Abstract
Kreftceller i ascites er en viktig kilde for tilbakefall av sykdommen i eggstokkreft pasienter. I et forsøk på å identifisere og profilere populasjon av ascites celler hentet fra eggstokkene kreftpasienter, ble en ny metode utviklet for å skille tilhenger (AD) og ikke-tilhenger (NAD) celler i kultur. Tjuefem pasienter ble rekruttert til studien; 11 chemonaive (CN) og 14 kjemoresistent (CR). AD-celler fra både CN og CR pasienter oppviste mesenchymale morfologi med et antigen-profil av stamceller og fibroblaster. Omvendt, NAD cellene hadde en epitelial morfologi med økt uttrykk av kreft antigen 125 (ca125), epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM) og cytokeratin 7. NAD celler utviklet infiltrere svulster og ascites innen 12-14 uker etter intraperitoneal (ip) injeksjoner i nude mus, mens AD cellene forble ikke-tumorigent i opptil 20 uker. Etterfølgende sammenligning av selektive epitel, mesenchymale og kreft stamcelle (CSC) markører mellom AD og NAD bestander av CN og CR-pasienter viste en forbedret trend i mRNA uttrykk for E-cadherin, EpCAM, STAT3 og Oct4 i NAD befolkningen i CR pasienter. En lignende trend med forbedret mRNA-ekspresjon av CD44, MMP9 og Oct4 ble observert i AD populasjon av CR pasienter. Derfor, ved bruk av en ny rensemetode demonstrerer vi for første gang et tydelig separering av ascitesceller inn i epitel-tumorigen og mesenkymale ikke-tumorigene populasjoner. Vi viser også at celler fra ascites av CR pasienter er overveiende epitelial og viser en utvikling i retning av øket mRNA-ekspresjon av gener assosiert med cscs, sammenlignet med celler isolert fra ascites av CN pasienter. Som kreftceller i ascites av ovarian kreftpasienter spille en dominerende rolle i tilbakefall av sykdommen, er en grundig forståelse av biologi av ascites mikromiljøet fra CR og CN pasienter avgjørende for effektive terapeutiske intervensjoner
Citation. Latifi A, Luwor RB, Bilandzic M, Nazaretian S, Stenvers K, Pyman J et al. (2012) Isolering og karakterisering av tumorceller fra Ascites for eggstokkreft pasienter: Molekylær Phenotype av kjemoresistent ovarietumorer. PLoS ONE 7 (10): e46858. doi: 10,1371 /journal.pone.0046858
Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 11 juli 2012; Godkjent: 10 september 2012; Publisert: 08.10.2012
Copyright: © Latifi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette var støttet av kvinner Cancer Foundation, National Health and Medical Research Council of Australia (JKF, regkey # 441101), National Breast Cancer Foundation (EWT; empati Breast Cancer Network, Australia) og den viktorianske regjeringens Operational Infrastructure Support Program (Australia). Finansiører hadde ingen rolle i studien desugn, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 2009, den amerikanske foreningen for Cancer Research rapporterte eggstokkreft som gynekologisk kreft med høyest sak til dødelighet ratio [1]. Denne høye dødeligheten resultatene fra diagnosen på et avansert stadium når kreften har spredd seg inn i bukhulen og spredning til vitale organer. Eggstokkreft metastasering skjer enten direkte fra kortikale inklusjons cyster på eggstokkene eller fra fimbrial enden av egglederen [2], og sprer seg ved direkte forlengelse til tilstøtende organer (for eksempel extraovarian bekken organer, tykktarm, blære, lever, etc) , eller ved binding av ekspandert eggstokkreft celler som overlever som cellulære aggregater eller kuler. Sfæroidene blir båret av peritoneal væske tumor (ascites) til omgivende organer i bukhulen. Omfattende seeding av disse kulene på livmoren, sigmoideum og omentum er ofte oppstått i avansert stadium og tilbakevendende sykdom [3].
Aktuelle behandlingsstrategier for avansert stadium eggstokkreft pasienter resultere i første remisjon i opptil 80% av pasientene [4]. Men etter en kort remisjon periode (vanligvis 6-22 måneder) tilbakefall forekommer i nesten alle pasienter [4]. Dette skyldes i stor grad muligheten for kreftceller å unngå kjemoterapirelatert cytotoksisitet gjennom ervervet chemoresistance. Nylig har chemoresistance også vært forbundet med oppkjøpet av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) i kreftceller [5] – [6]. Klassisk, muliggjør EMT stasjonære epitelceller blir bevegelig og invasiv for å spre og recolonize inn i omgivende vev [7]. Disse trekkene ved emt har vist seg å korrelere med en CSC-lignende fenotype [8] – [9], bekreftet nylig i kliniske tilfeller av mesenchymale og tumor initiering «fenotypene av de gjenværende tumorceller hos brystkreftpasienter som overlever konvensjonell terapi [ ,,,0],10]. Fenotypen til CSC har vist seg å være dynamisk regulert av svulsten mikromiljøet [11], og hovedfunksjonen som kreves for mikro- og makro-metastatisk kolonisering innebærer ikke bare EMT men også mesenchymale til epitelial overgang (MET) [12] – [13 ]. Kontinuum av EMT og MET har blitt beskrevet som epithelial mesenchymale plastisitet (EMP) [11]. En slik metastatisk kolonisering definerer evnen til EMP transform disseminerte tumorceller til å fornye seg selv og differensiere de definerende cellulære egenskaper av cscs [14].
Selv om nærværet av ascites har vært assosiert med dårlig prognose, opprinnelsen og fenotype av kreftceller i ascites, og sin tilknytning til chemoresistance og tilbakefall er dårlig forstått. Mikroskopisk undersøkelse av ascites har tidligere avdekket en kompleks heterogent bilde som består av enkeltceller og kuler [15]. Ikke-cancerceller innenfor ascites omfatter inflammatoriske celler, kreft-assosiert fibroblaster, umodne myeloide celler og aktiverte mesothelial celler, som alle påvirker tumorcelle oppførsel og respons på kjemoterapi [16]. Også bidra til heterogeniteten av ascites blir en populasjon av cscs som kan motstå kjemoterapi og gi opphav til et hierarki av prolifererende tumorceller med progressiv differensiering potensial [17], [18]. Disse cscs, når renset ved å sortere og xenopodet inn i nakne mus, har vist seg å generere en betydelig større tumormasser sammenlignet med usorterte tumorceller [19], som tyder på større karsinogent potensial av cscs.
(A) NAD sfæroidene og (B) AD-celler ble sådd på lave festeplater umiddelbart etter innsamling. Morfologiske trekk (C) NAD spheroid og (D) AD celler på vev kultur plast etter 24 timer etter seeding. Bilder ble vurdert ved fasekontrastmikroskopi. Forstørrelse var 100 ×, skala bar = 50 mikrometer. Bildene er representative for (n = 25) prøver. (E) [
3H] -tymidin-opptak i AD celler og i celler fra dispergerte kuler ble utført som beskrevet i Metoder og materialer. Diagrammet er en representasjon av en ascites prøve utført in triplo. (F) Effekt av cisplatin på spredning {[
3H] -tymidin opptak} av NAD og AD celler hentet fra ascites av eggstokkreft pasienter. Diagrammet er en representasjon av tre uavhengige eksperimenter, utført på tre uavhengige NAD og AD prøver i triplikat. Signifikant forskjellig mellom AD versus NAD celler, ** p. 0,01
Vi hypotese at tilbakefall i eggstokkene kreftpasienter er i stor grad bestemt av i hvilken grad svulsten og tilhørende stromale celler i bukhulen overleve kjemoterapi, og at en sammenlignende studie av mRNA cellene isolert fra ascites av CN versus CR eggstokkkreftpasienter som kan tilveiebringe en viktig manglende kobling for å forstå tilbakevendende sykdom. Det overordnede målet med denne studien var å undersøke differensial mRNA profilen til ascites celler fra CN og CR pasienter for å identifisere de genprodukter som kan bidra til overlevelse og spredning av gjenværende kreftceller etter kjemoterapi. Vi har også sikte på å forstå den metastasering tilbøyelighet av tumorcellene i ascites av eggstokkkreftpasienter. For å oppnå dette, har vi utviklet en ny rensemetode for å isolere distinkte populasjoner av celler fra ascites av eggstokkkreftpasienter. Ved hjelp av denne enkle teknikken ascites celler ble separert i to distinkte populasjoner av celler med veldefinerte epiteliale og mesenkymale fenotyper, henholdsvis. Celler isolert fra ascites CR hadde en mer epitelial fenotype og viste en tendens til forsterket uttrykking av gener assosiert med CSC sammenlignet med celler isolert fra ascites av CN pasienter. Disse resultater antyder at den ascites tumor mikromiljøet kan variere i pasienter før og etter kjemoterapi og videre kan spille en rolle i den tilbakefall av ovarian kreftpasienter etter kjemoterapi.
Rensede celler fra ascites av CN (n = 11 ) og CR (n = 14) kreftpasienter ovarier ble inkubert med enten kontroll IgG eller aktuelle primære antistoffer mot de respektive antigener, etterfulgt av sekundær fykoerytrin-konjugert antistoff. Resultatene er representative for (n = 25) uavhengige utvalg. Den fylte histogrammet i hver figur representerer kontroll IgG, svarte streker indikerer protein uttrykk i respektive celler.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
Monoklonale og polyklonale antistoffer mot CA125, ble fibroblast overflateprotein (FSP) og CD44 erholdt fra Merck Millipore (MA, USA). Monoklonale antistoffer mot cytokeratin 7 (cyt 7) og N-cadherin ble oppnådd fra Zymed Laboratories (San Francisco, USA). Polyklonale antistoffer mot E-cadherin, vimentin og EpCAM ble erholdt fra Cell Signal Technology (Beverly, MA, USA). Polyklonale antistoffer mot CD73, CD105, CD90, og CD34 ble innhentet fra Sapphire Biovitenskap (NSW, Australia).
Renset NAD og AD celler ble evaluert ved immunfluorescens bruker mus monoklonalt antistoff (grønn) som beskrevet i metoder og materialer. Cellulær farging ble visualisert ved hjelp av den sekundære Alexa 488 (grønn) fluorescerende merket antistoff, og kjerner ble påvist ved DAPI (blå) fargingen. Bildene er representative for tre uavhengige utvalg. Forstørrelse var 200 ×; skala bar = 50 mikrometer.
immunfluorescens studie ble utført på renset NAD og AD celler som beskrevet i Figur 3. Bildene er representative for tre uavhengige utvalg. Forstørrelse var 200 ×; skala bar = 50 mikrometer.
Pasienter
Menneske etikk uttalelse.
Ascites ble samlet inn fra pasienter diagnostisert med avansert stadium serøs ovarialcancer, etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke i henhold til protokoller godkjent av human Research and Ethics Committee (HREC # 09/09) av The Royal Women Hospital, Melbourne, Australia.
den histopatologiske diagnose, inkludert kreft karakterer og scenen ble bestemt av uavhengige ansatte patologer som del av den kliniske diagnose (tabell 1). Ascites ble oppnådd fra pasienter under kirurgi med primær carcinoma (CN pasienter). I andre tilfeller ble ascites oppsamlet fra en gruppe pasienter ved tidspunktet for tilbakefall (CR pasienter). Disse pasientene hadde utviklet residiv innen 6-20 måneder etter første linje kjemoterapi. Pasienter i denne gruppen var ikke alle behandles på samme måte som de tidligere hadde fått kombinasjoner av kjemoterapi bestående av paclitaxel, carboplatinum og andre stoffer som doxorubicin, gemcitabin, docetaxel, cyklofosfamid og topotekan etter hvert tilbakevendende episode (tabell 1). Prøvene ble samlet fra pasienter i løpet av behandlingsregime som beskrevet i Tabell 1.
qPCR ble utført på rensede NAD og AD populasjoner som beskrevet i metoder og materialer. Utbytter ble omdannet til femtograms basert på standardkurven for hvert PCR-produkt, og de resulterende mRNA-nivåer ble normalisert til 18S mRNA nivå per prøve. Dataene ble beregnet ut fra resultatene av åtte uavhengige utvalg vurdert i tre eksemplarer. Signifikant forskjellig i AD versus NAD celler (p 0,05) og ** (p 0,01).
Utarbeidelse av celler fra Ascites for eggstokkreft Pasienter
Volumet av ascites varierte mellom pasienter. CN pasienter hadde lavere ascites volumer (100 ml-2L), sammenlignet med CR pasienter (100 ml-17 L). Imidlertid, for å standardisere forsøksprotokoll bare 500 ml ascites ble brukt til å samle cellene. Forurensende røde blodlegemer i cellepelleten av ascites ble fjernet ved hypoton lysis i sterilt MilliQ H
2O. Hovedtyngden av ascites-celler ble sådd på lave festeplater (Corning Incorporated, New York) i MCDB: DMEM (50:50) vekstmedium supplert med føtalt bovint serum (10%), glutamin (2 mM) og penicillin /streptomycin (2 mM ) (Life Technologies, CA, USA). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. Under disse betingelser, NAD-celler fløt som kuler i mediet, mens AD-celler festet til lave festeplatene. Etter 2-3 dager ble flytende NAD kuler (dispergert ved pipettering) og AD celler screenet for CA125, EpCAM, cyt 7 og FSP av flowcytometri. AD-celler ble opprettholdt i plast vevskulturflasker mens NAD sfæroider ble holdt på lave festeplatene. Celler ble passert ukentlig, og eksperimentene ble utført i løpet av 1-2 passeringer.
(A) En fasekontrastmikroskop bilde av NAD-celler som klebet til plast før fremstilling av cellesuspensjonen for i.p. injeksjon; (B) H og E farging av agarose innleiret pasientprøve før injeksjon; (C) bilde av fast tumor oppnådd fra en mus fjorten uker etter i.p. injeksjon av NAD-celler (5 x 10
6); (D) H og E farging av mus ascites NAD cellene innebygd på agarose; (E) Strømningscytometrisk sammenligning av ekspresjonen av CA125, EpCAM og CD44 mellom pasientens og mus ascitesceller. Resultatene er representative for to uavhengige prøver. Den fylte histogrammet i hver figur representerer kontroll IgG, svarte streker indikerer protein uttrykk i humane celler, brutte linjer indikerer uttrykk av proteinet i mus ascitesceller.
celletall og spredning analysen
AD celler og NAD sfæroider oppsamlet fra 1 ml av ascites ble tillatt å holde seg på vevskulturplater i 24 timer, hvoretter cellene ble trypsinert og telt ved trypanblått Exclusion metode. Antallet AD celler, og celler i NAD kulene ble beregnet og prosentandelen av levedyktige celler i annonsen og NAD sfæroide populasjoner ble evaluert ved å beregne det totale antall celler i både AD og NAD populasjoner av 1 ml av ascites av hvert pasient.
Histologiske bilder av (A) tumor, (B) lever, (C) mage-tarmkanalen og (D) bukspyttkjertel fra en mus injisert ip med NAD celler (5 × 10
6). Pilene på tumor (A) indikerer lommer av tumorceller som er omgitt av bindevev. (B-D) Pilene viser tumorceller invaderer de respektive organer. H og E farging av (E) nyre og (F) eggstokk fra en mus injisert med NAD-celler (5 x 10
6). Pilene viser tumorceller som omgir organene uten invasjon. Forstørrelse var 200 × for alle, bortsett fra eggstokken som hadde forstørrelse på 100 ×, skala bar = 50 mikrometer.
3 [H] -tymidin opptaksanalyse ble utført som beskrevet tidligere [20] . Kort, 1 × 10
5 NAD eller AD-celler ble sådd i tre eksemplarer på 24 brønners plater. Etter 2, 4 og 6 dager, ble 0,5 uCi av [
3H] tymidin tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 16 timer. Cellene ble vasket med PBS, høstet og lysert i 1% Triton og inkorporering av [
3H] tymidin ble målt ved væskescintillasjonstelling (Hidex 300sl, LKB Instruments, Australia).
Prosentvis fordeling av totale celler i NAD og AD bestander av ascites av CN (n = 5) og CR (n = 5) pasienter ble bestemt av trypanblått Utelukkelse analysen. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige prøver vurdert i tre eksemplarer. Signifikant forskjellig i CR versus CN prøver, ** (p 0,01).
For bestemmelse av veksthemmende konsentrasjon (GI50), 1 × 10
5 NAD eller AD Cellene fikk holder seg på 24 brønners plater i 24 timer i tre eksemplarer. Både NAD og AD-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin (0,5 pg /ml-10 ug /ml) i 48 timer før tilsetning av 0,5 uCi av [
3H] tymidin i 16 timer. Nivået av [
3H] tymidin inkorporering ble bestemt som beskrevet ovenfor.
qPCR ble utført som beskrevet i Metoder og materialer på de rensede NAD og AD populasjoner av celler isolert fra ascites av CN (n = 4) og CR (n = 4) ascites prøver. Resultatene uttrykkes som beskrevet i figur 5 i fire uavhengige prøver vurdert i tre eksemplarer.
qPCR ble utført som beskrevet i figur 9 på de rensede NAD og AD populasjoner av celler isolert fra CN og CR ascites prøver. Resultatene uttrykkes som beskrevet i figur 9. Signifikant forskjellig i CR versus CN prøver, * (p 0,05).
Immunofluorescence Analysis
Immunofluorescens-analyse ble utført som beskrevet tidligere [21 ]. Bilder ble tatt ved bruk av Leica TCS SP2 laser, og sett på en HP arbeidsstasjon med Leica Microsystems TCS SP2 programvare.
qPCR ble utført på isolerte NAD og AD celler som beskrevet i Figur 9. Resultatene er uttrykt som beskrevet i figur 9. Betydelig annerledes i CR versus CN prøver, * (p 0,05).
Antigenene har blitt scoret så høyt uttrykk (
+++), moderat uttrykk (
++), lav uttrykk (
+), og ingen uttrykk (
-.)
flowcytometrisystemer Analysis
flowcytometri metoden har blitt beskrevet tidligere [21]. Alle data ble analysert ved hjelp av Cell quest software (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt intensiteten av fluorescens (MIF).
RNA Utvinning og kvantitativ sanntid (q-PCR)
RNA ekstraksjon, cDNA syntese og kvantitativ bestemmelse av mRNA nivåer av ulike gener var utført som tidligere beskrevet [21]. Sense og antisensprimere ble utformet mot publiserte menneskelige sekvenser for E-cadherin, N-cadherin, vimentin, Oct4, MMP2, MMP9, EpCAM og CD44. Gel utvinning av PCR produktene ble utført ved hjelp av QiaEX II agarosegel utvinning Kit (Qiagen Australia), som per produsentens protokoll og kvantifisert ved bruk av ND-1000 Nanodrop spektrofotometer (Nanodrop Technologies Inc Wilmington, DE, USA). Sekvenser og produkter ble verifisert som beskrevet tidligere [22]. Primerpar benyttes inkluderer 5-3 «: E cadherin (Entrez Gene ID 999, godkjent symbol CDH1) fremtids GGCACAGATGGTGTGATTACAG; foreta omvendt GTCCCAGGCGTAGACCAAGAAA; N-cadherin (Entrez Gene ID 1000, godkjent symbol CADH2) fremad AAACAGCAAGCACGGGTTA; foreta omvendt CTTAGGATTGGGGGCAAAAT; vimentin (Entrez Gene ID 7431, godkjent symbol VIM) fremad CCTACAGGAAGCTGCTGGAA; foreta omvendt GGTCATCGTGATGCTGAGAA; MMP2 (Entrez Gene ID 4313, godkjent symbol MMP2) fremad AAGGGGATCCAGGAGCTCTA; foreta omvendt GCTTGTCACGTGGTGTCACT; MMP9 (Entrez Gene ID 4318, godkjent symbol MMP9) fremad TTGACAGCGACAAGAAGTGG; foreta omvendt GCCATTCAC GTCGTCCTTAT; EpCAM (Entrez Gene ID 4072, godkjent symbol EpCAM) fremad CGTCAATGCCAGTGTACTTCAGTT; foreta omvendt TCCAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG; CD44 (Entrez Gene ID 960, godkjent symbol CD44) fremad CCAATGCCTTTGATGGACCA; foreta omvendt TGTGAGTGTCCATCTGATTC; Oct4 Entrez Gene ID 5460, godkjent symbol POU5F1): fremad CTCCTGGAGGGCCAGGAATC; foreta omvendt CCACATCGGCCTGTGTATAT; 18S (Entrez Gene ID 100008588, godkjent symbol RN18S1) fremtids GTAACCCGTTGAACCCCATT; reverse-CCATCCAATCGGTAGTAGCG. MRNA uttrykk for STAT3 ble bestemt ved bruk STAT3 probe (Applied Biosystems, Victoria, Australia). Real time PCR ble utført ved hjelp av Applied Biosystems ABI SYBR mix (Victoria, Australia) med Applied Biosystems ABI 7900 HT Fast real-time machine. Utbytter ble omdannet til fg (femtograms) basert på standardkurven for hvert produkt, og de resulterende mRNA-nivåer ble normalisert til 18S mRNA nivå per prøve. Hvert eksperiment ble utført uavhengig minimum tre ganger.
Mest ovarian cancer pasienter ved diagnose (stadium IIIc /IV) som er tilstede med ascites (CN) som består av fibroblast-lignende stromale celler og en svært få tumorceller. De fleste av disse pasientene (~80%) etter operasjonen og første linje kjemoterapi retur med tilbakevendende kreft assosiert med ascites (CR). I løpet av kjemoterapibehandling og etterfølgende tilbakefall er prosentandelen av stromale celler i ascites gradvis redusert og pasienten med tilbakevendende kreft presenterer med ascites som består for det meste av CA125
+++ /EpCAM
+++ /STAT3
+++ kjemoresistent epitelceller NAD tumorceller. Disse CA125
+++ /EpCAM
+++ /STAT3
+++ rike kreftceller er den endelige kilden til extraovarian peritoneal adhesjon. Disse sammenvoksninger er den ultimate årsaken til pasientens død.
Animal Studies
Animal etikk uttalelse.
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Health and Medical Research Council of Australia. Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Ludwig /Kirurgisk avdeling, Royal Melbourne Hospital og University of Melbourne dyreetikk komité (Prosjekt-006/11), og ble godkjent av Research and Ethics Committee for kongelig kvinner Hospital Melbourne, Australia. Kvinne Balb /c nu /nu mus (alder, 6-8 uker) ble hentet fra Animal Resources Centre, Western Australia. Dyrene ble plassert i en standard patogen-fritt miljø med tilgang til mat og vann.
NAD og AD celler ble isolert fra ascites av tre CR pasienter (tabell 2). 5 × 10
6 celler per gruppe ble injisert intraperitonealt med en 26-gauge nål inn i ti mus (seks med NAD og fire med AD celler). Mus ble inspisert ukentlig og tumorprogresjon ble overvåket basert på generelle helse og kroppsvekt til en forhåndsbestemt endepunkt ble nådd. Endepunktkriterier inkludert tap av kroppsvekt på over 20% av opprinnelige kroppsvekt, anoreksi, generelle mønstre av redusert velvære som redusert bevegelse og apati som følge av manglende interesse i daglige aktiviteter. Mus ble avlivet og organer (som for eksempel lever, mage, lunger, mage-tarm, bukspyttkjertel, uterus, skjelettmuskel, tykktarm, nyre, peritoneum, eggstokker og milt), faste tumorer og ascitesvæske ble oppsamlet for videre undersøkelse. Metastatisk utvikling ble dokumentert av en Royal Women Hospital patologen henhold til histologisk undersøkelse (H E-farging) av organer. Ascites tumorceller fra mus ble opprettholdt på lave festeplater og ble innleiret i 3% agarose (w /v) for H . GraphPad Software Inc., San Diego, California) og Microsoft Excel. Hvis på tvers av prøvesett ble midler vist seg å ha en variasjon ved p 0,05 ved F-test deretter en parametrisk t-test ble utført for uparede ulike variasjoner. Data ble ansett som vesentlig annerledes dersom p. 0,05
Resultater
morfologi av cellene oppsamlet fra Ascites av kreftpasienter
Ascites celler avledet fra både CN (n = 11) og CR pasienter (n = 14) ble undersøkt ved fasekontrastmikroskopi etter utsåing på lave festeplater i 24 timer. To forskjellige populasjoner av celler ble observert: (i) multicellulære enheter (kuler) som fløt som tredimensjonale strukturer i vekstmedium uten feste (NAD) (figur 1A), og (ii) spindel-formede fibroblast-lignende enkeltceller som levd opp til de lave festeplatene (AD) (figur 1 B).
Videre morfologisk vurdering av NAD befolkningen avslørte en rekke tredimensjonale klynger av løst sammenpressede kuler med en sentral lumen (Figur 1a). Det var en betydelig variasjon i morfologi og størrelse av kuler fra forskjellige pasienter, så vel som innenfor ascites fra den samme pasienten. I noen tilfeller, sfæroider var i form av tette kuler med en definert ytre kant, mens andre vist løse aggregater av små celleklynger (figur 1A). Etter 24 timers kultur på vevskultur plast, for de fleste sfæroider vedlagte og en klar forandring fra en tredimensjonal struktur avflatet celleklynger som inneholder flere lag av heftende celler som vokser på toppen av hverandre, ble observert (figur 1C). Omkretsen av sfæroidene viste langstrakte cellene som beveger seg ut av kulene, mens celler mot sentrum var mer avrundet i struktur. Som cellene flyttet bort fra den sentrale kjerne, ble celle-celle-kontakt redusert, noe som resulterer i disaggregering av kulene (figur 1C). Alternativt AD celler festet til plast som langstrakte spindel-lignende celler og vises en fibroblast-lignende morfologi (figur 1D).
Vekst av AD og spheroid-avledet NAD Celler som ett lag kulturer
veksten mønster av både AD og NAD celler ble bestemt i heft monolagkulturer av
3 [H] -tymidin opptaksanalyse. NAD kuler ble spredt ved pipettering og vekstmønster ble sammenlignet med AD celler. AD celler hadde nesten to ganger høyere vekstrespons sammenlignet med celler spredt fra NAD befolkningen (figur 1E).
Cisplatin Følsomhet av NAD og AD Cells
Cellene fra NAD kulene ble spredt ved pipettering og GI50 verdi som følge av cisplatin ble sammenlignet med AD celler isolert fra ascites av eggstokkreft pasienter (n = 3) (figur 1F). Celler i NAD kulene var nesten fire ganger mer resistent overfor cisplatin (n = 3, GI50 = 8,8 ± 0,72 ug /ml) sammenlignet med AD-celler (n = 3, GI50 = 2,4 ± 0,28 ug /ml) (figur 1 F ).
Vurdering av celleoverflatemarkører ved flowcytometri
Cell overflaten uttrykk for FSP, EpCAM, CA125, CD44 og cyt 7 ble bestemt i AD og NAD celler (dispergert ved trypsinering) ved flow cytometri. Et høyt nivå av uttrykk for EpCAM, CA125 og cyt 7 ble observert i cellene spredt fra NAD befolkningen, mens lav /ingen uttrykk av FSP ble oppdaget, og et relativt lavt nivå av uttrykk for CD44 var tydelig i NAD kuler (figur 2 ). På den annen side, AD-celler var positive for FSP og CD44, med lav /ingen påvisbar ekspresjon av CA125 og cytokeratin 7 (figur 2). Lave nivåer av av EpCAM ekspresjon ble påvist i AD-celler. Dette mønsteret av celleoverflaten markør uttrykk var konsekvent i alle ascites prøver (n = 25). Ingen uttrykk for CD34, CD31 og CD45 ble observert i enten NAD eller AD populasjoner av flowcytometri.
Analyse av CA125, EpCAM, CD44 og Mesenchymale Stem Cell Markers av immunfluorescens
Vi neste analysert uttrykk og lokalisering av CA125, EpCAM, CD44 og mesenchymale stamcellemarkører i ascites prøver av immunfluorescens. I samsvar med den flowcytometri resultater, CA125 ble uoppdaget i AD befolkningen, mens cellene i NAD kulene viste sterk tredimensjonal diffus ekspresjon av CA125 som var fremtredende i de perifere membraner i noen celler (figur 3). Svært få EpCAM-positive celler var tilstede i AD populasjonen (figur 3). I motsetning til dette ble tett perifer membranfarging for EpCAM observert i nesten alle NAD sfæroider. Diffuse cytoplasmatisk farge var til stede i noen sfæroider, men fargingen var mye sterkere på cellene langs omkretsen av kulene (figur 3). På den annen side, ble ekspresjonen av CD44 begrenset til periferien av NAD sfæroidene og ble funnet i celler som var i bevegelse ut av sfæroider. En sterk farging av CD44 var tydelig på membranen på nesten alle AD celler (figur 3).
Som stromale fibroblaster og mesenchymale stamceller (MSC) har vist seg å dele felles egenskaper [23], vi vurderte uttrykk for allment kjente MSC markører (CD90, CD73 og CD105) i både NAD og AD bestander av ascites prøvene (figur 4). Spredt diffus farging av FSP var tydelig i AD celler (figur 4). Noen FSP-positive celler ble observert i NAD sfæroidene, og disse var de cellene som beveger seg ut av sfæroidene. Sterkt uttrykk av CD105 og CD90 var til stede i AD celler. Ekspresjonen av disse proteiner ble detektert i løpet av cytoplasma og ved plasmamembranen til cellene. Svak ekspresjon av CD73 var tilstede i AD-celler. På den annen side ble det lav /ikke ekspresjon av CD90 og CD73 observert i NAD sfæroider. Men CD105 flekker var tydelig i svært få spredte celler som beveger seg ut av kulene (figur 4).
kvantitativ vurdering av Selektive Representative Markers på mRNA nivå
For å vurdere kvantitative forskjeller i den videre uttrykk for epitel og mesenchymale markører av NAD og AD populasjoner, vi sammenlignet de mRNA uttrykk nivåer av noen av markører ved q-PCR. Celler i NAD kulene viste en signifikant høyere uttrykk nivå av E-cadherin og EpCAM forhold til AD celler (p 0,01) (figur 5). På den annen side, AD-celler viste et signifikant høyt nivå av mRNA-ekspresjon vimentin og MMP9 sammenlignet med celler i løpet av NAD sfæroidene (p 0,01, s 0,05) (figur 5). Det betyr uttrykket for N-cadherin, CD44 og MMP2 dukket høyere med 2,5, 7 og 15 ganger i henholdsvis AD befolkningen, men ingen betydning ble observert (p 0,2, p 0,06, p 0,17). Uttrykket av STAT3 og Oct4 var betydelig høyere i NAD forhold til AD befolkningen (p 0,05). (Figur 5)
Vurdering av Svulst potensialet i NAD og AD Bestander av in vivo Mouse Model
Tumor xenograft eksperimenter ble utført for å bestemme karsinogent potensial av NAD og AD populasjoner isolert fra ascites av tre CR pasienter etter ip inokulering av 5 × 10
6 NAD eller AD celler per mus. Fem av de seks mus injisert med NAD celler (som en cellesuspensjon) (figur 6a) utviklet ascites med solide tumorer ( 0,5 cm
3) (n = 3) (figur 6C) eller små lesjoner (n = 2) i peritoneum. Det ble observert en svulst latenstid på tolv til fjorten uker etter transplantasjon. Svulster som veier 0,8 ± 0,2 g og ascites (~0.5 ml) ble observert i alle fem mus som utviklet svulster (figur 6C). I motsetning til dette ble ingen tumorer observert hos mus (n = 4) injisert med det samme antall AD-celler og med tyve uker etter i.p.
