidin-2-on (8 )
En oppløsning av forbindelse 7 (60 mg, 0,13 mmol) i 5 ml AcOH /THF /H
2O (03:07:. 1) ble oppvarmet ved 90 ° C i 3 timer. C
6 H
6 (30 ml) ble tilsatt til blandingen, og inndampet under redusert trykk. Flash-kromatografi ble utført (EtOAc /CH
3OH, 10:01) for å gi 8 som hvite krystaller (22 mg, 48%): smp 74-76 ° C; IR (film) 3300 (NH, str.), 3226 (OH, str.), 2995, 2849 (C-H, str.), 1688, 1650 cm
-1 (C = O, str.); [Α]
D
23 = -4,25 ° (c = 0,04 g /100 ml; CH
3OH); 1H NMR (CD
3OD, 600 MHz) S 3,81 (1H, dddd,
3J = 4,9,
3J = 5.4,
3J = 6.3,
3J = 7,9, CH
2CHN), 3,62 (1H, dd,
2J = 11,1,
3J = 4,9, CH
2o), 3,53 (1H, dd,
2J = 11,1,
3J = 6,3 , CH
2o), 2,74 (2H, m, CH
2 CH
2CO), 2,38 (1H, dd,
2J = 14,1,
3J = 5,4, CH
2CHN ), 2,10 (1H, dd,
2J = 14,1,
3J = 7,9, CH
2CHN), 1,56 (2H, m, CH
2CH
2CO), 1,31 (3H, t,
3J = 7,0, CH
3 lm
2);
13C NMR (CD
3OD, 150 MHz) δ 212,2 (CO), 176,7 (CON), 84,5 (COH), 65,5 (CH
= 2-OH), 54,3 (CHN), 38,7 (CH
2CO), 33.1~30.8, 24,3 (CH
2 CH
2CO), 14,4 (CH
3 lm
2); MS (EI
+) m /z = 341 (M
⋅ +), HRMS (EI) beregnet for C
19H
35NO
4 (M
⋅ +) 341,2617 funnet 341,2599.
PMC og analoger ble oppløst i etanol. McCoys 5A, FBS og antibiotika var fra Pan Biotech GmbH (Aidenbach, Tyskland). Fosfatase inhibitor cocktail (PhosStop) og proteasehemmer cocktail ble hentet fra Roche (F. Hoffman-La Roche Ltd, Basel, Sveits). Annexin V (FITC) var fra Alexis Biochemicals (Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, USA). Kløyvet caspase-3, kløyvde caspase-9, JNK, P-JNK, p38, P-p38, Bcl-2, Bax, Bud, Bim og β-aktin antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA ). MAPK hemmere SP600125 og SB203580 var fra Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Kaspaseinhibitorer Z-VAD-FMK (generell caspase-hemmer), Z-DEVD-FMK (caspase-3-hemmer), Z-LEHD-FMK (caspase-9-hemmer), og Z-IETD-FMK (caspase-8-hemmer) var kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Tris, glycin og Tween-20 var fra Molekula Ltd (Shaftesbury, UK). Alle andre kjemikalier ble oppnådd fra Sigma (Darmstadt, Tyskland).
MTT celleviabilitet Asssay
Cellenes levedyktighet ved eksponering til PMC-analoger ble bestemt ved anvendelse av en MTT (dimetyl tiazolyl difenyl-tetrazolium) assay kit ( Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble HCT116 WT-celler i 96-brønners plater ble behandlet som angitt, og 10 ul av MTT merking reagens ble tilsatt til hver brønn, hvoretter platene ble inkubert i 4 timer. Cellene ble deretter inkubert i 100 ul av den Oppløsningsløsningen i 12 timer, og absorbansen ble målt med en mikrotiterplateleser (Bio-Rad, CA, USA) ved en testbølgelengde på 550 nm og en referansebølgelengde på 650 nm. Prosent levedyktighet ble beregnet som (OD narkotika behandlede prøve /kontroll OD) × 100.
flowcytometrisystemer
Celledød ble bestemt av en Annexin-V affinitet analysen. Wt, p53 – /-, og Bax – /- ble HCT116-celler utsådd i 12-brønners plater transfektert /behandlet som angitt, overføres til flowcytometri rør og cellene ble høstet ved sentrifugering ved 300 g i 5 minutter. Deretter ble cellene resuspendert i 1 ml kald PBS og sentrifugert igjen ved 300 g i 5 minutter. Etter fjerning av supernatanten ble cellene inkubert i Annexin V-buffer (140 mM HEPES, 10 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2, pH: 7,4) inneholdende 1% (v /v) Annexin V (FITC) for 15 minutter i mørket. Celler ble analysert ved hjelp av FACS (FACSCanto, Becton Dickinson).
Protein Extraction og Immunoblotting
celler ble behandlet som angitt, og høstet ved sentrifugering ved 300 g i 30 sekunder. Etter resuspensjon i 1 ml iskald PBS og overføres til 1,5 ml mikrofugerør, ble cellene sentrifugert ved 13200 rpm i 30 sekunder. Pelleten ble lysert ved inkubering i 30 minutter i 200 pl kald cellelyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH: 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid, protease og fosfatase-inhibitor cocktail, og Nonidet P-40 1 % (v /v). Etter sentrifugering ved 13 200 rpm i 10 minutter, supernatanten inneholdende det totale proteinekstrakt ble fjernet og lagret ved -80 ° C. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved DC-proteinanalyse (Bio-Rad, Munchen, Tyskland). Proteiner (30 ug) ble blandet med ladningsbuffer (4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,004% bromfenolblått, 0,125 M Tris-HCl, pH: 6,8) og separert på 10-15% SDS- PAGE og blottet på PVDF membraner. Membranene ble blokkert med 5% blokkering reagens (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland) i PBS-Tween 20 og inkubert med egnede råstoffer og HRP-konjugerte sekundære antistoffer (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland) i 5% blokkering reagens . Etter nødvendige vasker med PBS-Tween 20, ble proteiner endelig analysert ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland) og utsatt for Hyper-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland).
transfections
HCT116 wT celler ble transfektert med BCL-2 og Bim ekspresjonsplasmider (Addgene Inc., Cambridge, MA, USA) ved hjelp Fugene 6 transfeksjon reagens (Roche, F. Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Sveits) i henhold til produsentens protokoll. Totalt protein ekstraksjon ble utført etter 24 timer etter fullføringen av transfeksjon fremgangsmåte for bekreftelse av ektopisk ekspresjon. Plasmid-transfekterte celler ble behandlet med PMC-A som indikert og analysert ved flow-cytometri etter 24 timer.
Statistical Analysis
Alle de viste resultatene representerer en av minst tre uavhengige forsøk med lignende resultater . Alle numeriske dataene er presentert som som betyr ± SD. Statistisk signifikant responsive forskjeller mellom forskjellig behandlet eller forskjellig transfekterte cellepopulasjoner ble vurdert med uparede eller paret t-test, henholdsvis. Verdier for P 0,05 og P 0,01 er merket som * eller ** henholdsvis
Resultater
PMC-A beviser Mer cytotoksiske Sammenlignet med sin forløper PMC og flere analoger mot HCT116 Cells
PMC ble tidligere vist å selektivt skade vaskulære endotelceller i
in vitro
funksjonelle studier på rotte aorta og hunde arterier [1], [21], [22]. PMC og analoger ble også demonstrert å forårsake celledød i dyrkede bovine vaskulær endotelial og Jurkat T-leukemiceller [1], [2]. I vår studie vi først undersøkt tidligere rapporterte naturprodukter PMC og PMC-A [20], og deretter syntetisert flere analoger å utforske struktur-funksjon relasjoner (Fig. 1). Således ble PMC-C fremstilles fra kommersielt
N
-vinylpyrrolidinone (1) ved dannelse av enolatet, deretter acylering med etyl myristat for å gi 2. vinyl beskyttende gruppe ble deretter fjernet med vandig syre, noe som gir PMC- C (3) som en racemisk blanding ved lett epimeriseres stereocentre (fig. 2).
For analoger PMC-D og -F, kommersielle (
R
) -5- hydroksymetylpyrrolidin-2-on ble omdannet til den beskyttede derivat 4, ved hjelp av en litteraturprosedyre [23], og deretter deprotoneres og acylert med etyl myristat, noe som gir 5. Avbeskyttelse deretter ga PMC-D (6). Alternativt hydroksylering av 5 med oksygen og cerium klorid som katalysator i henhold til fremgangsmåten i Christoffers [24] ga 7 som deretter ble avbeskyttet, hvilket ga PMC-F (8). Bruk av
p
fluorfenyl beskyttende gruppe hensiktsmessig ført i det vesentlige fullstendig stereoselektiv hydroksylering, mens andre substituenter på benzenringen ga blandinger. Stereokjemien på 8 ble etablert ved røntgen-krystallografi, noe som viste at hydroksygruppen var
trans
til hydroksymetylsubstituent, i motsetning til
cis
forhold i pramanicin. Det var derfor av interesse å fastslå hvorvidt denne hydroksygruppe og dens stereokjemi er viktige for aktivitet, og således vi inkludert denne forbindelsen i testpanelet.
Vi utførte deretter en 24 timers cytotoksisitet assay for å søke etter den mest potente analog mot HCT116-celler. MTT-reduksjonstesten som indirekte bestemmer celleviabilitet /sprednings ved å overvåke metabolsk aktivitet, viste at 100 uM PMC forårsakes ca 8% reduksjon i celleviabilitet (fig. 3). Imidlertid PMC-A som besitter en C = C-dobbeltbinding i stedet for en epoksy-gruppe i sin sidekjede, redusert cellelevedyktighet med nesten 70% sammenlignet med den ubehandlede kontroll. Spesielt, analoger PMC-C, -E og -F alt tilbakeholdt signifikant aktivitet, noe som indikerer at en acylert pyrrolidinon (som i PMC-C), på det meste, er nøkkelen pharmacophore, og at mange av substituentene (epoksid, dien, C- 5 hydroksymetyl-gruppe, og C-3 og C-4 alkoholgrupper) er ikke-essensielle, men forsterke aktiviteten.
viabilities av HCT116-celler ble analysert ved MTT-assay etter 24 timers behandling med 100 pM av hver PMC analoge . Villtype HCT116-celler ble analysert kolorimetrisk etter 24 timers behandling med PMC-analoger. Midlere absorpsjon verdier i forhold til ubehandlet kontroll vises etter multiplikasjon med 100. Resultatene fra minst 3 uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. Forskjell fra gjennomsnittsverdier mellom behandlede og ubehandlede prøver ble testet ved anvendelse av uparede Students t-test; ** P 0,01. Kontrollceller ble behandlet med oppløsningsmiddel bare. Alle testede analoger unntatt forløper PMC ført til betydelig tap av levedyktighet /spredning mens PMC-A og -F viste seg mest cytotoksiske til cellene.
PMC-A induserer celledød gjennom Induksjon av egen apoptotic Pathway
in vitro
effektive doser av den potente PMC PMC analog-A (25-100 uM) forårsaket celledød på en doseavhengig måte hos alle tre HCT116 tykktarmskreftcellelinjer (wt, p53 – /-, og Bax – /-) som indikert ved økt Annexin V-affiniteter i cellepopulasjon (figur 4A).. For å analysere celledød og bestemme den optimale dose for bruk i en 24-timers tidsskala, søkte vi flowcytometri følgende Annexin V-farging av celler eksponert til fire fysiologisk relevante PMC-A-konsentrasjoner. Celledød induksjon var tydelig for alle doser i alle cellelinjer og økt doseavhengig. Gitt at mer enn 50% av wt-celler var døde etter 24 timers eksponering til 100 uM PMC-A, gjennomførte vi resten av immunoblottingforsøk eksperimentene ved anvendelse av 50 uM dose hvor ca. 70% av cellene var i live etter 24 timer post-
