Abstract
Regulator av Cullins-en (ROC1) er en viktig underenhet i Cullin-RING ligase (CRL) proteinkompleks. Overekspresjon av ROC1 protein er assosiert med tumorprogresjon og dårlig prognose av ikke-muskel invasiv blære overgangsordning celle carcinoma (NMIBC). Denne studien er designet for å vurdere virkningene av ROC1 knockdown i blære kreft celler og for å bestemme mulige mekanismene som er involvert. Totalt 112 blærekreft vevsprøver ble rekruttert for immunhistokjemiske analyser av ROC1 overekspresjon. Blærekreft cellelinjer ble brukt til å knockdown ROC1 uttrykk ved hjelp ROC1 siRNA. Våre data viser at ROC1 knockdown bemerkelsesverdig inhiberte blærekreft cellevekst, stansede celler i G2-fasen av cellesyklusen, og induserte p53-avhengig celle-senescens. Molekylært, G2 arrest var assosiert med oppregulering av p21, p27, cyclin B1, og Cdc2 proteiner. ROC1 knockdown indusert-senescence fungert gjennom p53 /p21 veien. Knockdown av p21 uttrykk delvis reddet ROC1 knockdown-indusert veksthemming i kreftceller. Videre analyser naken mus xenograft bekreftet disse
in vitro
data. I konklusjonen, data fra denne studien tyder på at ROC1 spiller en avgjørende rolle i blærekreft progresjon og kan tjene som en roman kreft mål for blære overgangsordning celle carcinoma (BTCC)
Citation. Wang W, Liu Z, Qu P, Zhou Z, Zeng Y, Vifte J et al. (2013) knockdown av Regulator av Cullins-en (ROC1) Expression Induserer blærekreft cellesyklus arrest i G2 fase og Senescence. PLoS ONE 8 (5): e62734. doi: 10,1371 /journal.pone.0062734
Redaktør: Xiaolin Zi, University of California Irvine, USA
mottatt: 16 januar 2013; Godkjent: 25 mars 2013; Publisert: 8. mai 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Shanghai akademiske ledere «Program av Health System (No. XBR2011038). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den fjerde vanligste kreft og er den åttende største årsaken til kreft dødsfall blant menn i verden [1]. Histologisk blære overgangsordning celle carcinoma (BTCC) er den vanligste subtype og står for ~90% av alle blærekreft [2]. Klinisk, har 20% til 30% av nydiagnostiserte blærekreft tilfeller invadert inn i muskelen lag (kalt muskel-invasiv overgangsordning celle carcinoma, MI-TCC), mens ytterligere 10% til 30% av nonmuscle-invasiv blærekreft vil til slutt fremgang til MI-TCC [3]. Til dags dato, til behandling av blærekreft avhenger av dybden av tumor invaderer inn i blæreveggen; for MI-TCC pasienter, er cisplatin-basert kjemoterapi vanligvis anbefales etter operasjonen [2]. Imidlertid er alvorlig toksisitet av kjemoterapi og relativt lav anticancer effektivitet begrense dets allment anvendelse i klinikken og flertallet av MI-TCC vil til slutt gå videre og gjentakelse, som fører til dårlige prognoser av MI-TCC pasienter [2], [4]. Derfor, identifisering av nye effektive kreft mål og midler er av stor klinisk betydning og presserende behov.
For dette formål, har vi fokusert på Cullin-RING ligaser (CRL) (også kjent som Skp1, Cullin, eller F -box protein [SCF]), som er den største familien av E3 ubiquitin ligaser. På grunn av evnen til å mediere ~ 20% ubiquitinmolekyler proteinsubstrater for proteasomet rettet degradering [5], CRL spiller en viktig rolle i den ubiquitinering av cellesyklusrelaterte proteiner eller andre proteiner (for eksempel, DNA-replikasjon protein, signaltransduksjon protein, gen transkripsjonsfaktor) [6]. Dens dysfunksjon forbinder med svulst utvikling og progresjon, noe som tyder på at CRL kan være en potensiell kreft mål. MLN4924, et lite molekyl-inhibitor til inaktivert CRL ved å hemme cullins aktivitet, kunne effektivt hemme veksten av forskjellige kreftceller [7], noe som ytterligere antyder viktigheten av å opprettholde CRL tumorvekst [8], [9]. Men Regulator av Cullins-en (ROC1), en annen viktig subenhet av CRL som heterodimerizes med tydelige cullins å utgjøre de katalytiske kjerner, hvis funksjon i forbindelse med kreft er dårlig forstå [5]. ROC1, også kjent som ring boks protein-1 (RBX1), inneholder en liten sinkbindende domene som heter ringfingeren, er en evolusjonært konservert protein fra gjær til menneske og spiller en viktig rolle i fosterutviklingen [5]. Avvikende ekspresjon av ROC1 fører til CRL dysfunksjon og forårsaker letalitet embryonale [10]. Nylig har noen studier understreket sin rolle i kreft hos mennesker siden ROC1 kan være avgjørende for å opprettholde genom integritet [11]. I begrunnelsen, overekspresjon av ROC1 forårsaket avvik fra protein metabolisme grunn deregulering av protein post-translasjonell ubiquitylation, og til slutt innvirkning på kreftutvikling og progresjon. Faktisk ROC1 uttrykk påvirke utviklingen av huden melanom ved å regulere cyclinD1 degradering [12]. Konsekvent, våre foreløpige data viste at ROC1 protein er overuttrykt i ikke-muskel-invasiv blærekreft, noe som tyder på sin potensielle rolle i blærekreft utvikling og progresjon. I denne studien, bestemt vi effekten av ROC1 knockdown i blærekreft og potensielle underliggende mekanismer for å gi et nytt mål for behandling av blærekreft i fremtiden.
Materialer og metoder
vevsprøver
i denne studien, vi først rekruttert 112 tilfeller BTCC vevsprøver fra pasienter som gjennomgikk kirurgi i Shanghai Jiao Tong University Affiliate første sykehuset mellom januar 2004 og mai 2006. Disse pasientene inkludert 83 hanner og 29 hunner og ble patologisk diagnostisert med primær BTCC og alder på disse pasientene var mellom 30 og 86 år (median 64 år). Sytti-en pasienter gjennomgikk transurethral reseksjon, 24 pasienter gjennomgikk delvis cystektomi, og 17 pasienter gjennomgikk radikal cystektomi. Karakteren og stadium av svulstene ble vurdert i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) 1973 kriteriene og amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) 2002 TNM-systemet. Videre fjerne normale blære vev ble også oppsamlet som ikke var mer enn 5 cm fra tumor marginen for denne studien. En protokoll for bruk av menneskelige kirurgiske prøvene ble godkjent av Medical Ethics Committee of Shanghai First folks Hospital of Shanghai Jiao Tong University (Permit Number: 2011K047) og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient
Immunohistochemistry
Arkiverte parafininnstøpte formalinfiksert vevsblokker fra disse pasientene ble delt i 4 mikrometer tykke seksjoner og brukes for immunhistokjemi, og protokollen som brukes var ifølge Pan beskrivelse [13]. En polyklonale antistoff mot ROC1 (Abcam, Cambridge, MA) eller Ki67 (Epitomics, Kina) ble fortynnet ved 1:300 og brukes til å immunohistochemically flekke disse vevssnitt ved hjelp av en standard protokoll med Envision Dual Merket Polymer kit (BioGenex, San Ramon, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Seksjonene ble deretter kontra med hematoksylin og uavhengig evaluert av to patologer.
Cellelinjer og kultur
Menneskelig blærekreft RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, og EJ cellelinjer ble kjøpt fra Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og dyrket i RPMI 1640 (Gibco, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco). Celler ble dyrket i en fuktet 5% CO
2 miljø ved 37 ° C. I tillegg ble det normale urotelialceller (NUC) erholdt fra friske blæren vev av 2 unge givere (30 og 32), og dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 i keratinocytt serumfritt medium (KSFM; Gibco) supplert med 1% FBS, 100 IU ml
-1 penicillin, og 100 IU ml
-1 streptomycin.
ROC1 siRNA og Transfeksjon
ulike siRNA oligonukleotider for ulike gener (slik som ROC1 eller p21) ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA) og anvendt for transfeksjon inn i blærecancerceller. Kort, ble cellene sådd på seks-brønns plater over natten og neste dag, ble transfektert med ROC1 siRNA hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. De ROC1 siRNA-sekvensene var 5′-GACTTTCCCTGCTGTTACCTAA-3 «; for p21, 5»-GACCAUGUGGACCUGUCAC-3 «; og for det omkastede kontroll, 5»-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 «. Cellene ble deretter underkastet ekstraksjon protein eller andre analyser, som beskrevet nedenfor.
Protein Extraction og Western Blot
cellulært protein ekstrahert fra cellene med eller uten genet transfeksjon ved hjelp av en lyseringsbuffer. Etter kvantifisering, ble proteinlysatene løst på en SDS-PAGE gel, overført til en PVDF membran (Millipore, Billerica, MA), og immunoblottet med et antistoff mot ROC1 (Abcam), GAPDH, Rb, cyclin B1 (Epitomics), p16 , p21, p27, p53, pRb, cyklin D1, og cdc2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) og deretter med et pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Den bundet antistoff ble visualisert ved hjelp av standard kjemisk luminescens metodikk.
Cell Proliferation og kolonidannelse Analyser
For å vurdere de endrede celle fenotyper av knockdown av ROC1 uttrykk, vi transfektert celler med siROC1 eller siCONT for 24 h og deretter splittet og sådd ut cellene på 96-brønners plater med 2000 celler per brønn i triplikat. På 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter transfeksjon, celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av Cell Counting Kit-8 kit (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens anvisninger.
For koloni formasjonen, dupliseres cellene ble sådd ut på 35 mm kulturskåler ved 400 celler (253J) eller 1000 celler (5637) per brønn i triplikat. Etter ni-dagers inkubasjon ved 37 ° C, ble koloniene farget med krystallfiolett i 50% metanol og antall kolonier av 20 eller flere celler ble telt.
Flowcytometriske analysen
For å oppdage endret cellesyklusfordeling, vi først transfektert inn i siRNA blærekreftceller og deretter fiksert dem i iskald 70% etanol over natten. Den neste dag ble cellene vasket to ganger med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) og deretter farget med propidiumjodid (PI, ved 20 ug /ml, Sigma) løsning i 5 min. Celleprøver ble deretter analysert ved anvendelse av et FACScan strømningscytometer BD for cellesyklus fordelinger. For mitose fase vurderingen ble cellene farget med PH3 /PI bruker Alexa 647-konjugert fosfor-histon H3-spesifikt antistoff (Cell Signaling Technology) i henhold til produsentens anvisninger.
Cell Senescence Associated-β-galaktosidase analyse
Cell-senescens forbindelse ekspresjon av-β-galaktosidase (SA-β-Gal) aktivitet ble målt ved anvendelse av en celle-senescens deteksjonssett (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens instruksjon. Celler med positiv β-galaktosidase-aktivitet (blå farge) ved pH 6,0 ble tellet under et lysmikroskop, og et gjennomsnitt av.
Vurdering av cellemorfologi og Immuno fl uorescence Farging av fosfo-γH2AX
Etter transfeksjon med siROC1 eller siCONT i 24 timer, ble blærecancerceller splittet og re-sådd ut i 24-brønners kulturplater og dyrkes i 72 timer. Cellemorfologi ble observert under et invertert mikroskop. Celler med forstørrede og flate morfologiske endringer ble ansett som senescent-positive. For γH2AX foci farging ble cellene transfektert med siROC1 eller siCONT i 96 timer, og deretter fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,5% Triton X i 10 minutter, og deretter blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA). Cellene ble deretter inkubert med et anti-fosfo-γH2AX primære antistoff (Epitomics) ved 4 ° C over natten. Cellene ble ytterligere inkubert den følgende dag med en Alexa 548-konjugert sekundært antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 1 time ved romtemperatur, og motfarget med 4, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) oppløsning (1 pg /ml fra Sigma) og gjennomgått og scoret under et fluorescerende mikroskop.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) og deretter omvendt transkribert til cDNA ved hjelp av en PrimeScript revers transkripsjon system (Takara, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA-prøvene ble deretter amplifisert ved hjelp av SYBR grønn konsentrat-blanding sett (Takara). Sekvensen av prim brukes er tilgjengelig på forespørsel. Alle målinger ble utført in triplo. Fragment ble analysert ved hjelp av ΔΔCt metoden [14].
In vivo
Mouse xenografter analysen
For å vurdere virkningene av ROC1 knockdown
in vivo
, vi utførte en naken mus (atymiske, BALB /C nu /nu) xenograft-analyse, dvs. 5 x 10
6 5637-celler i 50 ul PBS blandet med et likt volum av Matrigel (BD Biosciences) ble injisert subkutant i nakne mus (alderen 4-6 uker gamle). En uke etter tumorcelle inokulering, ble 12 mus delt inn i 2 grupper (6 mus i hver gruppe, diameteren av svulsten er ca. 0,5 cm) og intratumorally injisert med 5 x 10
8 kopier av Lenti-shROC1 i LT -ROC1 gruppe eller 5 × 10
8 kopier av Lenti-shCONT i LT-CONT, henholdsvis. ShROC1 eller kontroll shRNA sekvenser var ifølge en tidligere studie [15]. Tumorstørrelse ble målt hver annen dag ved hjelp av et skyvelære, og tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av ligningen (L x W
2) /2 (hvor L og W representerer den lengste langsgående og tverrgående diameter, henholdsvis). Etter 7 uker observasjon, ble musene drept og tumor-xenografter ble fjernet, veiet og fotografert. Denne studien fulgte dyret håndtering og eksperimentelle prosedyrer og godkjent av Animal Care og bruk komité Shanghai First folks Hospital of Shanghai Jiao Tong University.
Statistiske analyser
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av Bonferroni t-test metode etter en-veis analyse av varians (ANOVA) for multi-gruppe sammenligning. To gruppesammenligninger ble analysert ved anvendelse av en t-test.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske vurderinger ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
Overuttrykte ROC1 Protein i BTCC vevsprøver og cellelinjer
I denne studien, må vi først oppdaget uttrykk for ROC1 protein ved hjelp av immunhistokjemi i 112 tilfeller av normale og BTCC vevsprøver, og seks cellelinjer. Våre data viser at ROC1 protein ble svakt uttrykt i 18 av 24 (75%) normal blære urothelium, mens ROC1 protein ble sterkt uttrykt i blærekreft vev (Fig. 1), dvs. blant disse 112 BTCC vevsprøver, ROC1 protein var moderat eller sterkt uttrykt i 29 (25,9%), og 66 (58,9%) prøver, henholdsvis. Dessuten ble ROC1 protein uttrykt i alle humane BTCC cellelinjer (RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, og EJ) sammenlignet med de primære humane urotelialceller (Fig. 1).
A og B, Immunhistokjemi (forstørrelse × 400). Farget vev microarray seksjoner ble scoret i fire grupper etter fargeintensitet. C, analyser Western blot av ROC1 uttrykk i ulike BTCC cellelinjer og normale urotelialceller (NUC).
Hemming av BTCC cellevekst Etter knockdown av ROC1 Expression
For å vurdere rollen av ROC1 i blærekreft, vi slått ned ROC1 uttrykk i BTCC cellelinjer ved hjelp ROC1 siRNA og en egge siRNA som kontroll. Våre data viste at ROC1 siRNA hell slått ned uttrykk for ROC1 protein i 253J og 5637 celler (figur 2A og B).
A, C, E, 253J celler. B, D, F, 5637 celler. Disse to cellelinjer ble transient transfektert med siROC1 eller siCONT i 24-120 timer, og deretter underkastet Western blot (A og B) analyser av ROC1 ekspresjon ved 72 timer etter transfeksjon, celle-levedyktighet CCK8 (C og D), eller kolonidannelse (E og F) assay. Representative resultater av tre uavhengige eksperimenter blir vist som gjennomsnitt ± SEM. **
P
. 0,01
Deretter vurderte vi effekten av siROC1 knockdown i disse blære kreft celler og funnet ut at siROC1 cellene vokste bemerkelsesverdig lavere enn for de siCONT celler (
P
0,01 på 72 timer, 96 timer og 120 timer, fig. 2C og D). Kolonidannelse analyse viste videre at antallet kolonier ble redusert til 5- til 10-fold i siROC1 celler sammenlignet med siCONT celler (
P
0,01, Fig. 2E og F).
ROC1 knockdown Arrested celler i G2-fasen av cellesyklusen
Vi er fast bestemt cellesyklus distribusjon følgende ROC1 knockdown i blæren kreftceller og fant at både 253J og 5637 celler etter ROC1 knockdown arrestert på G2-M fasen av cellesyklusen. Nærmere bestemt, 253J celler etter transfektert med ROC1 siRNA for 48, 72, 96, 120h økte G2-M-fase til 11,88 ± 0,27% 15,68 ± 0,56%, 16,8 ± 0,42%, og 10,8 ± 0,78%, henholdsvis, sammenlignet med 6 til 8% i kontrollcellene (figur 3A), mens 5637-celler var til 18 ± 1,41%, 35,5 ± 0,73%, 54,5 ± 2,12% og 46,27 ± 4,62%, henholdsvis, sammenlignet med 11 til 14% i kontrollcellene ( figur 3B). Disse dataene viser at G2-M arrest i begge cellene nådde en topp på 96h etter transfeksjon.
A og B, ROC1 knockdown indusert G2-M cellesyklus arrest i 253J (A) og 5637 (B) celler. Cellene ble transfektert med siROC1 eller siCONT for 48-120h, og cellesyklusprofil ble påvist ved anvendelse av FACS-analyser følgende propidium jodid (PI) farging. C og D, ROC1 knockdown indusert G2 cellesyklus arrest. 253J (C) og 5637 (D) celler ble transfektert med siROC1 eller siCONT for 96h og underkastet FACS-analyse etter fosfo-histon 3 (PH3) /PI dobbel farging. E og F, ekspresjon av cellesyklus-assosiert protein i 253J (E) og 5637 (F) celler ble undersøkt ved hjelp av Western blot-post-transfeksjon ved den angitte tidsintervall. Representative resultater av tre uavhengige eksperimenter er vist. Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SEM. **
P
. 0,01
Vi deretter undersøkt uttrykk for G2-M overgangsrelaterte regulatorer, dvs. G2-M overgang av cellesyklus er regulert av et kompleks av cdc2 og en B-type cyclin. Ja, våre data viste at Cdc2 og cyclin B1 uttrykk var vesentlig oppregulert etter ROC1 knockdown i både 253J (Fig. 3E) og 5637 celler (Fig. 3F). Vi har også fastslått at ekspresjon av CDK-inhibitorer, slik som p21 og p27, og fant at p21 og p27 var betydelig akkumulert på ROC1 knockdown i begge cellelinjer (figur 3E og F). Cyclin D1, en velkjent cellesyklusen regulator av G1 fase, ble også markert indusert av ROC1 knockdown i begge cellelinjer (figur 3E . F).
For ytterligere å undersøke ROC1 knockdown arrestert kreftceller i G2 eller M faser, utførte vi FACS analyser følgende fosfor-histon H3 (PH3) /propidiumjodid (PI) dobbel farging av disse cellelinjene. Histon H3 er en indikator på mitose når fosforylert ved Ser10 i M-fasen, men ikke i fase G2 [16]. Sammenlignet med siCONT celler, siROC1 viste mindre fosfor-histon H3-positiv farging i både 253J og 5637 celler (fig 3C og D), noe som indikerer at siROC1 stansede celler i G2-fasen snarere enn på M-fase. I samsvar med disse resultatene, western blot data viste at ROC1 knockdown redusert PH3 uttrykk (Fig 3E . F). Redusert uttrykk for PH3 protein og redusert mitotiske celler indikerer at ROC1 knockdown arrestert celler i G2 fasen, men hindret celler fra å komme inn i M-fasen.
ROC1 knockdown Induced blærekreft 253J Cell Senescence Gjennom p53 /p21 Pathway
Morfologisk ROC1 slått ned 253J celler ble forstørret og flatet, morfologi ofte observert i senescent celler (fig. 4A, topp paneler), men ikke dukket opp i 5637 celler. Vi har videre bestemt begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet (Fig. 4A, midtre panel), en spesifikk markør for senescent celler. Som vist på fig. 4B, omtrent 25% av 253J-celler ble farget positivt følgende 96h ROC1 siRNA transfeksjon, sammenlignet med mindre enn 4% positiv farging i kontrollcellene (
P
0,01). I tillegg vurderes vi fosfo-γH2AX ekspresjon ved hjelp av immuno fl uorescence flekker, som er en markør for celle senescens. Våre data viser at 253J celler transfektert med siROC1 hadde flere γH2AX brennpunkter sammenlignet med de siCONT celler (fig. 4A, nedre paneler), noe som ytterligere indikerer at ROC1 knockdown indusert 253J celler begynnende alderdom.
A og B, 253J celler ble transfektert med siROC1 eller siCONT for 96h, etterfulgt av morfologiske observasjon (A, toppfeltene, forstørrelse × 400), SA-β-gal farging (A, midtre paneler, forstørrelse × 400) og kvantifisert med positivt fargede celler (B) og immuno fl uorescence farging av fosfor-γH2AX (A, bunnplater, forstørrelse × 400). C, Expression of senescence-assosiert vei protein i 253J celler ble undersøkt ved hjelp av western blot etter transfeksjon ved de angitte tidsintervaller. D, ROC1, p53, p21 mRNA i 253J celler etter 72 timer etter transfeksjon ble undersøkt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Representative resultater av tre uavhengige eksperimenter er vist. Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SEM. **
P
. 0,01
p16 /RB og p53 /p21 akser er to store senescence-forbundet trasé som svar på ulike stressfaktorer. Siden p16-genet er homozygousely slettet i 253J celler [17], p16 protein var umulig å oppdage i 253J celler før og etter ROC1 siRNA transfeksjon (fig. 4C). Men begge total og fosforylert Rb proteinnivåer ble ikke samlet på ROC1 knockdown (fig. 4C), som indikerer at ROC1 knockdown-indusert 253J celle senescens er uavhengig av p16 /RB-genet pathway. Våre data viste signifikant oppregulering av p53 og p21 proteiner i siROC1 celler på 96h og 120h følgende ROC1 siRNA transfeksjon (fig. 4C), og
p53
sammen med
p21
mRNA oppregulering ble også observert ved hjelp kvantitativ real-time PCR (fig. 4D). Vår nåværende data indikerte at p53 /p21-genet sti mediert effekter av ROC1 knockdown på blærekreft celle senescence, siden 253J celler ikke uttrykker p16, men har en vill type p53, mens 5637 celler uttrykt mutert p53.
effekter av ROC1 knockdown på Hemming av tumorcellevekst Gjennom p21 Expression
for å vurdere om p21 er akkumulert i både G2 arrest og senescence indusert av ROC1 knockdown, vi fast bestemt på ytterligere rollen p21 i formidling virkningene av ROC1 siRNA på regulering av blærekreft cellevekst. Våre data viste at samtidig oppheving av p21 og ROC1 hjelp sirnas markert svekket p21 protein uttrykk (Fig 5A . B) og svekket celleveksthemming forårsaket av ROC1 knockdown i både 253J og 5637 celler (figur 5C . D). I 253J celler, viste SA-β-Gal flekker som knockdown av p21 uttrykk redusert frekvensen av ROC1 siRNA-indusert celle senescence (Fig. 5E), mens det i 5637 celler, ROC1 lyddemping indusert G2-M arrest ble markert redusert med p21 knockdown (fig. 5F).
253J og 5637 celler ble transfektert med de indikerte siRNA for 96h, og utsatt for western blot analyser (A og B), CCK8 analyse (C og D), analyserer begynnende alderdom med SA- β-gal-farging (E), og FACS-analyse med PI farging (F). Representative resultater av tre uavhengige eksperimenter er vist. Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SEM. **
P
0,01 og ***
P
. 0,001
Effekter av ROC1 siRNA på forordning av 5637 Cell xenografter dannelse og vekst
Vi har vist
in vitro
effekter av ROC1 knockdown i blærekreftcellelinjer. Vi søkte å bekrefte disse data i nakne mus xenografter. Som vist på fig. 6A 0,01). Immunhistokjemi farging av Ki67 indikerte at LT-ROC1 injeksjon redusert hårløse mus xenograft proliferasjon (fig. 6B). Den tumorvekt i LT-ROC1 xenotransplantater var signifikant lavere enn den til den LT-CONT gruppe (
p
0,05). Western blot data viste at p21 protein ble oppregulert i LT-ROC1 injeksjon gruppe (Fig. 6E).
A, Representative bilder av svulster isolert fra hårløse mus i hver gruppe 7 uker etter injeksjon av LTR og LTC. B, IHC-farging av xenografter vev med den angitte antistoff i begge grupper. C og D, tumorvekstkurven (C) og tumorvekt (D) i begge grupper. E, ROC1 og p21 protein i ekstrahert protein fra xenotransplantater i begge grupper ble bestemt ved hjelp av western blot-analyser. På slutten av forsøkene ble tumorvev fjernet fra hver mus og veiet. Søyler, gjennomsnittsvekt på 5 tumorer fra individuelle mus i hver gruppe; barer, SEM. *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
. 0,001
Diskusjoner
i denne studien, rapporterte vi at ROC1 protein ble overuttrykt i 112 blærekreft vevsprøver og 6 cellelinjer i forhold til normalt vev og celler. Knockdown av ROC1 uttrykk hemmet blære cellevekst og induserte G2 cellesyklus arrest og p53-avhengig celle senescence. Molekylært, knockdown av ROC1 uttrykk oppregulert uttrykk for p21, p27, cyclin B1 og Cdc2 proteiner. ROC1 knockdown-indusert 253J celler senescence ble formidlet gjennom p53 /p21-genet vei, og knockdown av p21 uttrykk delvis reddet ROC1 knockdown-indusert kreft veksthemming i BTCC celler. Våre naken mus xenograft gjort ytterligere bekreftet våre
in vitro
data. Foreliggende data tyder på at ROC1 spiller en viktig rolle i progresjon blærekreft, og målretting ROC1 protein er en potensiell anticancer strategi for blærekreft.
Tidligere studier viste ROC1 overekspresjon i forskjellige kreftformer og i forbindelse med tumorprogresjon [15], [18]. I den foreliggende undersøkelse, bekreftet vi disse dataene i blærecancer vev og cellelinjer. Vi vurderte ytterligere rolle ROC1 protein i blærekreft ved knockdown av ROC1 protein uttrykk i to forskjellige blærecancercellelinjer. Vi viste at ROC1 knockdown potente hemmet blærekreft cellevekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Mekanistisk ROC1 knockdown indusert cellesyklus G2 fase rest og celle-senescens i blærecancercellelinjer.
Cell syklus G2-M-fase er et vanlig cellesyklus kontrollpunkt mekanisme i respons til ytre påkjenninger og induksjon av G2-M rest er en nyttig strategi i behandlingen av forskjellige humane cancere [19]. Molekylært, Cdc2-kinase og cyklin B1 utgjør M-fase-fremmende faktor (MPF) som kontrollerer G2-M overgangs og M faseprogresjon [20], kinase aktivitet som er negativt reguleres av CDK-inhibitorer (CDKIs, for eksempel p21, p27) Cdc2 og hemmende kinaser (for eksempel WEE1) [21]. I vår nåværende studie fant vi at ROC1 knockdown bemerkelsesverdig indusert G2-M arrest ved oppregulering uttrykk for cyclin B1 /Cdc2 protein i både 5637 og 253J celler. Videre våre ytterligere data indikerte at ROC1 knockdown arrestert blære kreftceller på G2 fase, selv om de definerte mekanismene er uklare. Den tenkelig forklaring kan være at ROC1 knockdown indusert CRL inaktivering som skyldes opphopning av noen spesielle CRL-substrater (for eksempel p21, p27 og WEE1). Vår nåværende data viste at ROC1 knockdown indusert uttrykk for p21 og p27. I tillegg cyklin D1, en annen velkjent CRL substrat [22], ble også markert indusert ved ROC1 knockdown i begge cellelinjer. Vi har imidlertid ikke observere betydelige endringer i cyclin D1-forbundet G1-S-fasen arrest, som kan være siden ROC1 knockdown arrestert cellene ved G2-fase celler er forhindret fra å komme inn i G0-G1 fase.
Dess vi også avdekket at ROC1 knockdown indusert p53 villtype blærekreft 253J celler til alderdom gjennom en p53-avhengig måte. Induksjon av mobilnettet senescence ble ansett som en viktig svulst undertrykkende mekanisme [23], [24]. Ulike belastninger (slik som telomere dysfunksjon, onkogen aktivering, DNA-skade, og andre stimuli) kan alle initiere cellulære senescens [23]. Senescence er hovedsakelig mediert av to tumorsupressorproteinene pathways: p53 /p21 og p16 /pRB [23], [24]. Den aktuelle studien viste at ROC1 knockdown indusert betydelig cellealdring i p53 villtype 253J celler, men fremkalte ikke p53 mutert 5637 celler. Videre blokade av p53 /p21 sti av knockdown av p21 uttrykk betydelig lindres ROC1 knockdown-indusert alderdom. Disse funnene antyder at ROC1 knockdown-indusert senescens er assosiert med en funksjonell p53 /p21 pathway. Imidlertid Jia et al. viste at ROC1 knockdown-indusert senescence av lunge og livmorhalskreft cellelinjer i en p53- eller pRB- uavhengig måte [15]. Et annet lignende spørsmål er det som bestemmer celler til å gjennomgå cellesyklus arrest eller alderdom eller andre celledød typer. Den eksakte mekanisme er ikke kjent, og vi antar at dette valget kan være forbundet med cellelinje avhengighet (for eksempel
p
53 gen status, spesifisiteten av CRL substrater, varighet av stress, et.al) og intensiteten av ytre spenning [25] (for eksempel DNA-skade reaksjon, oksidativt stress, et.al). Dermed er videre studier for å avklare de definerte mekanismene som er ansvarlig for ROC1 knockdown-indusert blærekreft celledød.
I tillegg også observerte vi at ROC1 knockdown hemmer tumorvekst av 5637 celler i
in vivo
naken mus xenograft med liknende mekanismer. Ulike stadier av blærekreft viste differensial terapeutisk respons på strålebehandling og kjemoterapi [26]. En determinant faktor av terapeutiske mottakelighet er
TP53
genet status [27]. Celler med dysfunksjonell p53-protein viste økt motstand mot radioterapi eller kjemoterapi på grunn av redusert DNA-skade reaksjon [3], [26]. Denne studien viste at ROC1 knockdown hemmet blærekreft cellevekst uavhengig av p53 status. Dette resultatet kan ha en viktig innvirkning for behandling av blærekreft. ROC1 knockdown bruker genet forstyrrelser eller farmakologisk hemming kan være en ny tilnærming for å styrke respons av strålebehandling og kjemoterapi av blærekreftpasienter. Så vil videre studier undersøke slike tilnærminger i effektivt kontrollere blærekreft.
I konklusjonen, denne studien viste at ROC1 spiller en viktig rolle i BTCC progresjon, og ROC1 kan være en roman anti-kreft mål i BTCC. Videre studier som klargjør de detaljerte mekanismer for ROC1 engasjement i BTCC for å validere våre primære resultater.
