Abstract
Innledning
Expression nivåer av
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
microRNAs i menneskets ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er assosiert med tilbakefall av sykdommen etter operasjonen. For å forstå dette, effekten av
MIR-146b
overekspresjon ble studert i A549 humane lungekreftceller.
Metoder
A549 celler, konstruert med lentiviruses å overuttrykker human
pre-MIR-146b
forløper mikroRNA, ble undersøkt for spredning, kolonidannelse på plastoverflaten og i myk agar, migrasjon og invasivitet i cellekultur og in vivo i mus, kjemosensitivitet til cisplatin og doksorubicin, og global genekspresjon .
MIR-146B
uttrykk ble vurdert i microdissected stroma og epitel av menneskelige NSCLC tumorer. Association of
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
uttrykk i tidlig stadium NSCLC med tilbakefall ble analysert.
hovedfunnene
A549
pre-MIR-146B
-overexpressors hadde 3-8 ganger høyere nivåer av både
MIR-146B
microRNAs enn kontrollceller. Overekspresjon endret ikke celleproliferasjon, kjemosensitivitet, migrasjon, eller invasivitet; påvirkes bare 0,3% av mRNA transcriptome; og redusert evne til å danne kolonier i in vitro med 25%. I menneskelige NSCLC tumorer, uttrykk for både
MIR-146B
microRNAs var 7-10 ganger høyere i stroma enn i kreft epitel, og høyere
MIR-146b-5p
men lavere
-3
p nivåene var prediktiv av tilbakefall.
Konklusjoner
Bare en minimal effekt av
pre-MIR-146b
overekspresjon på ondartede fenotype ble sett i A549 celler. Dette kan være på grunn av motstridende effekter av
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
overekspresjon som foreslått av de motstridende tilbakefall-prediktiv verdiene av de to microRNAs, eller fordi
speil 146b
uttrykk endringer i ikke-kreft stroma og ikke kreft epithelia av svulster er ansvarlig for den prognostiske verdien av
MIR-146b
Citation. Patnaik SK, Kannisto E, Mallick R , Yendamuri S (2011) Overuttrykte av Lung Cancer-Prognostic
MIR-146B
microRNAs har en minimal og negativ effekt på Ondartet Phenotype av A549 lungekreft celler. PLoS ONE 6 (7): e22379. doi: 10,1371 /journal.pone.0022379
Redaktør: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 5 mai 2011; Godkjent: 20 juni 2011; Publisert: 18.07.2011
Copyright: © 2011 Patnaik et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Summer Internship pris fra American Association of Thoracic Surgery til RM, og priser fra Buswell Foundation, kreft og leukemi gruppe B, og Thoracic Surgery Foundation for forskning og utdanning til SY. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs er Ultra ikke-kodende RNA som regulerer cellulære prosesser ved sin sekvens-spesifikk innvirkning på stabiliteten og oversettelse av flere messenger RNA (mRNA). Studier i løpet av de siste årene har vist betydningen av disse epigenetiske regulerings molekyler i kreft biologi [1] samt deres verktøy som biomarkører for sykdomstilstander [2]. Vi har tidligere kvantifisert uttrykk for microRNAs i 77 menneskelige stadium I ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) svulster til å identifisere microRNAs hvis nivåer er assosiert med tilbakefall av sykdommen etter kirurgisk reseksjon [3]. Uttrykk for
MIR-146B
microRNAs,
MIR-146b-5p Hotell og
MIR-146b-3p
, i svulstene var signifikant forskjellig mellom saker som hadde et tilbakefall og de som ikke gjorde det, med gjennomsnitts
MIR-146b-5p
nivå høyere, men gjennomsnittlig
MIR-146b-3p
nivå lavere i førstnevnte gruppe. Videre i interne kryss valideringer,
MIR-146b-3p
ble identifisert som en hyppig bestanddel av seks mikroRNA støtte vektor maskiner classifiers som kunne forutsi tilbakefall med en bety nøyaktighet på 69%. Høyere uttrykk for
MIR-146b-5p
i humane svulster ble også funnet å være assosiert med dårlig total overlevelse i fase I-III NSCLC i en studie som fokuserte på plateepitelkarsinom utvalg av sykdommen, men fikk ikke undersøke
MIR-146b-3p product: [4]. Dess lungekreft, et høyere nivå av
MIR-146b-5p
i tumorer er også forbundet med en mer ondartet sykdom i humane papillære thyroideakarsinom [5].
I mennesker, både
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
microRNAs er produkter av samme
MIR146B
gen som ligger på kromosom 10 i posisjon q24.32. Som de fleste par 5p og 3p microRNAs, de to
MIR-146B
microRNAs genereres fra de motsatte tråder (5 «og 3» armer) av en dobbeltrådet stammen regionen en forløper mikroRNA,
pre-MIR-146b
, som i sin tur er avledet fra det primære
MIR146B
RNA-transkript [6]. Uttrykket av
MIR-146b-5p
synes å være allestedsnærværende i menneskelig vev, selv om høyere nivåer er sett i lunge, thymus og milt [7]. Små RNA kloning og dype sekvense studier viser at mengden av
MIR-146b-3p
i cellene er mye mindre enn for
MIR-146b-5p product: [8], [9]. En slik forskjell er sett for mange 5p og 3p mikroRNA par, som utgjør et flertall av microRNAs. Denne tråd forspenningen antas å være et resultat av termodynamiske virkninger på mikroRNA behandling diktert av mikroRNA sekvensene [10], [11], så vel som nivåene av mål-mRNA i det cellulære miljø [12], [13]. Selv om en av de 5p og 3p microRNAs kan være mye mindre tallrike enn den andre (og ofte referert til som «mikroRNA * «arter), kan det ha betydelig innflytelse på celletilstand [14], [15]. Det bør bemerkes at arten av strengen forspenningen kan variere spatiotemporally. For eksempel
MIR-202 Twitter /
MIR-202 *
uttrykk ratio endringer fra ~0.5 å ~0.9 løpet kvinnelige gonadogenesis i kyllingembryoer [16], og mus
speil 194-5p
er til stede på et høyere nivå enn
MIR-194-3p
i nyrene og magen, men på et lavere nivå i lunge og livmor [17].
en rekke studier har undersøkt hvilken rolle
MIR-146B
microRNAs i kreft himling-linjer. I en studie av U373 menneskelig glioblastom celler, ble invasivitet og migrasjon redusert med overekspresjon av microRNAs og økte med deres knockdown hjelp antisensoligonukleotider, og målretting av transkripsjoner av
MMP16
matriksmetalloproteinase gen av
MIR -146b-5p
ble identifisert [18]. In vitro-migrering og invasjon av en annen human glioblastoma cellelinje, U87-MG, er også blitt vist å bli redusert med
MIR-146b-5p
overekspresjon [19]. Den mikroRNA ble vist å målrette transkripsjoner av
EGFR
genet som koder for epidermal vekstfaktor reseptor.
EGFR
for målretting av
MIR-146b-5p
har også vært vist i MDA-MB-231 humane brystkreftceller [20]. Som i de glioblastom studier,
pre-MIR-146b
overekspresjon i cellene reduseres deres migrasjon og invasivitet [20]. Lignende funn ble rapportert i en annen studie som også foreslått en rolle for
MIR-146b-5p
i negativt regulere nukleær faktor-kB (NF-kB) veien [21]. Slike funksjonelle studier er ikke utført i lungekreftceller. For å forstå sammenhengen av
MIR-146B
microRNAs med lungekreft prognose, forsøkte vi å studere effekten av overekspresjon
pre-MIR-146b
forløper mikroRNA på malign fenotype av A549 lunge adenokarsinom cellelinje.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
All forskning presenteres her ble godkjent av Institutional Review Board i Roswell Park Cancer Institute (RPCI). Alle dyreforsøk ble utført etter godkjenning av RPCI institutt Animal Care og bruk komité i henhold til protokollen antall 1132M.
Cell kultur
A549 human lunge adenokarsinom og BEAS-2B normale menneskelige bronkial epiteliale cellelinjer var innhentet fra ATCC® (Manassas, Virginia). TLA-HEK293T ™, en human embryonisk nyrecellelinje avledet fra den 293T cellelinje, ble erholdt fra Open Biosystems® (Huntsville, AL). A549 og TLA-HEK293T ™ celler ble dyrket ved 37 ° C i 90% luftfuktighet og 5% CO
2 i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (+ DMEM; Mediatech®, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories ®, Pasching, Østerrike) i en Steri-Cult ™ inkubator (Thermo Fisher Scientific®, Waltham, MA). LHC-9 medium (Invitrogen®, Carlsbad, CA) ble anvendt for BEAS-2B-celler. Cellelinjer ble generert på denne studien ble dyrket i nærvær av 2 ug /ml puromycin (Roche®, Indianapolis, IN). Cellene ble høstet ved å bruke 0.05% trypsin med 0,25 mM etylendiamin-tetraeddiksyre (Invitrogen®). Celler ble dyrket i ikke mer enn seks uker, og samtidig-dyrkede og på lignende måte aldrende celler ble anvendt ved sammenligning av cellelinjer. Vedlikehold kulturer ved semi-samløpet ble brukt til å sette opp eksperimenter. En Scepter ™ elektronisk teller (Millipore®, Billerica, MA) eller engangs hemacytometer lysbilder (Incyto®, Düsseldorf, Tyskland) ble brukt for å måle celle-tettheter av re-suspendert celler.
Generering av stabilt-transduced celle Modellsøk
Komplementær, single DNA oligonukleotider med menneske
pre-MIR-146b
sekvens (miRBase [22] tiltredelse nummer MI0003129) og restriksjonsenzym språk overheng ble hentet fra Integrated DNA Technologies® (Coralville, IA). Oligonukleotider ble også oppnådd for en variant sekvens der segmentene for
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
microRNAs ble byttet. Etter annealing å generere dobbelttrådet DNA ble oligonukleotider ligert til
Xho
I- og
Ikke
I (Invitrogen®) -digested pLemiR ™ vektor (Open Biosystems®). TOP10 ™ kompetent
E. coli
(Invitrogen®) ble varme transformert med ligeringsprodukter. Plasmid-DNA ble fremstilt fra kulturer av valgte enkle kloner ved bruk av et kit som leveres av Qiagen® (Valencia, CA). Identitet av plasmider ble bekreftet ved DNA-sekvensering ved en kjernefasilitet ved Roswell Park Cancer Institute i Buffalo, New York (RPCI). Konstruert lentiviruses ble utarbeidet av trans plasmider inn TLA-HEK293T ™ celler ved hjelp av reagenser og protokoller som følger med Trans-Lentiviral GIPZ ™ pakkesystem (Open Biosystems®). A549-celler ble transdusert med virus i 48 timer og deretter underkastet seleksjon mot 2 ug /ml puromycin i omtrent to uker for å generere cellelinjer A549 /vec, A549 /146b, og A549 /v146b, ved hjelp av virus som er generert med en tom pLemiR ™ vektor, eller med vektoren som bærer naturlig eller variant
pre-MIR-146b
sekvens, henholdsvis.
Flow cytometri
Flowcytometri av nylig høstet celler farget med 1 mg /ml av
7
amino-actinomycin D levedyktighet fargestoff (Sigma®, St. Louis, MO) ble utført på en FACSCalibur maskin (BD Biosciences®, San Jose, California). Forover- og side-scatter og fluorescens i FL2 og FL4 kanaler ble registrert for 10.000 hendelser, og FL2 fluorescens verdier ble plottet etter gating ut døde celler med Cellquest ™ Pro-programvaren (versjon 5, BD Biosciences®).
celleproliferering analysen
celleproliferasjon ble utført ved hjelp av Cell Counting Kit-8-analysen (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies®, Rockville, MD) som bruker bioreduction av
2
-(
2
-methoxy-
4
-nitrophenyl)-
3
-(
4
-nitrophenyl)-
5
-(
2
,
4
-disulfophenyl)-2H tetrazolium natrium (WST-8) til orange-farget formazan å måle cellenes levedyktighet. I korthet ble 100 ul celler ved 2-4×10
4 /ml celler ble sådd ut på 96-brønners kulturplater. På forskjellige tidspunkter i løpet av de neste fire dager ble kulturmediet i kvadruplikat-brønner erstattet med friskt medium inneholdende 5% CCK-8-reagens, og etter en time, ble absorbans ved 450 nm målt med en Multiskan Plus (MTX Lab Systems® , Vienna, VA) plateleser. Absorbans-verdiene ble korrigert ved å trekke dem fra kontrollbrønnene som ikke har celler.
Drug sensitivitetsanalysen
Cellene ble dyrket til 50% -60% konfluens i 96-brønners kulturplater i quintuplicate når dyrkingsmediet ble erstattet med den som inneholder 0,5-2,0 mikrogram /ml av enten doksorubicinhydroklorid (Enzo Livet Sciences®, Farmingdale, New York) eller cisplatin (Calbiochem®, San Diego, California) eller ingen av delene. Etter to dagers dyrkning ble levedyktighet av celler målt som beskrevet for den celleproliferasjonsanalyse.
kolonidannelse assays
For adherente kolonidannelsen assays, 200 celler ble utplatet per 35 mm dyrkningsskål- i triplikat og dyrket med medium endres hver 4-5 dager. Etter 10-14 dager ble retter beiset med 0,2% metylenblått i 40% metanol i 30 minutter. For kolonidannelse i myk agar, ble en tallerken først belagt med 1,5 ml medium inneholdende 0,7% agar (Sigma®) før cellene i 2 ml medium inneholdende 0,35% agar ble tilsatt ved 150 celler /skål. Etter polymerisasjon av agarose i ca 15 minutter, ble 2 ml medium tilsatt. Celler ble dyrket i 6-7 uker med medium endre hver 4-5 dager, og deretter farget med 2 mg /ml tiazolyl blå tetrazolium-bromid (Sigma®) i 4-8 timer i cellekulturinkubator. Stained retter ble skannet på en Perfection V700 (Epson®, Long Beach, California), og et minimum areal på bilder som tilsvarer 3778 eller 199 mikrometer
2, henholdsvis for tilhenger og myke agar-koloni analyser, ble brukt for å identifisere kolonier for kvantifisering ved hjelp ImageJ ™ (versjon 10.2, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD).
In vitro sårheling analysen
Seks-brønners kulturplater ble markert med et trådkors mønster på den utvendige overflate av deres bunner. Cellene ble deretter platet i triplikat ved en høy tetthet for å nå 100% konfluens en dag senere, når en tilnærmet 2 cm lang og 0,5 mm bred sår ble laget ved å flytte en plastisk 10 mL pipette-spissen langs en rett kant med moderat og konsekvent press for å lage riper i cellemonolaget. Dyrkningsmediet ble så byttet ut. Celler ble fotografert umiddelbart og etter en dag med kultur på 50x forstørrelse på de samme stedene langs riper.
Transwell ™ migrasjon og invasjon analyser
tjuefire vel Transwell ™ plater med en polykarbonat membran og et 8 um porestørrelse ble oppnådd fra Corning (Corning, NY). Semi-konfluente celler som var blitt sultet i 16-20 timer med kultur i serumfritt DMEM + medium ble høstet fra 10 cm-kulturskåler, vasket to ganger med fosfat-bufret isotonisk saltløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na
2HPO
4 og 1,76 mM KH
2PO
4 ved pH 7,4), og re-suspendert i serumfritt + DMEM medium med 2-3 × 10
5 celler /ml. Celler ble sådd ut i triplikat i 0,1 ml DMEM + per Transwell ™, med bunn- brønner inneholdende 0,6 ml + DMEM-medium med 15% føtalt bovint serum. Det samme volum av cellesuspensjoner ble samtidig sådd ut i triplikat i brønner av 24-brønners kulturplater for indirekte å vurdere celletetthet ved måling av cellenes levedyktighet etter 8-16 timer som beskrevet for celleproliferasjonsanalyse. For invasjons analyser, de Transwell ™ membranene ble forhåndsbelagt med enten Cultrex ™ PathClear ™ basalmembran ekstrakt fremstilt fra murin-Engelbreth-Holm-Swarm tumorceller, eller kollagen fra rottehaler (Trevigen®, Gaithersburg, MD). Belegget ble utført ved lagdeling 50 ul av proteinene ved 1,5 mg /ml og 50 ug /ml, henholdsvis, i serumfritt DMEM-medium + og tillater lagene til tørrhet under 90% fuktighet ved 37 ° C i 1 time og 16- henholdsvis 24 timer,. Tørkede lagene ble vasket tre ganger med serumfritt DMEM-medium + før cellene ble sådd ut. Etter 8 eller 16-20 timer, respektivt, for migrasjons eller invasjons assays, øvre overflater av Transwell ™ membranene ble tørket med bomullspinner for å fjerne ikke-migrerte celler. I migrasjonsanalysen ble cellene igjen i membranene fiksert i 10% nøytral bufret formalin og farget over natten med 0,2% vekt /volum av krystallfiolett (Sigma®) i 2% etanol. Etter grundig vasking med vann for å fjerne ikke-inkorporerte fargestoff, ble 300 ul 10% eddiksyre tilsatt til hver Transwell ™ for å ekstrahere bundet fargestoff ved å riste av brønnene ved 100 omdreininger /minutt i 20 minutter. Ekstraktene ble analysert med hensyn på absorbans ved 595 nm ved bruk av 10% eddiksyre som referanse. I invasjonen analysene, ble rød fluorescens bilder av celler i Transwell ™ membraner kjøpt til 50x forstørrelse i tre forskjellige feltvisninger. Absorbansavlesninger eller det gjennomsnittlige antall celler pr feltet ble normalisert ved hjelp av cellelevedyktighet målinger av de cellene som var blitt belagt samtidig i separate kulturer.
pulmonal tumordannelse assay
Dette arbeidet ble godkjent av ulike institusjonelle utvalg ved RPCI. -Celler dyrket til 70% konfluens ble høstet ved trypsinering i tre minutter, vasket med PBS og resuspendert i iskald + DMEM med 5 x 10
6 celler /ml. En ekspert tekniker brukt en 1 ml-sprøyte med en 27 G nål til å injisere 0,2 ml av celler i halevenen av immunsvikt, kvinnelig, 6-10 uker gamle mus av CB
Igh Anmeldelser –
1
b Twitter /lcrTac-
Prkdc
SCID Twitter /Ros belastning. Musene ble overvåket to ganger ukentlig for anstrengt pusting, samt for generell utilpasshet og noen synlig utseende av en kreft lesjon eller vekst, og avlivet etter 12 uker, selv om ingen av musene hadde noen av disse symptomer eller tegn. Lungene ble fjernet, vasket med PBS, fast for en dag med 10% nøytral bufret formalin og veid etter dabbing av overflødig væske med tørkepapir.
Laser fangst mikrodisseksjon (LCM)
Dette arbeidet ble godkjent av en Institutional Review board på RPCI, og utføres under tilsyn av en patolog ved Institutt for patologi av RPCI på vev fra 12 tilfeller av stadium i NSCLC som hadde blitt behandlet ved instituttet. Formalinfiksert, parafininnebygd, ble 6-8 mikrometer tykk vev-seksjoner med minst 70% svulstvev som er verifisert av histologisk undersøkelse av en patolog som brukes. Vevs-snitt ble plassert på objektglass belagt med en polyetylen-naftalat membran (Leica®, Wetzlar, Tyskland) og tørket over natten ved romtemperatur. Etter de-paraffinization med xylen etterfulgt av gradvis rehydratisering over natten ved bruk av graderte alkoholer, ble platene farget med hematoksylin og eosin, og lufttørket over natten. LCM ble utført på en LMD6000 system (Leica®) ved 200x forstørrelse med laser makt, hastighet og prøve-balansen på 80, 2 og 11, henholdsvis. Tumor-inneholdende regioner på de delene ble identifisert ved den endrede cellulære morfologi av kreft epitelceller. Stromale og epiteliale kreft komponenter av slike regioner ble microdissected og samlet i separate 0,5 ml rør. For hver komponent, områder av 1-12 × 10
6 mikrometer
2 (ca. 0,5-7 x 10
4 celle-seksjoner) ble samlet. Den stromal-til-epitelareal forholdet varierte fra 0,6 til 1.
Isolering av RNA
Silica kolonner, reagenser og protokoller som følger med Purelink ™ RNA (Invitrogen®) eller Høy Pure ™ mikroRNA (Roche®) og FFPE RNA (Norgen Biotek®, Thorold, Canada) kits, henholdsvis, ble brukt til å isolere total fra 2-5 × 10
6 dyrkede celler eller fra proteinase K-behandlet microdissected celler. Nukleinsyre-konsentrasjonen i preparatene ble bestemt ved absorbans spektrofotometri på Ultrospec II (LKB Biochrom®, Cambridge, UK) eller Nanodrop ™ 1000 (Thermo Fisher Scientific®) instrumenter. En fluorometrisk analyse ved hjelp av Quant-iT ™ RiboGreen (Invitrogen®) ble brukt til å kvantifisere nukleinsyrer i preparatene fra de microdissected cellene. Total RNA fra MCF-7 human brystkreft og ML-2 menneskelige akutt myelogen leukemi celler ble vennlig levert av, henholdsvis forskningsgrupper legene. Gokul Das og Eunice Wang RPCI.
Halv kvantifisering av microRNAs ved revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
Semi-kvantifisering av menneskelige microRNAs
la-7a
MIR-30a-5p
,
MIR-146b-5p Hotell og
MIR-146b-3p
, og den lille nukleolært RNA
RNU6B
var ferdig med RT-PCR-basert TaqMan ™ mikroRNA Analyser (Applied Biosystems®, Foster City, CA, analyse IDer 377, 417, 1097, 2361 og 1093, henholdsvis). Kort fortalt ble en RNA-spesifikke oligonukleotid, og reagenser som følger med TaqMan ™ mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®) brukes til å reversere transkribere 10 ng total RNA fra celler, eller 5 pl 0.5-2000 FM syntetiske modne microRNAs
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
med 5 «fosfat og 3» hydroksyl Terminii hentet fra Invitrogen®. CDNA ble anvendt som templat i 40 syklus-PCR-reaksjonene på et 7900HT real-time PCR maskin (Applied Biosystems®). For hver reaksjon, kvantifisering syklusen (C
q
) verdi, tilnærmet omvendt proporsjonal med log
2 verdi av konsentrasjonen av analytt RNA, ble oppnådd med SDS ™ -programvare (Applied Biosystems® ; versjon 2.3). Gjennomsnittet av C
q
verdier av tredoble PCR reaksjoner ble brukt for analyse. Ved behov, C
q
verdier for microRNAs ble normalisert ved å trekke verdien for den lille nukleolært
RNU6B
RNA.
Gene uttrykk analyse ved hjelp BeadChip ™ -teknologi
Total RNA, isolert fra A549 /VEC og A549 /146b celler i to eksperimenter for biologisk dobbeltarbeid, ble gitt til den delte genuttrykk innretningen av RPCI for analyser. Absorbans spektrofotometri og elektroforese på Nanodrop ™ 1000 og Bioanalyzer ™ 2100 (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA), henholdsvis, viste at RNA forberedelsene hadde 260 nm /280 nm absorbans forholdstall på 1,9-2,0 rekkevidde, 260 nm /230 nm absorbans forholdstall 1,8 og RNA integritet tall 7. Illumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion®, Autin, TX, USA) ble benyttet for å omdanne 500 ng av RNA til cDNA, som deretter ble transkribert in vitro for å generere biotin-merket RNA. Hybridiserings reagenser ble blandet med 750 ng av merket RNA, og blandingen ble hybridisert over natten ved 58 ° C for å HumanRef-8 v3.0 Expression BeadChips ™ matrise (Illumina®, San Diego, CA) som har følere for å oppdage 24,526 annoterte humane transkripter . Etter vask og farging med Cy3 dye-merket streptavidin, BeadChips ™ ble fotografert med BeadArray Reader (Illumina®). Data ble kjøpt med GenomeStudio ™ (versjon 2010.1, Illumina®), og deretter bearbeidet for background-korreksjon, varians-stabiliserende transformasjon, og deretter robuste rier-normalisering mellom arrays som bruker lumi Bioconductor pakken (versjon 1.14) for R språk (versjon 2.11.1) med standardinnstillinger. Rå og bearbeidet data finnes i NCBI Gene Expression Omnibus depotet med tiltredelse nummer GSE29496. God kvalitet på dataene ble bekreftet ved å undersøke ulike aspekter av data som anbefalt av Illumina®. Multi-testing med en paret t-test med moder t statistikk og Benjamini-Hochberg korreksjon for falsk funnraten ble gjort på data behandles ved hjelp av limma Bioconductor pakken (versjon 3.4.5).
Annet
en EOS 450D digitalt kamera (Canon®, Lake Success, New York) og en Axio ™ Observer mikroskop (Zeiss®, Maple Grove, MN) ble brukt for mikrofotografering. Med mindre annet er angitt, ble kjemikalier anskaffet fra Sigma® eller Thermo Fisher Scientific®. RNA sekundærstruktur prediksjon ved hjelp mfold [23] med standardinnstillingene ble utført online på https://mfold.rna.albany.edu. Statistiske analyser og graf plotting var ferdig med Prism ™ (versjon 5.0c, GraphPad Software®, La Jolla, CA). Alle t-tester var to-tailed, antatt like avvik, og brukes 0,05 som cut-off for å avgjøre betydning.
Resultater
Generering av A549 cellelinjene overekspresjon
MIR-146b
microRNAs
for å studere effekten av
MIR-146b
overekspresjon i lungekreftceller, menneskelig A549 lunge adenokarcinomceller ble konstruert for å overuttrykker human
pre-MIR-146b
forløper mikroRNA. Den pLemiR ™ lentiviral vektor som bærer et gen for puromycin resistens, ble modifisert ved innsetting av DNA for den pre-mikroRNA sekvens i den 3′-ikke-translaterte området av genet som koder for den TurboRFP røde fluorescerende protein og drives av de konstitutivt aktive cytomegalovirus (CMV ) promoter. Etter transduksjon med lentiviruses, og puromycin utvalg, en stabil populasjon av celler kalt A549 /146b ble generert. Den A549 /vec cellelinjen ble generert ved hjelp pLemiR ™ vektor uten en innsats. A549 /v146b celler ble generert ved hjelp av vektor med en variant menneskelig
pre-MIR-146b
sekvens. I varianten, de nukleinsyresegmenter svarer til
MIR-146b-5p Hotell og –
3p
mikroRNA sekvenser ble byttet (figur 1A) med ideen om at variasjonen kan resultere i en relativt høyere uttrykk av
MIR-146b-3p
, siden blant menneske microRNAs, de som genereres fra 5p armene på pre-microRNAs tendens til å bli uttrykt mer enn de fra 3p armene [11]. Den mfold [23] RNA-folding algoritme spår at som naturlig
pre-MIR-146b
, varianten forhånds mikroRNA har også en stilk-løkke form (figur 1A), med en ΔG av -31,9 kcal /mol som er 5,2 kcal /mol mer enn den naturlige pre-mikroRNA.
A
. Mest stabile mfold-spådde sekundære strukturer av menneskelige
pre-MIR-146b
og en variant forhånds mikroRNA undersøkt i denne studien. De 5 «og 3» endene, nucleotide posisjoner, og segmenter som tilsvarer modne
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
sekvenser (
5p Hotell og
3p
) er indikert.
B
. Histogrammer for rød fluorescens kvantifisert ved flowcytometri av A549 og A549-avledet cellelinjer stabilt transduced med lentiviruses bærende konstruksjoner konstruert for uttrykk for menneskelig
pre-MIR-146b product: (
A549 /146b
) , eller varianten vist i
A product: (
A549 /v146b
), eller ingen av delene (
A549 /vec
).
C
. Sammenligning av
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
nivåer (
5p Hotell og
3p
), normalisert til den av
RNU6B
liten nukleolært RNA, i A549-avledede cellelinjer som vurderes ved hjelp av revers transkripsjon, etterfulgt av PCR (RT-PCR). Midler og deres standard feil for målinger fra tre ulike eksperimenter er vist.
D
. Standardkurver som viser forholdet mellom kvantifisering syklus (
C
q
) verdi og konsentrasjon av RNA i
MIR-146b-5p Hotell og
-3p plakater (
5p Hotell og
3p
henholdsvis RT-PCR-analyser av syntetisk
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
RNA,). En logg
2 skala som brukes for X-aksen.
E
. Semi-kvantifisering av de relative mengdene av
MIR-146b-5p Kjøpe og
-3p
i RNA av 293T, BEAS-2B, MCF-7, og ML-2 (betyr, enkelt eksperimenter ), og de tre A549-avledet cellelinjer, (midler og deres standardfeil for målinger fra tre ulike eksperimenter) er vist.
Sterk og stabil uttrykk for den pre-mikroRNA bærende TurboRFP genet i 90% av celler av hver cellelinje ble bekreftet ved fluorescens strømningscytometri (figur 1B og data ikke vist). Flere mobil RNA preparater ble analysert for
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
modne microRNAs ved RT-PCR. Overekspresjon av
MIR-146B
microRNAs ble observert i både A549 /146b og A549 /v146b cellelinjer (figur 1C). Sammenlignet med A549 /vec,
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
uttrykk, normalisert til at av de 45 base lang, housekeeping liten nukleolært RNA genet
RNU6B
, var henholdsvis et gjennomsnitt på 4.9- og 6.6 ganger høyere hos A549 /146b celler. I A549 /v146b, de var henholdsvis et gjennomsnitt på 2.6- og 6.5 ganger høyere, noe som tyder varianten forhånds mikroRNA uttrykt av det ble behandlet i moden
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
microRNAs. For mer nøyaktig kvantifisere effekten av variasjonen av forholdet mellom mengder av
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
i cellene, syntetisk
MIR-146b-5p
og
-3p
RNA ble anvendt for å generere standardkurver for å undersøke forholdet mellom RT-PCR-målinger (C
q
verdier) og RNA mengder. Selv om analyser for både microRNAs hatt lignende RT-PCR kinetikk, med hver log
2 enhet endring i RNA-inngang produsere ca en enhet endring i C
q
verdi over en fortynning området 12 log
2 enheter, følsomheten til
MIR-146b-5p
analysen var høyere med ca 3.6 C
q
heter (figur 1D). Derfor
MIR-146b-3p
C
q
verdier ble justert ved å trekke 3,6 for å sammenligne mengder av
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
RNA. I alle de tre A549-avledet cellelinjer,
MIR-146b-5p
mikroRNA var til stede på et beløp som var i ferd med 4-6 ganger høyere enn for
-3p
mikroRNA (figur 1E). Variasjonen i pre-mikroRNA sekvensen ble funnet å ha noen signifikant effekt på forholdet mellom mengder av
MIR-146b-5p Hotell og
-3p
i A549 /v146b celler i forhold til A549 /146b celler. Undersøkelse av RNA fra menneske 293T embryonale nyre, BEAS-2B normal bronkial, MCF-7 brystkreft, og ML-2 akutt myelogen leukemi celler, antydet at det i disse cellelinjer også,
MIR-146b-5p
er til stede ved en 4-22 ganger høyere molart overskudd enn
-3
p (figur 1E). Dermed blir modne mikroRNA generert fra 5p tråd av
pre-MIR-146b
synes å være mye mer utbredt enn en fra 3p tråd, som foreslått av andre studier [8], [9]. Uttrykk av MIR-146b-5p 293T, BEAS-2B, MCF-7 og ML-2 celler var 23.8-, 0.7-, 0.6- og 2.8-ganger høyere enn i A549 /vec.
Overuttrykte
MIR-146b
microRNAs har bare en mindre effekt på A549 cellefenotyp
A549-avledet cellelinjer ble undersøkt for å finne en effekt av
MIR-146b
overekspresjon på A549 celler. Celleviabilitet målinger over tid antydet at, sammenlignet med A549-vec, både A549 /146b og A549 /v146b proliferated på samme måte i cellekultur (figur 2A). Økt
MIR-146b
nivåer synes ikke å påvirke følsomheten av cellene til enten cisplatin eller doksorubicin ved legemiddelkonsentrasjoner varierende fra 0,5 til 2 ug /ml, selv om medikamentene var klart cytotoksisk for cellene ved høyeste konsentrasjonen (figur 2B). Begge er anti-kreft legemidler som benyttes for behandling av NSCLC. Men med overekspresjon av mikroRNA, både A549 /146b og A549 /v146b celler dannes bare 80% og 65%, henholdsvis, av så mange kolonier som A549 /vec gjorde fra individuelle celler i vedheftende cellekultur på den plastoverflate av vev kulturplater (t test P-verdier på 0,04 og mindre enn 0,01, henholdsvis).
B
.
B
.
C
.
B
.
B
.
