Abstract
Bakgrunn
Identifisering av ytterligere prognostiske markører for å forbedre risiko lagdeling og for å unngå overbehandling er en av de mest akutte kliniske behov i prostata cancer (PCA). MicroRNAs, er viktige regulatorer av genuttrykk, er lovende biomarkører i ulike kreft enheter, selv om virkningen som prognostiske prediktorer ved PCA er dårlig forstått. Målet med denne studien var å identifisere spesifikke mirnas som potensielle prognostiske markører i høy-risiko PCa og å validere deres kliniske effekten.
Metodikk og hovedfunnene
Vi utførte miRNA-microarray analyse i et høyrisiko PCa studiegruppen valgt ut av deres kliniske utfall (klinisk progresjonsfri overlevelse (CPFS) vs. klinisk svikt (CF)). Vi identifiserte sju kandidat mirnas (
la-7a /b /c, MIR-515-3p /5p, -181b, -146b
, og
-361
) som viste differensial uttrykk mellom begge grupper. Videre QRT-PCR-analyse viste nedregulering av medlemmer av
la-7
familie i de fleste et stort, godt preget av høy risiko PCa kohort (n = 98). Uttrykk for
la-7a Twitter /
b Twitter /og
-c
ble korrelert til kliniske resultatparametre i denne gruppen. Mens
la-7a
viste ingen sammenheng eller korrelasjon med klinisk relevante data,
la-7b Hotell og
la-7c
var assosiert med CF i PCA pasienter og fungerte delvis som uavhengig prognostisk markør. Validering av data ved hjelp av en uavhengig høyrisiko studiekohorten avdekket at
la-7b, etter men ikke
la-7c, har
innvirkning som selvstendig prognostisk markør for BCR og CF. Videre har vi identifisert
HMGA1
, et ikke-histone protein, som et nytt mål av
la-7b Hotell og funnet korrelasjon av
la-7b
nedregulering med HMGA1 over-uttrykk i grunnskolen PCA prøver.
Konklusjon
Våre funn definere en tydelig miRNA uttrykk profil i PCA tilfeller med tidlig CF og identifisert
la-7b
som prognostisk biomarkør i høy risiko PCa. Denne studien understreker betydningen av
la-7b
som tumor suppressor miRNA i høyrisiko PCa og presenterer et grunnlag for å forbedre individuell terapi for høyrisiko PCA pasienter
Citation. Schubert M, Spahn M, Kneitz S, Scholz CJ, Joniau S, Stroebel P, et al. (2013) Tydelig mikroRNA Expression profil i prostatakreftpasienter med tidlige kliniske Failure og virkningen av
la-7
prognostiske Marker i High-Risk prostatakreft. PLoS ONE 8 (6): e65064. doi: 10,1371 /journal.pone.0065064
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 17. desember 2012; Godkjent: 20 april 2013; Publisert: 14 juni 2013
Copyright: © 2013 Schubert et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne publikasjonen ble finansiert av den tyske Research Foundation (DFG) og Universitetet i Wuerzburg i finansieringsprogram Open Access Publishing, en Ferdinand Eisenberger tildelingen av Deutsche Gesellschaft für Urologie (tysk Society of Urology), gi ID ScM1 /FE-11; og IZKF (Tverrfaglig Senter for klinisk forskning), Universitetet i Würzburg, gi ID Z-3/14. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen blant menn i Europa, med en estimert forekomst av 345 900 i 2006 [1]. Det naturlige forløpet av sykdommen er heterogen, varierende fra lat til svært aggressiv kreft som metastasizes på et tidlig stadium forårsaker smerte og tidlig død. Aktuelle risikolagdelinger som lav- /mellomliggende gruppe /og høy-risiko PCa alene er ikke tilstrekkelig til å forutsi klinisk utfall. Selv menn med høy risiko PCa (PSA 20 ng /ml og /eller biopsi Gleason score ≥8 og /eller klinisk stadium ≥ T3) representerer en heterogen gruppe pasienter. Selv om karakterisert som en gruppe som har dårligst klinisk resultat hos alle risikogrupper, bare opp til 30% utvikler metastaser og dø på grunn av deres sykdom [2] – [4]. Derfor er nye prognostiske biomarkører sterkt behov for å bedre sub-stratify risikogruppene, identifisere den dødelige sykdommen, til slutt unngå overbehandling, og bedre individuell terapi. Identifiseringen av prognostiske markører, spesielt for den dødelige sykdom, er neppe mulig i en uselektert PCa kollektive. Selv om høyrisiko PCA kullene nå vise mye bedre enn forventede resultater, har de fortsatt representere en ideell gruppe å identifisere faktorer spesielt korrelert med den dødelige sykdommen.
Det er økende bevis for at microRNAs (miRNA) er egnede kandidater til utvikling av slike biomarkører. Mirnas er små ikke-kodende RNA tråder som regulerer ekspresjon av gener på det post-transkripsjonelle og det translasjonelle nivå. Individuelle Mirs har blitt karakterisert enten som tumor suppressors eller onkogener (oncomiRs) [5].
Flere rapporter beskriver PCA- spesifikke miRNA uttrykk signaturer, men hva slags regulerte miRNAs er mangfoldig. foreligger enighet blant disse studiene i at flertallet av miRNAs er nedregulert i PCA prøvene [6] – [10]. Selv om en korrelasjon til tumorstadium og karakteren ble beskrevet i flere Mirs deres relevans prognostiske markører for å forutsi vanskelig kliniske endepunkter, som klinisk svikt eller kreft-relaterte dødsfall, fortsatt begrenset [8], [11] – [14]. Det er imidlertid lovende tilnærminger for å påvise sammenheng mellom endret uttrykket av spesifikke miRNAs og progresjon av sykdommen. Larne og kolleger nylig identifisert en miRNA-basert multimarker modell som prognostisk verktøy for progresjon ved PCA [15]. Vår arbeidsgruppe tidligere beskrevet
MIR-221
å være en prognostisk markør for tilbakefall av sykdommen i høyrisiko PCa [16].
Noen av de hyppigst nevnte Mirs som viser nedregulering i PCa er medlemmer av
la-7
familie [6], [9], [17], [18]. Denne familien består av flere medlemmer, hvis mangfold er tydelig ved isoformene (
brev
7
a-g, -i, MIR-98
). Ekspresjonen av noen
la-7
medlemmer ble vist å være nedregulert i forskjellige andre kreft enheter i tillegg, som for eksempel brystkreft, eggstokk, og lungekreft [19] – [21]. Kjente relevante mål for
la-7
er onkogener som
Ras
,
cmyc
,
EZH2 Hotell og
HMGA2 product: [17] , [22] – [24], noe som indikerer en tumor-undertrykkende funksjon av
la-7
ved å regulere onkogener er spesielt involvert i vekst og selvfornyende kapasitet på PCA-celler. Mer nylig ble det vist at PCA stamceller er preget av nedregulering av
la-7
familiemedlemmer og at
la-7
er kritisk involvert i tumorigenicity ved å kontrollere androgen reseptor signalisering, spredning og differensiering [25] – [27]. Men en rolle
la-7
familiemedlemmer som prognostiske markører i PCA har ikke blitt beskrevet til nå.
Formålet med denne studien var å identifisere mirnas forskjellig uttrykt i høy-risiko PCA med varierte kliniske utfall. Vi oppdaget et mønster som består av 7 mirnas forbundet med tidlig klinisk tilbakefall og identifisert
la-7
familiemedlemmer til å bli gradvis nedregulert i aggressive svulster. I en stor høy risiko PCa kohort vi bekreftet disse resultatene, og vist at nedregulering av
brev
7
b
er korrelert med biokjemiske gjentakelse og klinisk svikt. Videre har vi bekreftet
la-7b
som uavhengig prognostisk markør i høyrisiko kreft i en uavhengig validering kohort. I tillegg viste vi at uttrykket av
HMGA1
, et ikke-histone protein, er regulert av
la-7b
av binding til 5’UTR av
HMGA1
. Våre resultater viser at høy risiko PCa er preget av en bestemt miRNA profil og at den enkelte
la-7
familiemedlemmer er lovende prognostiske markører i denne pasientgruppen.
Materialer og Metoder
Pasient Kohorter
Vi har jobbet med tre ulike PCA kollektiver for våre analyser:
Cohort A består av 98 formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) vevsprøve av et godt karakterisert gruppe høyrisiko PCA pasienter [16]. Se tabell 1 for klinikken-patologiske data. Vevsprøver og kliniske data ble brukt for microarray og QRT-PCR-analyser på microRNAs samt påfølgende korrelasjon og assosiasjonsstudier.
Cohort B består av 92 FFPE-prøver fra RP. Vevsprøve og klinikk-patologiske data ble innhentet fra Institutt for Urologi ved Universitetssykehuset Leuven, Belgia (tabell 1). Denne gruppen fungerte som validering kollektiv for å bekrefte rollen som
la-7b
som prognostisk markør.
Preoperativ staging i kohort A og B inkludert DRE, en abdominopelvic-computertomografi (CT) skanne og et bein scan. Neoadjuvant hormonell behandling, stråling eller kjemoterapi var et eksklusjonskriterium. Lymfeknutemetastase og prostata prøver (hele mount seksjoner, 4 mm avstand) ble iscenesatt og gradert etter 2002 TNM klassifisering og Gleason gradering systemet som tidligere beskrevet [16]. Oppfølging ble utført hver 3. måned for de første 2 år etter operasjonen, hver 6. måned i følgende 3 år, og deretter årlig. Biokjemisk tilbakefall (BCR) ble definert som PSA ≥0.2 ng /ml på 2 påfølgende oppfølgingsbesøk. Klinisk svikt ble erklært da enten lokale eller fjernmetastaser ble histologisk påvist eller bekreftet av CT eller bein scan. Total overlevelse (OS) ble definert som tiden fra RP til døden skyldes PCa eller komplikasjoner av sykdommen.
Benign prostatic hyperplasia (BPH) prøver ble avledet fra prostata adenomectomy prøver. Prøvene ble parafin-embedded i tillegg; regioner med 80% adenoid vev ble brukt. Alle pasientene hadde normal PSA nivåer før operasjonen og karsinom ble ekskludert av histopatologi.
Cohort C består av 21 kreftprøver hentet fra Institutt for Urologi ved Universitetssykehuset Würzburg, Tyskland. Par av friskt frosset PCa vev og tilstøtende godartet vev, ble anvendt for mRNA og miRNA isolasjon. Denne gruppen inneholder pasienter med uselekterte Histo-patologisk PCA prøven (høy, mellomliggende gruppe, og lav risiko kreft). Siden mRNA isolering av Dypfryst vevsprøve er mer effektivt i forhold til isolasjon på FFPE- prøver vi jobbet med denne kohorten for korrelasjonsstudier på uttrykk for
HMGA1 Hotell og
la-7b
. For denne analysen klinikken-patologiske data var irrelevant og derfor ikke vist. Histologisk evaluering ble utført av en Senior patolog (PS!). Cancerprøver inneholdende minst 80% maligne celler ble anvendt for videre analyser. Områder med minst 80% kanaler og ingen kreftceller ble valgt for tilstøtende godartet vev.
Studiene ble godkjent av lokale etikkutvalg av det medisinske fakultet ved Universitetet i Würzburg, Tyskland (nr. 59/04 ) og det katolske universitetet i Leuven, Belgia (UZ Leuven Study antall S54424; belgisk studie nummer B322201214832); alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke.
Microarray analyse
For å screene for kandidat Mirs, blir korrelert med dårlig resultat 6 BPH vev og 13 høyrisiko PCA prøvene ble hybridisert til mikromatriser (kohort A) . Høyrisiko PCA prøvene ble delt inn i to grupper (gruppe 1: CPFS (n = 7), gruppe 2:. CF (n = 6) (se tabell 2 for detaljer) Et sett av 668 Mirs (Probe Set 1564V2 Mirvana Applied Biosysems ) ble oppdaget på Nexterion ™ Hisense E microarray lysbilder i quadruplicates. Vi brukte Pure-Link FFPE Total RNA Isolation Kit og RiboMinus Konsentrasjon Module (Invitrogen) for RNA rensing. Skyv behandlingen ble utført i henhold til Applied Biosystems
MIR
Vana ™ bøkene. Den microarray data er tilgjengelig under GEO sjonsnummer GSE18671.
RNA utvinning og revers transkripsjon
Total RNA ekstraksjon fra parafin-embedded eller frosne vevsprøver og PCa cellelinjer ble utført ved hjelp av Gjenopprett alt Total Nucleic Acid Isolation Kit og Total RNA Extraction Kit henholdsvis (Ambion og miRNeasy Mini Kit, Qiagen). Spesifikk cDNA ble syntetisert fra total RNA med stilk-løkke revers transkripsjon primere ifølge TaqMan® MiR analyseprotokollen (PE Applied Biosystems). Uspesifikke cDNA syntese ble utført med ImProm-II ™ Reverse Transcription System (Promega) i henhold til den absolutte QPCR SYBR Grønn protokollen (Thermo Scientific).
QRT-PCR
Bekreftelse av microarray resultater på uavhengige utvalg og på økt utvalgsstørrelse ble gjort ved hjelp QRT-PCR. M (i) RNA uttrykk i vevsprøver og cellelinjer ble kvantifisert med enten TaqMan® (MIR) eller SYBR Grønn (mRNA) analysesett og BioRad OPTICON 2 etter produsentens instruksjoner (BioRad). Primere for
la-7a-d, MIR-16, -29a, -221, -146b, etter og
-181b
ble oppnådd fra Applied Biosystems; liten kjernefysiske RNA
RNU6B
ble søkt om normalisering.
β-Actin
tjente som husholderske for
HMGA1
uttrykk (Applied Biosystems). Relativ m (i) RNA-ekspresjon ble beregnet ved den komparative A C
t-metode (A C
t sample = C
t sample – C
t
RNU6B
). De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt for å vurdere fold endringer i m (i) R-uttrykk mellom prøver og kontroller. Gjennomsnittlig C
t ble bestemt ut fra tredoble PCR eksperimenter. Standardavvik var ≤0.4, p-verdier og 0,05 ble betraktet som signifikant
Cell Kultur og Transient Transfeksjon
LNCaP og PC-3 celler ble oppnådd fra ATCC, Tyskland ved hjelp av passasjer 5-35.. celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator ved 5% CO
2. Celler ble sådd og samtidig transfektert i 6-brønners plater i en tetthet på 3,5 x 10
5 per brønn ved bruk av RPMI 1640 medium Gibco uten Phenolred, inneholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), Glutamax (Invitrogen), NEAA (Gibco ), HEPES-buffer-løsning (PAA), og natriumpyruvat oppløsning (PAA). Transient transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine ™ reagens (Invitrogen) og Opti-MEM® (Invitrogen-Gibco) etter leverandørens anvisninger. Precursor- henholdsvis antigo
la-7b
ble brukt for å indusere eller undertrykke
la-7b
uttrykk, pre- og anti-negative
la-7b plakater (Applied Biosystems) var brukes for kontroll transfeksjon. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon.
Western Blot
celler ble lysert i Cytobuster eller Phosphosafe (Novagene) etter fremstillingen og bestemmelse av like store mengder proteiner ble separert på SDS-PAGE og senere overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad). For protein uttrykk for
HMGA1
vi brukte 1 mg /ml geit polyklonale antistoffer (
HMGA1a /1b
, Abcam);
β-Actin plakater (Abcam) tjente som husholderske. For visualisering vi brukte pepperrotperoksidase-coupled sekundære antistoffer (Abcam og Dako) og ECL Plus kit (GE Healthcare). For kvantifisering av bandet intensiteten vi brukte bilde J (https://imagej.nih.gov/ij/).
Luciferase Assay
3’UTR av menneske
HMGA1
gen ble PCR-amplifisert ved anvendelse av følgende primere som inneholdt ytterligere Hind III Spe i eller områder: HMGA1Hindfor: 5′-GATC AAGCTTCATATTGTGGTGATGGAG-3 «; HMGA1SpeIrev: 5»-CAAT ACTAGT GAACATTTGGCGCTGGTAG-3 «. Den resulterende
HMGA1
PCR fragment som inneholder de to mest nedstrøms ligger
la-7b
utfyllende nettsteder til
HMGA1
ble klonet nedstrøms for Renilla luciferase stoppkodon i en luciferase reporter plasmid (pMIR- RAPPORT-Luciferase, apllied Biosystems) ved hjelp av Hind III og Spe i områder. For å utføre luciferase-bestemmelser LNCaP-celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 3,5 x 10
5 per brønn og inkubert i 24 timer. Reporteren vektor ble co-transfektert inn i LNCaP celler med en kontrollgruppe som ikke er rettet mot RNA oligonukleotid eller
la-7
forløper miRNA. Forbigående transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine ™ reagens (Invitrogen). 48 timer etter transfeksjon luciferase-aktiviteten ble analysert ved Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Renilla aktivitet ble brukt for normalisering og som en kontroll for transfeksjon effektivitet
Statistiske og bioinformatikk analyse
Microarray-analyse:. Spot intensiteter fra skannede lysbildene ble kvantifisert ved hjelp ScanAlyze programvare (http: //rana .lbl.gov /EisenSoftware.htm). Data ble analysert med ulike R pakker fra Bioconductor prosjektet (www.bioconductor.org). Resulterende signal intensiteter ble normalisert ved varians stabilisering [28]. Differensielt uttrykte gener ble valgt fra microarray data ved limma (lineære modeller for microarray analyse) pakke [29]
QRT-PCR-analyse:. Prøvene ble sammenlignet med en Welch Two Sample t-test. Før videre analyse av kollektiv A, ble z-score av de relative uttrykk verdier skapes. Deretter den optimale cut-off point for
la-7
ble bestemt av mottaker operere karakteristisk (ROC) kurve analyse (R-pakke «Proc «). Basert på den resulterende terskelen uttrykket verdiene ble dikotomisert. Assosiasjonene mellom uttrykk og klinisk tilbakefall ble bestemt av Cox regresjon med ensartede og multivariate modeller. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å estimere den overlevende funksjon ved forskjellige tidspunkter. Univariate og multivariate hazard ratio med 95% konfidensintervall (KI) ble estimert ved hjelp av Cox-modell (Bioconductor pakke «overlevelse»). P-verdiene 0,05 ble betraktet som signifikant. For å teste, om denne tilnærmingen er aktuelt for et uavhengig testdatasettet, ble z-score skapt for kollektiv B. Men for dikotomisering terskelen avledet fra kollektive A ble brukt. Alle etterfølgende trinn ble utført som beskrevet for kollektiv A. For sammenheng mellom
HMGA1 Hotell og
la-7b
Pearson korrelasjon ble beregnet.
Resultater
Kreft spesifikke miRNA Expression Status i høyrisiko PCa
Vi utførte microarray analyse av miRNA isolert fra seks parafin-embedded BPH og 13 PCA prøver å screene for kandidat mirnas å bli assosiert med utvikling eller progresjon av høy-risiko sykdom. De analyserte PCA tilfellene var en del av et godt karakterisert høy risiko kollektiv (kohort A) (tabell 1), og ble valgt på grunnlag av deres kliniske utfall. De forhåndsvalgte PCA saker ble delt inn i to grupper ved klinisk svikt og oppfølging uten tilbakefall av sykdommen (gruppe 1: CPFS vs. gruppe 2: CF). Tabell 2 viser kreft egenskapene til begge gruppene.
Målet med denne analysen var å screene for en bestemt miRNA signatur av høyrisikokreftpasienter med tilbakefall av sykdommen. Utgangspunktet vi sammenlignet miRNA uttrykket i alle 13 høyrisiko PCA tilfeller sammen til den av godartet sykdom. Av alle forskjellig uttrykt mirnas (uttrykk ganger endring 1,5 og p-verdi 0,05) majoriteten av 61 Mirs ble nedregulert og 21 Mirs var oppregulert i høyrisiko sykdom. Se tabell S1 for en oversikt over alle opp- og ned-regulert miRNAs. Hierarkisk clustering, basert på de utvalgte 82 forskjellig uttrykt mirnas, genereres et tre med klart skille mellom ondartet sykdom og hyperplasi (Fig. 1a). Selv om sammenligningen ble utført bare mellom godartet og ondartet sykdom, en sub-gruppering av svulstene basert på deres kliniske resultatet var tydelig.
A. Microarray profilering av 6 BPH og prøver 13 høyrisiko PCa vev (kohort A). Sistnevnte ble delt av kliniske utfall: gruppe 1: høy risiko PCa + CPFS (n = 7); gruppe 2: høy risiko PCa + CF (n = 6). Row-messig skalert heatplot av gener som viser en fold endring 1,5 og en justert p-verdi 0,05. Red indikerer høy uttrykk, grønn lav uttrykk. Kreft og ikke-kreft prostata vev er klart adskilt. Clustering indikerer et skille mellom gruppe 1 og 2. B. Teknisk validering av microarray data ved QRT-PCR. Relativ uttrykk for
MIR-16
,
-29a
, og
-221
ble analysert i seks BPH (hvit) og 13 høyrisiko PCA prøver (grå). MiRNA uttrykket vises som middel for BPH og høy risiko PCa uttrykk med feilfelt for standardavvik. * Indikerer p. 0,01, p-verdiene ble beregnet ved hjelp av Welch to utvalgs t-test
For å utføre en teknisk validering av tabellen resultatene vi analysert uttrykket av tre av de mest forskjellig uttrykt miRNAs, blant andre. Som vist i figur 1B og 2B vi kunne bekrefte betydelig nedregulering av
la-7a /b /c, MIR-16
,
-29a
,
-146, – 181 Hotell og
-221
før sett i tabell data ved QRT-PCR.
A. Venn-diagram som viser forholdet mellom menneskelige Mirs som ble uttrykt signifikant forskjellig (± 1,5 ganger) ved PCA gruppe 1 vs PCa gruppe 2 mot BPH (adj p 0,05). Circles inneholde tall av opp- eller nedregulert human Mirs av hver parvis sammenligning. Vanlige Mirs mellom ulike sammenligninger er vist i kryss. Grå bokser indikerer uttrykk status for
la-7
familiemedlemmer. Tabellen nedenfor viser alle menneskelige Mirs der uttrykket var signifikant forskjellig enten mellom (gr.1 vs. gr.2), (gr.2 vs. BPH) og (gr.1 vs. BPH) (rød søyle); mellom (. gr 1 vs. gr 2.) og (gr 2 mot BPH.) (grønn kolonne); eller mellom (gr. 1 vs. gr. 2) og (gr. 1 vs. BPH) (blå kolonne). Alle mirnas rangeres basert på maksimalt uttrykk ganger endring. De to kolonnene til side på listen over mirnas indikere en opp- eller ned-regulering i uttrykket (se pilene) og dimensjonen av uttrykket ganger endring. B. Validering av microarray data ved QRT-PCR. Relativ uttrykk for
MIR-146b
,
-181b
, og
la-7a Twitter /
b Twitter /og
-c
ble analysert i seks BPH (hvit), 7 høyrisiko PCA prøver med CPFS (gruppe 1) (lys grå), og 6 høyrisiko PCA prøver med CF (gruppe 2) (mørk grå). MiRNA uttrykket er vist som uttrykksmiddel i BPH og høy risiko vev, henholdsvis med feilfelt for standardavvik. * Indikerer p. 0,01, p-verdiene ble beregnet ved hjelp av Welch to utvalgs t-test
MiR Expression Profil Høy risiko PCa med forskjellige kliniske progresjonsfri overlevelse
Basert på separasjon av både risikogrupper av klyngeanalyse vi en hypotese for å finne en miRNA profil i PCA tilfeller med progressiv sykdom. Derfor analyserte vi microarray data med hensyn til Mirs som ble uttrykt forskjellig i både høyrisikogrupper (endring 1,5 og P-verdi 0,05). Venn-diagrammet i figur 2A og figur S1 visualplotting av alle menneskelige Mirs som ble forskjellig uttrykt i BPH vev, i høy-risiko PCa vev med CPFS, og i høy-risiko vev med CF. I alt ble 148 Mirs Variert uttrykk innenfor alle tre vevstyper. Uttrykket av syv mirnas (nemlig
la-7a /c, MIR-515-3p /5p, -181b, -146b
, og
-361
) ble funnet å være signifikant forskjellig alle tre gruppene analysert (BPH, gruppe 1 og 2) som indikerer en spesifikk miRNA profil for høy risiko PCa med progressiv sykdom. 47 mirnas viste forskjellig uttrykk i gruppe 1 vs gruppe 2; blant de ti mest forskjellig uttrykt mirnas vi fant flere medlemmer av
la-7
familie (Fig. S1).
Ved hjelp av RT-PCR analyse uttrykk forskjeller mellom BPH, gruppe 1 og 2 for
la-7a, la-7c
,
MIR-146b
, og
-181b
kunne bekreftes (fig. 2B). Siden uttrykk for
la-7b Hotell og
-d
ble vist å diskriminere minst to av de tre vevstyper vi inkludert både
la-7
familiemedlemmer i videre analyser . Som spådd av tabelldata,
la-7
familiemedlemmer viste en progressiv nedregulering fra godartet til ondartet (gruppe 1) og videre til aggressiv sykdom (gruppe 2), mens uttrykk for
MIR-146b Hotell og
-181b
var lavest i gruppe 1 (fig. 2B).
La-7d
uttrykk var neppe påvises ved RT-PCR og ble derfor ekskludert i videre undersøkelser.
Uttrykk for
la-7a /b /c
er betydelig nedregulert i høyrisiko PCa
etter microarray og RT-PCR-analyser vi identifisert noen
la-7
familiemedlemmer (
la-7a-c
) som potensiell kandidat Mirs for diagnostiske og prognostiske markører i høyrisiko PCa.
Vi ønsket nå å bekrefte disse resultatene etter QRT-PCR eksperimenter på hele vår høy-risiko kohort A (n = 98). Statistisk analyse av QRT-PCR data bekrefter en betydelig nedregulering av
la-7a-c
i høyrisiko PCA tilfeller sammenlignet med benign hyperplasi (p≤0.001) (Fig. 3A). I ca 81/84 /og 96% av vevsprøver analysert, uttrykk for
la-7a /b Hotell og
, etter henholdsvis -c, var under medianen uttrykk for BPH prøvene (fig. 3B), noe som indikerer svulsten spesifikke verdien av
la-7
familiemedlemmer hos pasienter med høy risiko prostatakreft.
A. Boks- og whisker-plot av relativ uttrykk for
la-7a /b /c
i seks BPH (hvit strek) og 98 høy risiko PCa (grå bar) vevsprøver. Ekspresjon ble bedømt ved QRT-PCR. B. Figur 3B oppsummerer median uttrykk for
la-7a Twitter /
b Twitter /
c
i seks BPH og 98 PCA prøver og viser tilsvarende standardavvik og p-verdi . Median ekspresjon av BPH prøvene ble anvendt som terskel. Prosentandelen av PCA prøver med nedregulert
la-7
uttrykk er vist i sjette kolonne i tabellen. C. Box- og whisker-plot viser uttrykk for
la-7b Hotell og
7C
i 98 høyrisiko PCa vev og 6 BPH eksemplarer; vurdert av QRT-PCR. Subgrupper er basert på: • patologisk tumor funksjoner som Gleason Score og patologisk tumorstadium (GS ≤7, PT ≤3a – lys grå), (GS ≥8, PT ≥3b – mørk grå) og • klinikk-patologiske egenskaper som BCR, CF, CRD (ingen BCR /nei CF /nei CRD – lys grå), (BCR /CF /CRD – mørk grå). A. + C
La-7a Twitter /
b Twitter /og
-c
uttrykk vises som betyr med feilfelt for standardavvik. * Angir p 0,01 (A) eller p 0,05 (C). p-verdiene ble beregnet ved hjelp av Welch to utvalgs t-test.
nedregulering av
la-7b
er assosiert med aggressiv kreft Kjennetegn
Basert på antagelsen om at noen
la-7
familiemedlemmer er progressivt nedregulert i de mer aggressive PCA tilfeller (gruppe 2), vi postulerte at nedregulering av
la-7
kan også være assosiert med klinikk-patologiske funksjoner eller prognose av PCA pasienter. Derfor har vi sett etter sammenheng mellom
la-7a /b /c
uttrykk og svulst kjennetegn PCA kollektive A som Gleason Score (7≤ GS ≥8), patologisk tumorstadium (3a ≤pT ≥3b) og kliniske endepunkter som BCR, CF, og CRD (se tabell 2). Vi fant progressive nedregulering av
la-7b
hos pasienter med dårlig kreft egenskaper som høy Gleason Score (≥8), biokjemisk tilbakefall og klinisk svikt (p 0,05) (figur 3C.). Men uttrykk for
la-7c
ble korrelert med CF bare. Ingen korrelasjon ble sett mellom
la-7b
eller
7C
uttrykk og patologisk tumorstadium (3a ≤pT ≥3b) eller CRD (Fig. 3C). Siden
la-7a
manglet noen betydelige resultater i form av kreft egenskaper og kliniske endepunkter vi neglisjert dette Mir i våre videre analyser (fig. S2).
La-7b
og
la-7c
som prognostisk markør for Progresjon i en høy-risiko PCa Collective (kohort A)
for å finne ut om
la-7b
eller
– 7c
kan tjene som en prognostisk indikator for biokjemisk tilbakefall eller klinisk svikt vi dikotomisert en høyrisiko studiegruppe (kohort A) i lav og høy
la-7b /c
uttrykk basert på z-score. Kaplan-Meier estimater viste en signifikant forskjell mellom gruppene med høy og lav
la-7b
uttrykk i BCR (log rank p = 0,01), mens
la-7c
viste border betydning (log rank p = 0,08) (fig. 4A). Den 10 år biokjemisk progresjonsfri overlevelse var 65% og 37% for høy og lav
la-7b
uttrykk, henholdsvis. For
la-7b Hotell og
la-7c
Kaplan-Meier estimater også spådd en signifikant forskjell mellom gruppene med høy og lav uttrykk i CF (log rank p 0,001) (Fig. 4A) . 14 av 38 pasienter (37%) med lav
la-7b
uttrykk, men bare 5 av 60 pasienter (8,3%) i høy
la-7b
uttrykk gruppen ble funnet å ha opplevd CF.
Kaplan-Meier analyse for biokjemisk og klinisk tilbakefall av 98 og 92 pasienter med høy risiko sykdom (kohort A og B). Grupper ble dikotomisert i lav og høy
la-7b Hotell og –
7c
uttrykk. Overlevelseskurver ble generert ved hjelp av Bioconductor pakken «overleve». A. Kaplan Meier analyse av kohort A, læringsdatasettet (n = 98). B. Kaplan Meier analyse av kohort B, testing datasettet (n = 92). Lav
la-7b
uttrykk er forbundet med BCR og CF.
Cox regresjonsanalyse viste at
la-7b
men ikke
la-7c
uttrykk var univariately betydning for prediksjon av BCR (HR 0,36 (0,16 til 0,82)). Når
la-7b
uttrykk og Gleason Score ble vurdert sammen i en multivariat modell begge variablene uavhengig spådd BCR. Til slutt, vi vurdert om
la-7b
eller
la-7c
er uavhengige markører for klinisk svikt i kohort A. uttrykk for begge Mirs er univariately betydning for prediksjon av klinisk svikt (tabell 3). Men i en multivariat Cox regresjonsmodell høy Gleason score, men ikke
la-7b
eller –
c
var signifikant korrelert med dårlig prognose
I sammendraget. Kaplan Meier estimater og Cox regresjonsanalyse viser at lav
la-7b Hotell og
la-7c
uttrykk kan være korrelert til BCR og CF i kohort A.
Validering av
la-7b Hotell og
la-7c
prognostiske markører i en uavhengig, ekstern Testing Collective (kohort B)
for å validere den rollen
la-7b Hotell og –
c
prognostiske markører vi jobbet med en uavhengig kollektiv av primære høyrisiko PCA tilfeller (kohort B). Som allerede observert for kohorten A vi har oppdaget en betydelig nedregulering av
la-7b Hotell og
la-7c
i PCA prøvene sammenlignet med BPHs (tabell S2). Vi skapte Z-score nivåer basert på analyserte A C
t ekspresjonsdata av både
la-7
s i test kohort. Deretter vi dikotomisert testing kohorten ved hjelp av cut-off nivå identifisert for kollektiv A. Hver prøve ble spådd å være enten på høy eller lav risiko for BCR eller CF basert på følgende terskler.
