Abstract
EML4-ALK fusjonsgenet er nylig blitt identifisert i en liten undergruppe av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) hos pasienter som responderer positivt på ALK-hemmere. Egenskapene til det EML4-ALK-fusjonsgenet i kinesiske pasienter med NSCLC er dårlig forstått. Her rapporterer vi på utbredelsen av EML4-ALK, EGFR status og KRAS-mutasjoner i 208 kinesiske pasienter med NSCLC. EGFR mutasjoner ble funnet i 24,5% (51/208) av pasientene. I samsvar med tidligere rapporter, ble disse mutasjonene identifisert ved høye frekvenser hos kvinner (47,5% vs 15,0% hos menn;
P
0,05); aldri-røykere (42,3% vs 13,9% hos røykere;
P
0,05), og adenokarsinom pasienter (44,2% vs 8,0% hos ikke-adenokarsinom pasienter;
P
0,05) . Det var bare 2,88% (6/208) av pasientene med KRAS mutasjoner i vår studie gruppe. Vi identifiserte 7 pasienter som næret den EML4-ALK fusjonsgenet (3,37%, 7/208), inkludert 4 tilfeller med variant 3 (57,1%), to med variant 1, og en med variant 2. Alle positive saker samsvarer med kvinnelige pasienter (11,5%, 7/61). Seks av de positive tilfellene var ikke-røykere (7.69%, 6/78). Forekomsten av EML4-ALK trans hos kvinner, røykfrie adenokarsinom pasienter var så høy som 15,2% (5/33). Ingen EGFR /KRAS-mutasjoner ble oppdaget blant EML4-ALK-positive pasienter. Patologisk analyse viste ingen forskjell mellom fast signet-ring celle mønster (4/7) og mucinous cribriform mønster (3/7) i ALK-positive pasienter. Farging viste intratumor heterogenitet av ALK omorganisering i grunnskolen karsinomer og 50% (3/6) av metastatiske svulster med ALK-negativ farging. Meta-analysen viste at EML4-ALK trans skjedde i 4,84% (125/2580) av uselekterte pasienter med NSCLC, og ble også dominerende i røykfrie pasienter med adenokarsinom. Til sammen EML4-ALK trans var sjeldne i hele NSCLC pasientpopulasjonen, men var hyppig i NSCLC undergruppe av kvinner, ikke-røyker, adenokarsinom pasienter. Det var intratumor heterogenitet av ALK omorganisering i grunnskolen karsinomer og ved metastaser
Citation. Li Y, Li Y, Yang T, Wei S, Wang J, Wang M, et al. (2013) Klinisk Betydningen av EML4-ALK Fusion Gene og foreningen med EGFR og KRAS-mutasjoner i 208 kinesiske pasienter med ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (1): e52093. doi: 10,1371 /journal.pone.0052093
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 10 april 2012; Godkjent: 14 november 2012; Publisert: 14 januar 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen støttes delvis med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81172233), Science and Technology Support Key Program for Tianjin (09ZCZDSF04000, 09ZCZDSF03800), Tianjin Natural Science Foundation (12JCZDJC24400), prosjektet av Kunnskapsdepartementet for New Century gode talenter (NCET-10-0956), og Wujieping Foundation (320.6720.10007, 320.6740.10008, 3.206.720,10008). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall, hvor det er forbundet med en 5 års verdensomspennende overlevelse på mindre enn 15% [1], [2]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av lungekrefttilfellene [3]. Cisplatin-basert kjemoterapi har produsert en betydelig overlevelse fordel fremfor beste støttebehandling hos pasienter med avansert NSCLC; derimot, er resultatene for NSCLC pasienter fortsatt ikke tilfredsstillende [3], [4]. Tradisjonelle kjemoterapi og radioterapi er forbundet med betydelige bivirkninger hos alle pasienter med NSCLC, på grunn av deres mangel på spesifisitet. Utvikling og anvendelse av legemidler som er rettet mot spesifikke molekyler uttrykt på lungekreftceller har fått økt oppmerksomhet, og bemerkelsesverdige suksesser har blitt rapportert i flere NSCLC pasientstudiegrupper [5], [6], [7], som en undergruppe av pasienter med NSCLC testet positivt for aktivering mutasjoner i den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) genet. Disse kreft vise overfølsomhet for EGFR tyrosinkinasehemmere (TKI), for eksempel gefitinib eller erlotinib, støtter bruk av disse stoffene for effektiv behandling av NSCLC [5], [8]. Blant pasientene som bærer EGFR aktiverende mutasjon, som tidligere ubehandlet, fremskreden sykdom, er gefitinib vist seg å være overlegne i forhold til cytotoksisk kjemoterapi [4], [9], [10]. Nytten av EGFR TKI i disse pasientene fremhever viktigheten av å identifisere genotype-spesifikke pasienter i å lede valget av målrettede terapier.
Nylig er et fusjonsprotein mellom det N-terminale del av echinoderm mikrotubuli-assosiert protein -lignende 4 (EML4) protein og den intracellulære signaleringsdelen av anaplastisk lymfom kinase (ALK) tyrosinkinase-reseptoren har blitt identifisert i en liten undergruppe av NSCLC [11]. Pasienter som hadde den EML4-ALK-fusjonsproteinet vise unike klinisk patologiske og fysiologiske egenskaper [12], [13]. Flere rapporter har identifisert denne fusjonsprotein hovedsakelig unge kvinnelige ikke-røykere med adenokarsinom [11], [14], mens andre rapporter har beskrevet dette fusjonsprotein i ulike populasjoner [15], [16]. Den lille totale antall positive tilfeller identifisert per studien kan forklare disse avvikene. Karakteristikken av EML4-ALK i lunge kreft er fortsatt ikke klarlagt, særlig i kinesiske pasienter med NSCLC. Er utbredelsen av EML4-ALK mutasjoner, akkurat som EGFR mutasjon, knyttet til en bestemt etnisitet?
EGFR /KRAS mutasjoner og EML4-ALK trans kalles driver mutasjoner fordi de er ansvarlig for både initiering og vedlikehold av lungekreft. Adenokarsinomer utviser tydelige genomisk endringer som kan klassifiseres i klinisk relevante molekylære undergrupper i henhold til KRAS, EGFR, og EML4-ALK status. Spesifikke mutasjoner i disse genene indusere differensialkreft overfølsomhet for målrettede terapeutiske legemidler. For eksempel tumorer som bærer dominerende somatiske mutasjoner i EGFR eksoner er vanligvis følsomme for EGFR-TKI. Svulster huser somatiske mutasjoner i KRAS, som koder for et GTPase nedstrøms EGFR, vise større motstand mot disse stoffene. Derfor er det nødvendig å forstå sammenhengene mellom EML4-ALK og EGFR /KRAS-mutasjoner i lungekreftpasienter.
Her rapporterer vi på de store kliniske og patologiske kjennetegn ved denne fusjonen i 208 kinesiske NSCLC og vi korrelere det med tilstedeværelse av EGFR og KRAS mutasjoner i de samme pasientene. Vi presenterer også en meta-analyse av EML4-ALK fusjonsgenet.
Resultater
Kliniske kjennetegn ved EML4-ALK fusjonsgenet i kinesisk NSCLC pasienter
I 2007 Martelli et al. evaluert pasienter som uttrykte EML4-ALK transkripsjoner, ved hjelp av fluorescens
in situ
hybridisering, og fant at bare ca 1,8% av cellene næret den EML4-ALK-genet fusjon [17]. Disse forskerne var i stand til å detektere EML4-ALK protein ved immunhistokjemi, Western blotting, eller immunoprecipitation. RT-PCR er den mest følsomme og mest populære påvisningsmetode for tiden er tilgjengelig. Vi utførte nestet RT-PCR for å amplifisere fusjon regionen av translokasjon. Vi vurderte følsomheten av vår nestet RT-PCR-protokollen ved å forsterke seriefortynnet cDNA fra H2228 celler. Den nestede RT-PCR detektert EML4-ALK-fusjonsgenet ved en lavere grense på 7,8 x 10
-4 ng inngangs cDNA (figur 1A).
Nested RT-PCR ble utført ved anvendelse av seriefortynnet cDNA fra H2228 celler. Så lite som 7,8 x 10
-4 ng cDNA kunne brukes for konsekvent påvisning av varianten 3-fusjons transkripsjon med denne protokoll (øvre panel). Representative gel elektroforese resultater for nestet RT-PCR (nedre panel). Lane markør: 200 bp stige; positiv kontroll: H2228; negativ kontroll: A549. Andre baner tilsvarer prøvene viser den EML4-ALK trans, merket med saksnummer.
Det var 208 NSCLC pasienter i vår studie og deres kliniske og patologiske egenskaper er beskrevet i tabell 1. Resultatene av nestet RT-PCR-amplifikasjoner av de EML4-ALK fusjonsgenet er vist i figur 1B. Vi identifiserte 7 pasienter som næret den EML4-ALK-fusjonsgenet (3,37%, 7/208), som ble bekreftet ved DNA-sekvensering (figur 2). Av disse 7 pasientene, 2 tilfeller vises EML4-ALK variant 1 (28,6%, 2/7), en sak utstilt variant 2 (14.3%, 1/7) og 4 tilfeller gjennomført variant 3 (57,1%, 4/7) . Derfor kan variant 3 være den dominerende varianten blant kinesiske NSCLC pasienter med mer enn halvparten av de EML4-ALK trans stiller fusjoner mellom exon 6 av EML4 og ekson 20 av ALK.
(A) variant 1, (B ) variant 2, (C) variant 3.
De kliniske kjennetegn ved disse 7 pasientene er beskrevet i Tabell 2. Seks tilfeller involvert adenokarsinom og ett tilfelle involvert adenosquamous karsinom. Tester for andre typer kreft var negative (0/106). Som vist i tabell 3, utbredelsen av den EML4-ALK-fusjonsgenet var 6,32% (6/95) blant adenokarsinom tilfeller og 14,2% (1/7) blant adenosquamous karsinom tilfeller. Alle positive saker samsvarer med kvinnelige pasienter, noe som resulterer i en positiv rate blant kvinner på 11,5% (7/61;
p
= 0,000). Seks av de positive tilfellene var ikke-røykere (7.69%, 6/78). Frekvensen av EML4-ALK trans blant kvinnelige ikke-røykere adenokarsinom pasienter var 15,2% (5/33). Median alder for EML4-ALK-positive tilfeller (55 ± 10,38) var mye lavere enn for EML4-ALK-negative pasienter (61,78 ± 8,71;
p
= 0,045). Ingen signifikante assosiasjoner ble påvist mellom genet fusjon og scene eller metastaserende status.
Histologisk analyse av EML4-ALK-positive lungekreft
Som vist i figur 3, alle 7 av de ALK-positive tumorer i det minste en skjult adenokarsinom komponent. Bare ett tilfelle (Eksempel 4) hadde fokal squamous differensiering (sto for 20% av tumorvolumet). Den adenokarsinom komponenten viste et variert histomorphology, og den dominerende vekstmønster var papillær (eller micropapillary) i en sak (sak 1), acinar i 3 tilfeller (Cases 2, 6 og 7), og faste i 3 tilfeller (Cases 3, 4 og 5). Men de fleste tilfeller (5/7) faktisk hadde en blandet adenokarsinom komponent inkludert papillær eller micropapillary, signet-ring celler, og slimete celler. På bakgrunn av tidligere rapportert patologisk mønster for ALK-positive karsinomer [18], 57,14% (4/7, Skaper 1, 3, 4 og 5) av ALK-positive tilfeller viste solid signet-ring celle mønster og 42,86% (3/7, Cases 2, 6 og 7) av tilfellene viste mucinous cribriform mønster. En psammoma kropp ble også identifisert i sak 6, som var en blandet adenokarsinom med signet-ring celler, slimete celler og micropapillary komponent. Interessant, fant vi en rent invasiv mucinous BAC (bronchioloalveolar karsinom) i sak 7, der slimceller viste en lepidic vekstmønster. Vev fra metastatiske lymfeknuter var tilgjengelige i seks av de ALK-positive tilfeller. Papillær eller micropapillary, signet-ring celler med ekstracellulære slim, og cribriform struktur ble identifisert i 2 (Cases 1 og 2), 1 (sak 6) og 3 (Cases 3, 4 og 5) tilfeller, henholdsvis. Fem tilfeller viste solid signet-ring celle mønster, og en sak (sak 6) viste mucinous cribriform mønster.
Den primære svulster Cases 1, 3, 4 og 5 viste solid signet-ring celle mønster sammensatt av god vekst med papillær (eller micropapillary) eller et signet-ring cellekomponent, og andre primære områder av Cases 2, 6 og 7 viste mucinous cribriform mønster som består av tallrike ekstracellulære slim og cribriform strukturer. I lymfeknutemetastaser, ble solid signet-ring celle mønster identifisert i Cases 1-5, og mucinous cribriform mønsteret ble bare sett i sak 6.
I tillegg er en 3-lags karaktersystem av lunge adenokarsinomer basert på histologisk mønsteret ble rapportert av Sica et al [19], inkludert grade i: et mønster med lav karakter (BAC), grade II. mønster med middels grad (acinar og papillær); og Grade III: mønster med høy klasse (fast og micropapillary). Ved hjelp av dette karaktersystemet, bare Sak 7 tilhørte klasse I, og resten tilhørte Grade III siden de fleste av dem ble blandet adenokarsinomer med lymfeknutemetastaser.
Deretter utførte vi ALK immunhistokjemi flekker (ALK-IHC ) av primære og metastatiske svulster i alle ALK-positive tilfeller. Som vist i figur 4, var ALK-IHC positive i alle primære tumorer, og ALK-protein-ekspresjon ble lokalisert i cytoplasma. Videre er ALK-positiv farging ble ikke sett i hver primærtumorcelle. Det var meget tydelig i Eksempel 4 med den adenosquamous karsinom, hvor ALK immunofarging skjedde i adenokarsinom komponent, men ikke i plateepitel carcinom komponenten. Dette resultat indikerte et fenomen av intratumor heterogenitet av ALK omleiring i de primære tumorsteder. Videre var det bare tre tilfeller (Cases 2, 5 og 6) med ALK-positiv farging i metastatiske svulster. Den andre 50% av metastatiske svulster var helt ALK-negativ farging, inkludert Cases 1, 3 og 4. For Sak 4, selv om de metastatiske svulster består det meste av adenokarsinom komponent, ALK farging var fortsatt helt negativ.
ALK-positive farging ble vist i primære svulster av alle 7 ALK-omarlungekreftpasienter med diffuse flekker i cytoplasma. ALK-positiv farging var ikke tydelig i hver primærtumorcelle, særlig i Eksempel 4, som er en adenosquamous karsinom med ALK positiv farging bare i adenokarsinom del, ikke i skvamøs karsinom bestanddel (angitt i rød tekst: Adeno og Squamous). For lymfeknute metastaser, Skaper 2, 5 og 6 viste ALK-positiv farging og Cases 1, 3 og 4 viste ALK-negativ farging.
Til slutt ALK immunfluorescens farging (ALK-IF) ble også ansatt i ALK-IHC av de primære og metastatiske svulster i alle ALK-positive tilfeller, noe som ytterligere bekreftet de ALK-IHC funn. Som vist i figur 5, ALK-IF var også positive i alle primære tumorer, med det ALK proteinlokaliserende i cytoplasma. Lignende resultater ble oppnådd med ALK-IHC, hvor 50% av metastaser viste fullstendig ALK-negativ farging i Cases 1, 3 og 4. Vi utførte også RT-PCR for EML4-ALK gen med cDNA fra alle metastatiske svulster og innhentet samme resultat, det vil si negativ ekspresjon av EML4-ALK-genet i Cases 1, 3 og 4 (data ikke vist). Alle disse dataene bekreftet intratumor heterogenitet av ALK omorganisering i primær lungekarsinom.
ALK-positive farging ble vist ved primær svulst alle 7 ALK-omarlungekreftpasienter. For de lymfeknute metastaser, Skaper 2, 5 og 6 viste ALK-positiv farging og Cases 1, 3 og 4 viste ALK-negativ farging. Disse resultatene var lik de for ALK immunhistokjemi. ALK: green; Ki-67: red; DAPI. Blå
EGFR og KRAS-mutasjoner og kliniske kjennetegn ved pasientene
Av de 208 pasientene i studien identifiserte vi 51 tilfeller av EGFR mutasjoner i eksoner 18, 19, 20, eller 21 (24,5%, 51/208, Tabell S1). Mutasjoner i ekson 18 av EGFR ble identifisert i 3 tilfeller; en ekson 19 sjonen ble identifisert i 21 saker, og mutasjoner i eksoner 20 og 21 mutasjoner ble oppdaget i 6 og 26 saker, henholdsvis. Fem tilfeller utstilt doble mutasjoner i de EGFR eksoner. Blant eksoner 18-21, EGFR mutasjoner oppsto hovedsakelig i eksoner 19 og 21 (90,19%, 46/51). I samsvar med tidligere rapporter, EGFR mutasjonsraten i adenokarsinom pasienter (44,2%, 42/95) var mye høyere enn hos ikke-adenokarsinom pasienter (8,0%, 9/113,
P
= 0,000). I tillegg EGFR mutasjonsraten var signifikant lavere i (15,0%, 22/147) enn hos kvinnelige pasienter mannlige pasienter (47,5%, 29/61;
P
= 0,000). Blant ikke-røykere, EGFR mutasjonsraten var 42,3% (33/78), mye høyere enn blant røykere (13,9%, 18/130;
P
= 0,000). Ingen foreninger ble identifisert mellom EGFR genmutasjoner og alder, klinisk stadium, tumorstørrelse, eller metastasestatus av pasientene (Tabell 3).
Blant 208 pasienter, 6 tilfeller gjennomført KRAS-mutasjoner (2,88%, 6/208 ). Ingen foreninger ble påvist mellom KRAS mutasjoner og alder, klinisk stadium, kjønn, patologi, røykestatus, tumor størrelse, eller metastasestatus av pasientene (Tabell 3). Ingen EGFR /KRAS-mutasjoner ble oppdaget blant EML4-ALK-positive pasienter i vår studie.
Survival analyse
Som av mars 2011, 181 pasienter hadde fullført prognosedata, inkludert 49 dødsfall og 132 tilfeller for å overleve. Median oppfølging for hele serien var 591 dager (range fra 0 dager til 1329 dager). Vi har utført en overlevelsesanalyse av disse 181 pasienter med hensyn på tilstedeværelse av EML4-ALK fusjonsgen og EGFR /KRAS mutasjoner. Vi identifiserte 45 pasienter med EGFR mutasjoner, for hvem median overlevelsestid var 19,3 måneder (578 dager, 124-1281). Av de 136 pasientene med normal EGFR, median overlevelse var 19,8 måneder (594.5 dager, 0-1329). Forskjellen i median total overlevelse ganger mellom disse gruppene var ikke statistisk signifikant (
P
= 0,467). Vi identifiserte 4 pasienter med KRAS-mutasjoner for hvem median overlevelse var 16,3 måneder (489 dager, 233-818). Av de 177 pasientene med normal KRAS, median overlevelse var 19,7 måneder (592 dager, 0-1329). Blant de 181 sakene, 7 pasienter gjennomførte EML4-ALK fusjonsgenet trans. Median oppfølging av disse pasientene var 16,8 måneder (504 dager, 360-661), som ikke var signifikant forskjellig i forhold til EML4-ALK negative gruppen med 33,4 måneder (594.5 dager, 0-1329) (
P
= 0,655).
Meta-analyse av kliniske egenskaper knyttet EML4-ALK trans
Som vist i tabell 4, systematisk analyse av litteraturen avslørt 14 publikasjoner analysere frekvens og kliniske karakteristika assosiert med EML4-ALK trans, inkludert 2580 NSCLC pasienter. Av disse 125 pasienter (4,84%, 125/2580) næret den EML4-ALK omorganisering. Meta-analyse viste at EML4-ALK trans var dominerende hos kvinnelige pasienter med adenokarsinom. Elleve studier (1825 tilfeller) undersøkte en sammenheng mellom røykestatus og EML4-ALK trans. Vi oppdaget en betydelig skjevhet mellom røykere og ikke-røykere grupper (
P
= 0,49), slik at data ble analysert ved hjelp av en tilfeldig effekt-modell. En vesentlig forskjell ble påvist i EML4-ALK positivitet status mellom røykere og ikke-røykere (OR [95% CI] = 0,26 [0,16, 0,43], Z = 5,26;
P 0,05
) (Figur 6A) . Resultatene indikerte at røykestatus var signifikant assosiert med EML4-ALK trans. Ni rapporter (1413 saker) vurderte EML4-ALK trans i adenokarsinom og ikke-adenokarsinom grupper. Vi oppdaget ingen signifikant skjevhet mellom de to gruppene (
P
= 0,50), så en fast effekt modellen ble brukt. Våre resultater tyder på at EML4-ALK trans frekvens skilte seg i adenokarsinom gruppen sammenlignet med ikke-adenokarsinom gruppe (OR [95% CI] = 2,07 [1,11, 3,84], Z = 2,30;
P 0,05
) (figur 6B). Elleve studier (1777 saker) evaluert EML4-ALK trans i mannlige og kvinnelige grupper. Vi fant ingen signifikant skjevhet mellom de to gruppene (
P
= 0,95) og analyserte data ved hjelp av en fast effekt modell. Våre resultater viste at det var ingen signifikant forskjell mellom hann- og hunn-grupper. (OR (95% KI) = 0,64 [0.40,1.04] Z = 1,80,
P
0,05). (Figur 6C)
(A) Meta-analyse ved hjelp av en tilfeldig effekter modellen viste at røykestatus var signifikant korrelert med EML4-ALK trans; (B) Meta-analyse av data ved hjelp av en fast effekt modell indikerte at adenokarsinom (AD) signifikant korrelert med EML4-ALK trans. Den trans var signifikant hyppigere i AD-gruppen enn i den ikke-AD gruppe; (C) Meta-analyse ved hjelp av en fast effekt modell antydet at kjønn ikke var signifikant korrelert med EML4-ALK trans frekvens.
Diskusjoner
Lungekreft er en ødeleggende sykdom assosiert med en 5-års overlevelse på ca 10-15%. Selv om nye cellegifter har blitt utviklet i løpet av de siste to tiårene, er det fortsatt et stort behov for mer effektive behandlinger. Molekylært målrettet terapi presentere en ny strategi som nylig demonstrerte betydningen av sub-klassifisere pasienter i henhold til kreftspesifikke biologiske egenskaper.
EGFR og KRAS er to relevante molekyler i NSCLC, og EGFR blir målrettet av EGFR-TKI. Disse stoffene viser stort potensial i behandling av pasienter med avansert NSCLC. Mange rapporter har bekreftet at effekten av EGFR-TKI korrelerer med EGFR ekson mutasjoner [5], [8], og at forekomsten av EGFR mutasjoner er høyere blant asiater, ikke-røykere, kvinner, og pasienter med adenokarsinom. Soda et al. (2007) foreslått et ytterligere potensielt relevant onkogent hendelse i lungekreft: fusjon av EML4 genet (region tilsvarende det N-terminale segment) med ALK-genet (region som tilsvarer den intracellulære signalisering del) for å skape en EML4-ALK-fusjonsgenet . Den EML4-ALK trans representerer en ny undergruppe av NSCLC pasienter som reagerer positivt på ALK-hemmere [11], [20].
Vårt arbeid bekrefter forekomsten (24,5%) av EGFR mutasjoner i en uselektert kinesiske befolkningen av pasienter med NSCLC. Blant eksoner 18-21, EGFR mutasjoner oppstår hovedsakelig (90,19%) i eksoner 19 og 21. I samsvar med tidligere rapporter, disse mutasjonene er identifisert ved høye frekvenser i kvinner, aldri-røykere, folk med asiatisk etnisitet, og adenokarsinom pasienter. Interessant var forekomsten (6/208, 2,88%) av KRAS-mutasjoner i vår studie gruppe var svært lav sammenlignet med vestlige land (12-25%) [21].
Vårt arbeid bekrefter også lav forekomst ( 7/208, 3,37%) av EML4-ALK trans blant uselekterte NSCLC, som er konsistent med den meta-analyse av kliniske karakteristika forbundet med EML4-ALK translokasjon i den publiserte litteraturen (4,84%). Dette resultatet indikerer at utbredelsen av EML4-ALK mutasjoner i den kinesiske befolkningen er lik som tidligere utgitt for bestander av andre etnisiteter. Den EML4-ALK trans kan ikke knyttes til en bestemt etnisk opprinnelse, i motsetning til EGFR mutasjoner i asiater. Videre analyse av EML4-ALK mutasjon varianter avdekket at variant 3 kan være den dominerende varianten blant kinesiske NSCLC pasienter med mer enn halvparten av de EML4-ALK trans stiller fusjoner mellom exon 6 av EML4 og ekson 20 av ALK. Disse resultatene ytterligere tyder på at utbredelsen av EML4-ALK mutasjonen ikke kan variere etter etnisitet, men at en bestemt variant kan være utbredt i en bestemt etnisk gruppe.
Våre resultater viser videre at EML4-ALK transforekommer hovedsakelig i hunner, aldri-røykere, og adenokarsinom pasienter. Disse resultatene var forskjellig fra meta-analyse av kjønn, der det var ingen signifikant forskjell mellom hann- og hunn-grupper. I vår studie, alle 7 ALK-positive tilfeller var kvinner, og årsaken kan være på grunn av mye høyere andelen røykere blant menn enn at kvinner i Kina. Videre analyser viste at forekomsten av EML4-ALK trans i kvinnelig, røykfrie, adenokarsinom pasienter er så høy som 15,2%. Disse egenskapene er av stor betydning, fordi kvinnelige, røykfrie, adenokarsinom pasienter er vanligvis valgt å dra nytte av EGFR-TKI behandling, noe som indikerer at en EML4-ALK trans skjermen skal gå foran TKI behandling. EGFR /KRAS mutasjoner og EML4-ALK trans kalles driver mutasjoner fordi de er ansvarlig for både initiering og vedlikehold av lungekreft. Pasienter som er bærere av EML4-ALK trans er vanligvis ikke responderer på EGFR-TKI behandling, men kan være følsomme for ALK-hemmere [11], [20].
I vår studie sammenligning av EML4-ALK fusjons status med tilstedeværelse av EGFR og KRAS mutasjoner i de samme kreftprøvene viste at EML4-ALK-fusjoner forekom i fravær av EGFR eller KRAS-mutasjoner. Selv om tidligere rapporter har indikert at ALK fusjon kan skje samtidig med EGFR mutasjoner (1/305) og KRAS-mutasjoner (1/120), kan disse være sjeldne hendelser [7], [22]. Videre analyser er angitt i de 32 tilfellene av røykfrie, kvinnelig, adenokarsinom pasienter at hyppigheten av EGFR ekson mutasjoner og EML4-ALK trans var 62,5 %% (20/32) og 15,63% (5/32), henholdsvis, som dekker alt 78,13% (25/32) av disse pasientene. I tillegg, Sasaki et al. nylig rapportert at 6% (3/50) av behandlingsnaive NSCLC pasienter med ALK omorganisering hadde samtidige EGFR aktiverende mutasjoner og at ALK omorganisering var inaktiv hos disse pasientene på grunn av EGFR mutasjon [23]. Siden de fleste pasienter med EML4-ALK-fusjoner ikke oppviser EGFR mutasjoner, er en spesifikk molekyl undergruppe av adenokarsinomer, karakterisert ved EML4-ALK-fusjons [14]. I dag er noen spesifikke molekylære medisiner for EML4-ALK fusjon brukes til å behandle NSCLC pasienter med EML4-ALK trans. Derfor er en trinnvis metode for å teste for genmutasjoner i lunge adenokarsinom slått: først for KRAS, andre for EGFR, og deretter EML4-ALK translokasjon. Hvis en svulst er positivt for en KRAS mutasjon, er ikke lenger molekylær testing er nødvendig, og behandlingsanbefalinger vil fokusere på kjemoterapi fordi svulster husing somatiske mutasjoner i KRAS, som koder for et GTPase nedstrøms EGFR, vise større motstand mot disse målrettede medikamenter. Hvis svulsten er negativ, vil den bli testet for EGFR mutasjoner og EML4-ALK translokasjon. Et positivt resultat for enten EGFR mutasjon eller EML4-ALK trans utløser en målrettet behandling.: En EGFR TKI eller et ALK-inhibitor
For det patologisk analyse, cribriform strukturen, nærværet av mukøse celler, ekstracellulær slim, og mangel av vesentlig atom pleomorphism, kan alle ses i EML4-ALK omar kreft, som var lik funn i en tidligere rapport [18]. «Solid signet-ring cellemønster» og «mucinous cribriform mønster» er to kjente cytoarchitecures tilstede i det minste fokalt i de fleste ALK-positive tumorer [18]. Med hensyn til disse to mønstrene, fikk vi ikke se en betydelig forskjell mellom fast signet-ring celle mønster og mucinous cribriform mønster i alle ALK positive tilfeller i vår studie (4/7 vs 3/7, henholdsvis). Interessant, våre ALK immunofarging resultatene indikerte at ikke alle tumorceller ble ALK-positiv farging i de primære områder, særlig i adenosquamous karsinom, i motsetning til andre studier rapporterer at plateepitel carcinom komponent flekker positiv [18], [24]. Enda mer overraskende, fant vi at 50% av metastatiske svulster var helt negative for ALK farging (IHC og IF). Dette fenomenet ble også funnet i andre studier med EGFR mutasjoner, som viste 38,0% av tumorene (30 av 79) som har en intratumor heterogenitet
EGFR
mutasjoner og 62,0% (49 av 79) er homogene, enten med
EGFR
mutasjon eller ingen mutasjoner [25]. Vår farging også bekreftet intratumor heterogenitet av ALK omorganisering i primærsvulster, og så vidt vi vet, er dette den første rapporten om ALK omorganisering i lungekreft ved metastaser versus primære områder, som viste molekylære forskjeller. Disse resultatene indikerer at genekspresjon i den metastatisk tumor ikke er helt lik den som er i den primære tumor. For pasienter behandlet med de molekylære målet narkotika, disse resultatene også påpeke at den nye molekylær påvisning er svært nødvendig for disse pasientene med nye metastaser, særlig for NSCLC pasienter med EML4-ALK trans.
I sammendraget, vi bekrefter at EGFR ekson mutasjoner er hyppige hos pasienter med NSCLC, særlig blant kvinner, ikke-røykere, og adenokarsinom pasienter. EML4-ALK trans er sjeldne i hele NSCLC pasientpopulasjonen, men er hyppigere i NSCLC pasientgruppen av kvinner, røykfrie, adenokarsinom pasienter. Tilstedeværelsen av en EML4-ALK trans med samtidige EGFR /KRAS-mutasjoner er svært sjelden blant lungekreftpasienter. Våre resultater tyder på at påvisning av EML4-ALK trans i undergrupper av pasienter med NSCLC er avgjørende for å søke målrettet terapi.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Samples ble innhentet fra 208 NSCLC pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon av primær lungekreft ved Institutt for Lung Cancer Surgery, Tianjin Medical University General Hospital for diagnose og behandling i løpet av 2006-2010. Skriftlig informert samtykke ble innhentet, og studien ble godkjent av Institutional Ethics Committee of Tianjin Medical University General Hospital. Inklusjonskriteriene var: (1) kirurgisk behandling uten forutgående kjemoterapi eller behandling med EGFR-TKI; (2) klar diagnose av NSCLC; og (3) tilgjengelighet av vev for biomarkør studier. Kliniske og patologisk kjennetegn ved pasientene inkludert er beskrevet i tabell 1. Lungekreft staging for hver pasient ble utført i henhold til AJCC Cancer Staging Manual, syvende utgaven. Pasientene i denne studien ble uforholdsmessig klassifisert i fase III, fordi dette stadium av lungekreft er forbundet med kirurgisk behandling. Overlevelse ble beregnet ut fra den dagen reseksjon før 6. april ble 2011. resected lunge vev umiddelbart nedsenket i flytende nitrogen.
H2228, human lunge adenokarsinom cellelinje med EML4-ALK fusjonsgenet, var fra den amerikanske Tissue Culture Collection (ATCC), og ble holdt i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum (GIBCO) ved 37 ° C med 5% CO
2.
RNA isolering og revers transkripsjon
frosne vev (50-100 mg) ble malt til et pulver i flytende nitrogen og ble suspendert i 1 ml TRIzol-reagens (Invitrogen, USA) for total RNA ekstraksjon, i henhold til produsentens protokoll. Totalt RNA ble kvantifisert ved anvendelse av et spektrofotometer (Beckman-Coulter, USA), og dens kvalitet ble bestemt ved agarosegel-elektroforese. Total RNA (2 pg) ble revers-transkribert (RT) ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase (Promega, USA), med mindre modifikasjoner til produsentens protokoll.
