Abstract
Bakgrunn
Esophageal adenokarsinom (EAC) er en sjelden helbredelig sykdom og er raskt økende over hele verden i forekomsten. Barret øsofagus (BE) og høygradig dysplasi (HGD) anses viktige risikofaktorer for invasiv adenokarsinom. I denne studien ble upartisk global metabolsk profilering metoder brukt til serumprøver fra pasienter med EAC, BE og HGD, og friske individer, for å identifisere metabolitt baserte biomarkører forbundet med de tidlige stadiene av EAC med mål om å bedre forutsigelse.
metodikk /hovedfunnene
Serum metabolittprofiler fra pasienter med EAC (n = 67), BE (n = 3), HGD (n = 9) og friske frivillige (n = 34) var oppnås ved hjelp av høy-ytelses-væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) metoder. Tolv metabolitter signifikant forskjellig (
p
0,05) mellom EAC pasienter og friske kontroller. En partiell minste kvadraters diskriminant analyse (PLS-DA) modell hadde god presisjon med arealet under mottakeren operative karakteristiske kurve (AUROC) på 0,82. Imidlertid, når resultatene av LC-MS ble kombinert med 8 metabolitter påvist ved kjernemagnetisk resonans (NMR) i en tidligere undersøkelse, kombinasjonen av NMR og MS detektert metabolitter ga en mye overlegen ytelse, med AUROC = 0,95. Videre middelverdier av 12 av disse metabolittene varierte konsekvent fra friske kontroller til høyrisikopersoner (BE og HGD pasienter) og EAC fag. Altered metabolske veier, inkludert en rekke aminosyre trasé og energiomsetningen ble identifisert på grunnlag av endrede nivåer av en rekke metabolitter.
Konklusjon /Betydning
Stoffskifte profiler avledet fra en kombinasjon av LC-MS og NMR metoder lett skille EAC pasienter og potensielt lover viktige ruter for å forstå kreftutvikling og oppdager kreften. Forskjeller i de metabolske profiler mellom høy-risiko individer og EAC indikerer muligheten for å identifisere pasienter med risiko mye tidligere til utvikling av kreft
Citation. Zhang J, Bowers J, Liu L, Wei S , Gowda GAN, Hammoud Z, et al. (2012) Esophageal Cancer metabolitt Biomarkører oppdaget ved LC-MS og NMR metoder. PLoS ONE 7 (1): e30181. doi: 10,1371 /journal.pone.0030181
Redaktør: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, Frankrike
mottatt: 22 september 2011; Godkjent: 12 desember 2011; Publisert: 23 januar 2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Purdue University Center for kreftforskning og onkologisk Sciences Center i Discovery Park ved Purdue. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft er en dødelig sykdom med anslagsvis 16,640 nye tilfeller og 14.500 dødsfall i USA i 2010 [1]. I år var 2000 de tilsvarende tallene 12 300 og 12 100, henholdsvis [2], som indikerer en betydelig økning i forekomsten. Av de to krefttyper, esophageal adenokarsinom (EAC) og plateepitelkarsinom, er EAC mer utbredt i USA. Selv om risikofaktorer forbundet med EAC ikke blir forstått hittil, er Barretts øsofagus (BE) som anses å være en faktor for kreftutvikling i spiserøret [3]. I tillegg er høygradig dysplasi (HGD) betraktes som en umiddelbar forløper for invasiv adenokarsinom [4]. Men det finnes ingen intervensjon i dag som kan hindre progresjon av BE eller HGD til EAC [5]. De tradisjonelle fremgangsmåter for diagnostisering av spiserørskreft, inkludert endoskopi og barium svelge, lider av dårlig spesifisitet og sensitivitet, som typisk resulterer i påvisning av sykdommen bare på et avansert stadium [6], [7], [8], [9]. Alternativt er det å håpe at en bestemt undergruppe av molekylære biomarkører kan karakterisere stadium av sykdommen og hjelpe tilpasse behandlingen [10]. På molekylært nivå, er kreftutvikling av spiserøret tenkt å være en kompleks prosess som involverer flere genetiske avvik og miljøfaktorer. Tallrike studier rapporterer spesifikke endringer i proteiner, gener og metabolske baner i EAC som kan være nyttig for å hjelpe til ved diagnose, prognose og behandling av spiserørskreft [11], [12], [13], [14]. Microarray studier har også fokusert oppdagelsen av nye markører basert på individuell svulst genetisk sammensetning [15]. Men pålitelige markører, særlig på et tidlig og potensielt kurativ scenen, er fortsatt i stor etterspørsel.
Metabolomics, også kjent som metabolsk profilering og metabonomics, er et raskt voksende felt i systembiologi, og tilbyr en kraftig og lovende tilnærming for å identifisere biomarkører assosiert med cancer og andre sykdommer. Metabolomics fokuserer på å avlede konsentrasjoner og flukser av lavmolekylære metabolitter ( ~ 1 kDa) i biofluids eller vev, som gir detaljert informasjon om biologiske systemer og deres nåværende status [16], [17]. Massespektrometri (MS) og kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi er de to kraftigste og mest vanlig anvendte analysemetoder for metabolsk fingerprinting [17], [18]. De to metodene er komplementære; mens MS er svært følsom, er NMR meget kvantitativ og reproduserbar. Utnyttelse av både MS og NMR metoder fører til rutinemessig analyse av over 1000 metabolitter.
Et økende antall metabolomics studier har blitt rapportert for å oppdage ulike typer kreft [19], [20], [21], [22 ], [23]. Men studier som fokuserer på EAC er fortsatt relativt få i antall. Nylig har to papirer rapportert på analyse av vev metabolitter ved hjelp av magisk-vinkel spinning (MAS) NMR og gasskromatografi (GC) MS hver kombinert med multivariate statistiske metoder [24], [25]. Begge verkene rapportert en rekke statistisk signifikante sært metabolitter. En annen
1 H NMR studien undersøkte humant plasma og identifisert variasjoner i flere metabolittkonsentrasjoner forbundet med EAC som avvek blant etniske grupper [26]. Innsatsen i vårt laboratorium har vært fokusert på utvikling av metabolomics verktøy og biomarkør kandidater til å oppdage tidlig EAC og for å identifisere pasienter med høy risiko for å utvikle EAC. Vi har nylig rapportert metabolomics-baserte undersøkelser av EAC bruker
1 H NMR-spektroskopi og viste at åtte serum metabolitter differensiert EAC fra friske kontroller [27]. Vi har også rettet et antall nukleosider i serum ved hjelp av væske-kromatografi-trippelfiredoble (LC-QQQ) MS og viste meget betydelige variasjoner i et antall normale og metylerte nukleosider i EAC [28]. Med mål om å øke sensitivitet og spesifisitet av pasienten klassifisering samt identifisere personer med risiko for å utvikle kreft i denne studien vi brukt global metabolsk profilering tilnærming til serumprøver fra EAC, BE og HGD pasienter og friske kontroller ved hjelp svært følsom og løst time-of-flight massespektrometri kombinert med væskekromatografi (LC-TOF) MS. Metabolske profiler ble analysert hver for seg og i kombinasjon med tidligere avledet metabolitt markører ved hjelp av NMR-metoder [27]. Vi evaluerte kombinasjonen av NMR og MS-data i form av deres prestasjoner i klassifisering EAC pasienter og friske kontroller i forhold til ytelsen til enten MS eller NMR data alene. Muligheten av de metabolske profiler for å skille høyrisikopersoner (BE og HGD pasienter) fra EAC samt friske kontrollpersoner ble undersøkt. Vi har også identifisert en rekke metabolitter som fungerte som trending markører, ved at deres gjennomsnittsnivået økt /redusert kontinuerlig fra friske kontrollpersoner til høyrisiko fag og deretter EAC pasienter.
Materialer og metoder
kjemikalier
Deuterium oksid (99,9% D) ble kjøpt fra Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA). Trimethylsilylpropionic syre-d
4-natriumsalt (TSP), tridekan syre, klorfenylalanin, melkesyre, valin, leucin, isoleucin, metionin, karnitin, tyrosin, tryptofan, myristinsyre, margarinsyre, linolensyre, linolsyre og pyroglutaminsyre ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (analytisk kvalitet, St. Louis, MO). 5-hydroxytryptophan ble kjøpt fra Alfa-Aesar (analytisk kvalitet, Ward Hill, MA). HPLC grad metanol og eddiksyre ble anskaffet fra Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Avionisert vann ble hentet fra en EASYpure II UV vannrensing system (Barnstead International, Dubuque, IA).
Serum prøvetaking og lagring
Fasting blodprøver fra pasienter med histologisk påvist EAC (n = 67), HGD (n = 9) og BE (n = 3) var samlet på Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). De detaljerte clinicopathologic egenskapene til EAC pasienter som ble beskrevet i foregående papir [27], og en oppsummering er vist i tabell S1. Vi brukte 68 EAC, 11 HGD og 5 BE prøvene i forrige NMR studien. Men på grunn av de begrensede mengder av noen eksempler, fjernet vi en EAC, 2 HGD og 2 BE prøver for LC-MS-eksperimenter og ytterligere analyse i dette arbeid; de tilsvarende NMR-data ble også ekskludert fra den kombinerte analysen og diskusjon. Blodprøver fra friske frivillige (n = 34) ble oppnådd i fastende tilstand. Hver blodprøve ble tillatt å koagulere i 45 minutter og deretter sentrifugert ved 2000 rpm i 10 min. Serumet ble samlet opp, alikvotert i en separat ampulle, frosset og sendt over tørris til Purdue University (West Lafayette, IN), hvor de ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Alle prøvene ble samlet følge protokollen er godkjent av Indiana University School of Medicine og Purdue University Institutional Review Boards. Alle fag som inngår i studiet gitt skriftlig informert samtykke i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Prøvepreparering og datainnsamling
For LC-MS-analyse, ble frosne serumprøver tint, og proteinet ble fremskyndet av blande 100 mL serum og 200 mL kald metanol. To interne standarder, tridekan syre og klorfenylalanin ble også inkludert for å overvåke ekstraksjonseffektiviteten. Blandingen ble sentrifugert ved 13200 rpm i 10 min. Den overliggende oppløsning ble oppnådd etter fjerning av protein ble tørket under vakuum og det oppnådde residuet ble rekonstituert i 15 mL metanol /vann (01:01) -løsning. Den resulterende løsning ble igjen sentrifugert ved 13 200 rpm i 10 minutter for å fjerne partikler, hvis noen, og supernatanten ble overført til en LC ampullen. Separat ble en samleprøve erholdt ved å blande sammen 20 ul fra hver av de 20 humane serumprøver tilfeldig valgte fra alle prøvene, og de metabolitter ble ekstrahert ved anvendelse av samme prosedyre som ovenfor. Denne samleprøve, referert til som kvalitetskontroll (QC) matrise prøven ble underkastet analyse med jevne mellomrom mellom hver 10 sampler. QC eksempeldataene også fungert som teknisk replikater hele datasettet for å vurdere prosessen reproduserbarhet. LC-MS analyse ble utført ved hjelp av en Agilent LC-QTOF system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) som består av en Agilent 1200 SL væskekromatografi system kombinert online med en Agilent 6520 time-of-flight massespektrometer. En 3 mL alikvot av rekonstituerte prøve ble injisert i en 2,1 x 50 mm Agilent Zorbax forleng-C18 1,8 um partikkel kolonne med en 2,1 x 30 mm Agilent Zorbax SB-C8 3,5 um partikkelbeskyttelseskolonne, som var både oppvarmet til 60 ° C. Serum metabolitter ble gradient-eluert ved 600 ul /min ved anvendelse av mobil fase A: 0,2% eddiksyre i vann og mobil fase B: 0,2% eddiksyre i metanol (2% til 98% B i 13 min, 98% B i 6 min ). Elektrospray ionisering (ESI) ble anvendt i positiv modus. MS grensesnitt kapillær ble holdt ved 325 ° C, med en kappe gass-strøm på 9 l /min. Sprayen spenning for positive ion injeksjon var 4,0 kV. Massen analysatoren ble skannet over et spekter av 50-1000
m Twitter /
z
. Agilent MassHunter arbeidsstasjon LC-TOF og QTOF Acquisition programvaren (B.02.01) ble brukt for automatisk peak deteksjon og massespektrum deconvolution.
Detaljerte prosedyrer for prøveopparbeidelse og NMR eksperimenter ble nylig publisert andre steder [27]. I korthet, ble frosne serumprøver tint, og 200 pl ble blandet med 350 ul av D
2O. Resulterende oppløsninger ble overført til 5 mm NMR-rør. En 60 ul løsning av TSP (0,12 mg /ml) i et forseglet kapillar ble anvendt som en indre standard, som fungerte som den kjemiske forskyvning referanse (δ = 0,00). Alle
1H NMR eksperimenter ble utført ved 25 ° C på et Bruker DRX-500 spektrometer utstyrt med en trippel resonans
1 H inverse deteksjon sonde med tredobbelt akse magnetiske feltgradienter.
1 H NMR spektra ble anskaffet ved hjelp av standard endimensjonale CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssekvens med vann signal presaturation. Hvert datasett ble fordelt på 64 transienter som bruker 16 K tid domene poeng. Dataene ble Fourier transformert etter å multiplisere med en eksponentiell vindu funksjon med en linje utvidelse av en Hz, og spektrene var fasen og baseline korrigeres ved hjelp av Bruker toppspinn (versjon 3.0).
Dataanalyse
LC-MS data ble behandlet ved hjelp av Agilent MassHunter Kvalitativ Analyse (versjon B.03.01) for sammensatte identifikasjon. En liste over ioneintensitetene for hvert oppdaget topp ble generert ved hjelp av en retensjonstid (RT) indeks og m /z data som identifikatorer for hvert ion. Agilent MassHunter arbeidsstasjon Mass Profiler Professional programvaren (versjon B.02.00) ble så brukt for sammensatte topp justering. Et filter ble satt til å fjerne eventuelle metabolitt signaler som hadde manglende topper (ion intensitet = 1) på mer enn 10% av prøvene i en hvilken som helst gruppe. Topper fra interne standarder ble også fjernet. Til slutt ble Agilent Formel Database (Agilent, 2010) anvendt for forbindelse identifikasjon ved å sammenholde nøyaktig massespekteret til en database av metabolitt-forbindelser. Uparede Student
t
-test analyse av dataene ble utført for å vurdere forskjellene oppdagede sammensatte intensiteter blant EAC, BE og HGD prøver, og friske kontroller. Metabolitter med lav
p
-verdier ( 0,05) ble valgt som potensielle biomarkører kandidater og bekreftet fra massespektra og RTs av autentiske kommersielle forbindelser kjøres separat. Folden endring (FC) for hver metabolitt ble beregnet for å bestemme metabolittens variasjon mellom gruppene.
NMR spektralområder ble binned til 4 K bøtter med lik bredde (1,5 Hz) for å minimalisere feil på grunn av svingninger av kjemisk skift som følge av pH eller ion konsentrasjonsvariasjoner. Hver spektrum ble justert til metyl toppen av alanin ved 1,48 ppm, og normalisert ved hjelp av den integrerte TSP signal. Spektrale områder fra 0,3 til 10,0 ppm ble brukt for analyse etter å ha fjernet vannet og ureasignaler (4,5 til 6,0 ppm). Univariat analyse ble utført ved å bruke det uparede Student
t
-test for å identifisere vesentlig forskjellige spektral binger blant EAC, BE og HGD pasienter og friske kontroller. Hyller som viste signifikante forskjeller mellom ulike pasient /styrer gruppene ble deretter tildelt tilsvarende metabolitter ved å sammenligne kjemisk skift og multiplicities av toppene til litteraturen eller online databaser [29], [30], [31]. De karakteristiske spektrale regionene for hver metabolitt ble integrert, og
p
-verdier og brett endringer mellom ulike grupper ble beregnet.
MS /NMR data for de valgte statistisk signifikante metabolitter (med
p
0,05) ble importert til Matlab (R2008a, Mathworks, Natick, MA) installert med en PLS verktøykasse (versjon 4.1, egenvektor Research, Inc., Wenatchee, WA) for PLS-DA-analyser. X matrise, bestående av de MS /NMR-spektraldata ble autoscaled før alle statistiske analyser. Avhengig av gruppen, ble hvert fag er tilordnet et «0» (dvs. pasient) og «1», (dvs. frisk kontroll) for å tjene som (en-dimensjonal) Y-matrise. La-ett-out kryssvalidering (CV) ble valgt, og antall latente variabler (LVS) ble valgt i henhold til minimums root mean square error av CV prosedyre. Spådommer ble gjort visuelt ved hjelp av en Y-spådd spredningsdiagram med en cut-off verdi valgt å minimere feil i klassen medlemskap. R statistikkpakke (versjon 2.8.0) ble brukt til å generere mottaker operasjonelle egenskaper (ROC) kurver, beregne og sammenligne sensitivitet, spesifisitet og arealet under ROC-kurven (AUROC).
Resultater
LC-MS-spektrum for hver serumprøve besto av mer enn 5000 funksjoner hvorav nesten 1400 topper ble tilordnet metabolitter ved hjelp av Agilent databasen. Topper fra spektrene som manglet på mer enn 10% av prøvene fra en hvilken som helst gruppe ble utelatt fra videre analyse. Bruk av dette filteret og Agilent kjemisk bibliotek resulterte i til sammen ca 200 identifisert metabolitter mest felles for alle gruppene. Videre, for å identifisere spesifikke metabolitter som best korrelert med forskjeller i biologisk status for de ulike sammenligninger, biblioteket identifiserte metabolitter ble analysert ved hjelp av univariat analyse. Resultatene viste at 40 metabolitter variert betydelig (
p
0,05) mellom enten EAC og friske kontroller, EAC og høyrisikopasienter (BE og HGD pasienter), eller høyrisikopasienter og friske kontroller. Tretten av disse metabolittene kan verifiseres fra massespektra og oppholdstider på de autentiske kommersielle forbindelser. Tabell S2 viser listen over de verifiserte metabolitter fra LC-MS sammen med sine formler, masser og retensjonstider. Likeledes, som vist i Tabell S3, femten pasient-klasse differensierende metabolitter med lav
p
-verdier (
p
0,05) erholdt ved å integrere de relevante NMR-topper ble bekreftet ved å matche de observerte kjemiske skift og multiplicities med tidligere rapporterte data [29], [30], [31]
sammendraget av metabolitt biomarkør kandidater fra LC-MS og NMR med deres
p
. – verdier og fold endringer er vist i tabell 1. ANOVA ble også utført, med resultater som sams sin parallell de fra
t
-test (tabell S4). Men siden vi var interessert i å identifisere individuelle markører som skilte hver av de tre pasient kohortene separat, brukte vi
t
-test data for å identifisere markører for modellbygging. Følsomhet, spesifisitet og AUROC verdier fra PLS-DA modeller av hver sammenligning er oppført i Tabell 2. Sammenligning av MS og NMR data ved hjelp av
t
-test, hver for seg, viste ingen signifikante forskjeller på grunn av kjønn, alder eller kreft stadium (
p
0,05) mellom EAC og kontroller (tabell S5)
Sammenligning metabolske profiler mellom EAC pasienter og friske kontroller
Som vist i tabell 1, tolv metabolitten markør kandidater detektert ved LC-MS differensiert EAC pasienter og friske kontroller, og deres identitet ble bekreftet med autentiske forbindelser. Figur S1 viser box-og-whisker tomter for topp intensiteter av de 12 differensierende biomarkør kandidater. Som det fremgår av tabell 1 og figur S1, er nivået av melkesyre, karnitin og margarinsyre var høyere, og de av valin, leucin /isoleucin (disse strukturelle isomerer kunne ikke skilles med gjeldende LC-metoden), metionin, tyrosin, tryptofan 5-hydroxytryptophan, myristinsyre, linolensyre og linolsyre var lavere i EAC pasienter sammenlignet med friske kontroller.
markør~~POS=TRUNC kandidater fra
1 H NMR-analyse har blitt rapportert i vår tidligere studie [27]. I korthet ble et sett med 8 metabolittene, inkludert β-hydroksybutyrat, lysin, glutamin, citrat, kreatinin, laktat, glukose og en ukjent molekyl var statistisk signifikante (
p
0,05), og høyere nivåer av hver av disse metabolitter i EAC prøvene ble observert (tabell 1).
Figur 1 viser sammenligning av resultatene for 3. metabolske profiler mellom EAC pasienter og friske kontroller. En PLS-DA-modellen med tolv LC-MS avledet metabolitter (og leave-one-out kryss verdivurdering) gitt 77% sensitivitet og 86% spesifisitet med en AUROC av 0,82. Lignende analyse ved hjelp av de åtte NMR utledet metabolitter tilgjengelig 82% sensitivitet og spesifisitet 88% med en AUROC av 0,86. Men når metabolitten dataene ble analysert kombinere 12 LC-MS og NMR 8 detekterte metabolitter, modellen gitt mye overlegen ytelse med både sensitivitet og spesifisitet på 91%, og en AUROC på 0,95.
(A ) Venstre, resultatet av PLS-DA-modellen ved hjelp av 12 metabolitt markører fra LC-MS analyser; midten ROC kurve ved hjelp av kryss validert spådd klasse verdier (AUROC = 0,82); høyre, PLS-DA prognose for BE og HGD prøver fra LC-MS modell sammenligne EAC og friske kontroller. (B) Samme som (A), bortsett fra å bruke 8 metabolitt markører fra NMR-analyser, (AUROC = 0,86); (C) Samme som (A), bortsett fra å bruke en kombinasjon av LC-MS og NMR oppdaget metabolitt markører, (AUROC = 0,95).
For å evaluere BE og HGD prøver, de samme PLS-DA modellen ble anvendt, og resultatet er også vist i Figur 1 (til høyre). BE prøvene ga en blandet resultat, og ingen sikker konklusjon kunne gjøres på grunn av det lille antall prøver. Imidlertid er de fleste av HGD prøver ble forutsagt som EAC i dette tilfellet. PLS-DA-modellen basert på NMR oppdaget metabolitter, og modellen basert på å kombinere LC-MS og NMR oppdaget metabolitter begge viste at 7 av 9 HGD pasienter ble angitt som ligner på EAC prøver.
Sammenligning av metabolsk profiler av EAC og høyrisikopasienter
All data for høyrisikopasienter (BE og HGD pasienter) ble kombinert for analyse på grunn av sine små prøvenummer. Univariat analyse av dataene viste at 7 LC-MS og 8 NMR oppdaget metabolitter variert betydelig mellom EAC og høyrisikopasienter, som sammen med
p
-verdier og fold endringer er vist i tabell 1.
PLS-dA-modeller ble så bygget ved hjelp av LC-MS og NMR utledet metabolitt signaler, hver for seg og i kombinasjon, for å teste klassifiseringen nøyaktighet for de to pasientgrupper, og resultatene er vist på figur 2. LC -MS avledet metabolitter tilgjengelig sensitivitet og spesifisitet på 83% og 80%, henholdsvis, med en AUROC på 0,87, og NMR-utledet metabolitter tilgjengelig både sensitivitet og spesifisitet på 77% med en AUROC på 0,72. Når dataene ble analysert for å kombinere de LC-MS- og NMR-utledet metabolitter, en sensitivitet og spesifisitet på 67% og 97% ble oppnådd, henholdsvis, med en AUROC av 0,82. Her, selv om utførelsen av modellen fra den kombinerte data var litt bedre enn det fra NMR-data alene, modellen avledet fra LC-MS detektert metabolitter viste best ytelse. Ved testing av kontrollene ved hjelp av de samme PLS-DA-modeller utledet fra LC-MS detektert, NMR detektert og kombinert metabolitter, 22, 12 og 22 av 34 kontrollene var over cut-off-verdien, henholdsvis, og ble derfor klassifisert som ikke er lik EAC pasienter
(A) Venstre, resultatet av PLS-DA-modellen ved bruk av 7 metabolitt markører fra LC-MS analyser.; midten ROC kurve ved hjelp av kryss validert spådd klasse verdier (AUROC = 0,87); høyre, PLS-DA prediksjon for friske kontroller ved hjelp av modellen som er utviklet ved hjelp av LC-MS-metabolitter sammenligne EAC og høyrisikopasienter. (B) Samme som (A), bortsett fra å bruke de 8 metabolitt markører fra NMR-analyser, (AUROC = 0,72). (C) Samme som (A), bortsett fra å bruke en kombinasjon av LC-MS og NMR oppdaget metabolitt markører, (AUROC = 0,82).
Sammenligning metabolske profiler av friske kontroller og høyrisikopasienter
Bare én metabolitt, pyroglutaminsyre, oppdaget av LC-MS, og tre NMR oppdaget metabolitter, prolin, melkesyre og en ukjent metabolitt, skilte seg vesentlig (
p
0,05) mellom høy-risiko pasienter fra friske kontroller (tabell 1). I tillegg har en topp som følge av N-acetylert protein i NMR-spektra viste en signifikant forskjell mellom de to gruppene. Mens nivåer av pyroglutaminsyre, prolin og melkesyre var høyere i høyrisikogruppen, de andre var lavere.
LC-MS og NMR data for høyrisikopersoner og friske kontroller ble sammenliknet med PLS-DA-analyse (figur S2). Lone karakteristiske metabolitten detektert ved LC-MS, pyroglutaminsyre, hadde en sensitivitet og spesifisitet på 74% og 75%, henholdsvis, med en AUROC på 0,76. En PLS-DA-modell basert på NMR detektert metabolitter gitt en sensitivitet og spesifisitet på 68% og 92%, henholdsvis, med en AUROC på 0,80. Den kombinerte analysen av dataene fra de to analysemetoder gitt resultater som ligner på den for NMR alene. Men alle modellene ikke klarte å gi en klar prediksjon av EAC pasienter ved hjelp av bare høy risiko og sunne kohorter, noe som indikerer at (ikke uventet) EAC pasientprøver er nødvendig for å bygge en vellykket påvisning modell.
Tendens markører
Nivåer av metabolittene mellom de tre gruppene, EAC, BE HGD, og friske kontroller ble sammenliknet med box-og-whisker plott. Interessant, de gjennomsnittlige nivåer for 12 av metabolittene, inkludert melkesyre, valin, leucin /isoleucin, metionin, tyrosin, tryptofan, myristinsyre, linolsyre, β-hydroksybutyrat, lysin, glutamin og citrat progressivt skiftet med de gjennomsnittlige nivåer for BE og HGD pasienter faller mellom nivåene for friske kontroller og EAC (figur 3). Mens nivået for melkesyre, 3-hydroksybutyrat, lysin, glutamin og citrat økt, nivåene for valin, leucin /isoleucin, metionin, tyrosin, tryptofan, myristinsyre og linolsyre reduseres progressivt.
horisontal linje i den midtre del av boksen, median; bunn og topp grenser bokser, nedre og øvre kvartil; værhår, 5. og 95. persentilene; åpne sirkler, rammene. De første åtte markører ble oppdaget av LC-MS, og de resterende fire ble oppdaget av NMR.
Ved hjelp av disse 12 markører, PLS-DA modellene ble igjen bygget ved hjelp av LC-MS og NMR separat og i kombinasjon, for å teste klassifiseringen nøyaktighet for hver av de to gruppesammenligninger (figur 4). Figur 4A viser PLS-DA-modellen for EAC v. Friske kontroller og spår verdier for pasienter med høy risiko. Modellen gir en sensitivitet og spesifisitet på 89% og 90%, henholdsvis med en AUROC på 0,92, selv om prediktiv test for BE og HGD ikke bedre over at bruk av de foregående PLS-DA-modellen (figur 1B og C). Figur 4B viser den PLS-modell DA sammenligne EAC og den høy-risiko pasient-gruppen, som resulterer i en sensitivitet, spesifisitet og AUROC av 76% 70% og 0,78, respektivt. I dette tilfelle ble det oppnådd en forbedring i den prediktive testing av kontrollsubjekter, med 30 av 34 kontrollene viste seg over cut-off line (ikke-EAC lignende). Men disse 12 markørene kunne ikke brukes til å generere en klar klassifisering mellom friske kontroller og risikopasienter ved hjelp av PLS-DA, og derfor er det ikke mulig å bruke en slik modell for å forutsi EAC (data ikke vist).
(A) sammenligning av metabolske profiler mellom EAC pasienter og friske kontroller, AUROC = 0,92. (B) Sammenligning av metabolske profiler mellom EAC og BE /HGD pasienter, AUROC = 0,78.
Diskusjoner
Denne studien er fokusert på å identifisere skille metabolitter for etablering av forbedret klinisk biomarkører for EAC deteksjon, utvikling av et mer robust klassifiseringsmodell, og innsikt i de endrede metabolske veier i EAC.
de forskjellige metabolitter avledet fra den enkelte LC-MS og NMR analyser viste tydelige forskjeller i en rekke metabolitter mellom EAC og kontroller og oppnådde god klassifisering nøyaktighet. Imidlertid er kombinasjonen av metabolske profiler fra de to metodene aktivert adgang til et økt antall sært metabolitter. Den prediktive kraft av modellen avledet fra kombinasjonen av MS- og NMR-metoder gir bedre resultat i både sensitivitet og spesifisitet sammenlignet med resultatene fra de enkelte analytiske metoder. Den komplementære natur kombinert metabolske bassenget stammer fra de to metodene har bidratt til denne forbedringen av modellen. Faktisk er alle av LC-MS detektert metabolitt markør kandidater bortsett fra melkesyre er forskjellige fra de som er påvist ved NMR. Det bør imidlertid understrekes at mens forbedringen i klassifiseringen var veldig klar for å skille EAC og kontroller, når de to analysemetoder ble kombinert den forbedrede ytelsen for kresne høy risiko (BE og HGD) pasienter versus EAC var mindre synlige og bare i den høye spesifisitet regionen (figur 1 og 2). Denne effekten er sannsynligvis på grunn av det lille antall av høyrisikopasienter og muligens til variasjon av metabolske endringer i større grad fra en pasient til en annen, som begge kan foreta modell forutsigelse mer utfordrende.
Sammenligning av den enkelte metabolitter og statistiske modeller som er utviklet ved hjelp av de unike metabolitter i de tre gruppene viste at metabolske profiler av BE og HGD pasientene var forskjellig fra både EAC pasienter og friske kontroller. Progressive endringer i nivåene av 12 metabolitter avledet fra LC-MS og NMR metoder indikerer potensialet verktøy for å identifisere BE og HGD pasienter som kan utvikle EAC (figur 3). Dette er spesielt viktig siden BE og HGD er viktige risikofaktorer for utvikling av EAC. Identifisering av metabolitter i disse pasientene, som er potensielt prediktiv for utvikling av EAC er særlig viktig for styringen av risikopasienter.
identifikasjon av de metabolske baner er forbundet med spesifikke metabolitter som viser endrede nivåer kan gi en bedre forståelse av biologien og patologi i banen fra normal til esophageal sykdom og til slutt kreft. Vi har tidligere vist et forenklet sti kart basert på metabolitten markører som er identifisert ved hjelp av NMR og sammenlignet resultatene med andre typer kreft [27]. Bygge på denne modellen, figur 5 viser et mer detaljert kart sti forbundet med metabolitt-markører som er identifisert ved hjelp av både MS og NMR-metoder. Endrede veier inkluderer forandringer i aminosyre-metabolisme, biosyntese og degradering (glutamin, lysin, karnitin, valin, leucin /isoleucin, metionin, tryptofan, 5-hydroxytrytophan, og tyrosin), glykolyse (laktat og glukose), ketonlegemer syntese og nedbrytning (
