Abstract
Fedme, og spesielt visceral fedme, har vært forbundet med en økt risiko for å utvikle kreft samt høyere dødelighet etter diagnose. Virkningen av fedme på adipose-avledede stromale celler (ASC), som bidrar til dannelsen av tumor stroma, er ukjent. Her hypotese vi at visceral kilde og diett-indusert fedme (DIO) endrer ASC fenotype, som bidrar til svulsten fremme effektene av fedme. Vi fant ut at ASC isolert fra subkutan (SC-ASC) og visceral (V-ASC) hvitt fettvev (WAT) av lean (Le) og fedme (Ob) mus viste lignende mesenchymale celleoverflatemarkører uttrykk, og hadde sammenlignbare effekter på eggstokkene cancer celleproliferasjon og migrasjon. Overvektige og visceral avledet ASC proliferated tregere og utstilt nedsatt differensiering i adipocytter og osteocytter
in vitro
i forhold til ASC avledet fra subkutan WAT av magre mus. Intraperitoneal ko-injeksjon av eggstokkreft celler med overvektige eller visceral avledet ASC, men ikke lean SC-ASC, økt vekst av intraperitoneale ID8 tumorer sammenlignet med kontroller. Obese og v-ASC økt stromal infiltrasjon av inflammatoriske celler, inkludert CD3 + T-celler og F4 /80 + makrofager. Overvektige og visceral avledet ASC, men ikke mager SC-ASC, økt uttrykk av kjemotaktiske faktorer IL-6, MIP-2, og MCP-en når de ble dyrket med tumorceller. Samlet viser disse resultatene at overvektige og v-ASC har en unik fenotype, med mer begrenset proliferasjon og differensiering kapasitet, men forsterket ekspresjon av kjemotaktiske faktorer som reaksjon på maligne celler som støtter infiltrasjon av inflammatoriske celler og støtte tumorvekst og spredning.
Citation: Zhang Y, Nowicka A, Solley TN, Wei C, parikh A, Court L, et al. (2015) stromal celler avledet fra Visceral og Obese fettvev fremme vekst av eggstokkreft. PLoS ONE 10 (8): e0136361. doi: 10,1371 /journal.pone.0136361
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, UNITED STATES
mottatt: May 19, 2015; Godkjent: 31 juli 2015; Publisert: 28 august 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Ovarian Cancer Research Fund (LT /MDACC /01,2011) og American Cancer Society (RSG-14-159-01 ) til AHK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fedme øker risikoen og /eller dødelighet av mange kreftformer, inkludert endometrial, tykktarm, bukspyttkjertel, og eggstokkreft [1-5]. Overskudd av visceral hvite fettvev (WAT) har vist seg å være særegne toksisk, økende risiko og dødelighet uavhengig av kroppsmasseindeks (BMI) på mange kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene [5]. Et antall mekanismer har blitt identifisert til å gjøre rede for forholdet mellom fedme og kreft, slik som utskillelsen av adipokines, insulinresistens, og aromatisering av steroidhormoner for å øke sirkulerende østrogen [6-8]. Fettvev også inneholder en populasjon av tumor-tropisk adipose stamceller (ASCs) som understøtter dannelsen av tumorvaskulatur [9] [10]. Nylig rapporterte vi at human oment-avledede ASC fremme veksten og vaskularisering for livmorkreft xenotransplantater, sammenlignet med subkutant avledet ASC [11]. Men forskjeller i isolasjon tilnærming eller individuell variasjon kan ha påvirket ASC fenotype. Videre gjør studier i xenograft-modeller ikke rekapitulere virkningene av betennelsesceller i svulsten mikromiljøet, som er bedre modellert i en syngen modell. Omentum, en del av visceralt fett, er den hyppigst involvert stedet for eggstokkreft metastaser. Oment metastase er en spesielt kritisk problem i eggstokkreft, som har den høyeste tilbakefall og lavest overlevelse blant gynekologisk kreft. Mekanismen bak dette er ikke godt kjent. Dessuten er syngene modeller av intraperitoneal formidling godt etablert i eggstokkreft, men ikke livmorkreft. Derfor, for å forstå hvilken rolle ASC fra forskjellige anatomisk steder: subkutan og visceral fettvev, i eggstokkreft, undersøkte vi effekten av diett-indusert fedme (DIO) på disse forskjellige ASCs og deres rolle i tumorvekst i mageområdet ved ved hjelp av en syngene intra-abdominal murine modell av eggstokkreft.
In vitro Hotell og
in vivo
analyser ble brukt til å analysere ASC isolert fra subkutan (SC-ASC) og visceral (V-ASC) WAT av lean (Le) og fedme (Ob) mus å karakterisere virkningene av fedme og adipose depot og ASC fenotype.
Materialer og metoder
Cell kultur
ASC ble dyrket i α-minimum essensielt medium (α-MEM) inneholdende 20% FBS, L-glutamin, penicillin og streptomycin. ID8 og IG10 celler ble sjenerøst gitt av Katherine Roby [12]. ID8 og IG10-celler ble stabilt transfektert med ildflueluciferase og tomat-rød gener med bruk av en metode lentiviral [13] (pFULT vektoren ble vennligst tilveiebrakt av Dr.Jennifer Prescher). Dyrkede celler ble rutinemessig testet for levedyktigheten med trypan blå eksklusjon, og opprettholdt høy levedyktighet (mer enn 95%). For
in vivo
eksperimenter, minutt brøkdel av døde celler ble hovedsakelig fjernes ved vasking før trypsinering.
Isolering av SC-ASC og V-ASC
ASC ble isolert fra subkutan WAT og visceral WAT av C57BL /6 hunnmus matet med lav-fett diett (LFD) eller fettrik diett (HFD) i 15 uker. HFD og LFD ble kjøpt fra Forsknings Diet INC. Subkutan WAT ble tatt fra den bakre torso, og visceral WAT ble tatt fra retroperitoneal og gonadale depoter. WAT ble utsatt for mekanisk ødeleggelse, etterfulgt av 0,5 mg /ml kollagenase type I (Worthington Biochemical) og 50 U /mL dispase (Becton Dickinson) fordøyelse ifølge publiserte protokoller [11]. Fordøyd WAT ble sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. Supernatanten innehold adipocytter ble fjernet. Den resulterende cellepellet ble resuspendert i α-MEM inneholdende 20% FBS og filtrert gjennom 100 um celle sil (Becton Dickinson) og deretter gjennom en 40-mikrometer celle siler.
Karakterisering av SC-ASC og v-ASC
All ASC ble ekspandert
in vitro
og tidlig passaged som ble brukt for å karakterisere med bruk av flowcytometri for ekspresjon av de følgende celleoverflatemarkører: CD34, CD31, CD45, CD29, CD11b, CD73 , CD90, og CD105 (Becton Dickinson). Celle differensiering studier ble utført som beskrevet tidligere [14]. For adipocyttdifferensiering, konfluente celler i 6-brønn eller 24-brønners plate ble dyrket i adipogenic induksjon medium, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Mediatech) supplert med 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, 10 ug /ml insulin, 500 uM 3-isobutyl-1-metylxantin (Sigma-Aldrich), 1 uM deksametason (Sigma-Aldrich) og 200 uM indometacin (Sigma-Aldrich). Etter at cellene ble opprettholdt i induksjonsmediet i 72 timer ble mediet byttet til opprettholdelsesmedium adipogenic, Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, og 10 ug /ml insulin i 24 timer. Denne fremgangsmåten av 72 timer induksjon og vedlikehold 24 timer ble gjentatt to ganger. Etter den tredje induksjons cellene ble plassert i opprettholdelsesmedium for en total av 10 dagers inkubasjon. Vedlikehold media ble endret to ganger i uken. Celler ble deretter fiksert i 10% formalin i 10 minutter etterfulgt av 60% isopropanol. Oil Red O (Sigma-Aldrich) farging ble anvendt for å visualisere røde lipid vakuoler. For osteoblastdifferensiering, sammenflytende celler i seks-brønns plater ble dyrket i NH OsteoDiff Medium (Miltenyi) i 3 uker, med mediet endret to ganger i uken. Etter 3 uker ble cellene vasket 3 ganger med PBS og fiksert med forkjølt 100% metanol. Cellene ble farget med Alizarin rød S. Fem representative bilder fra hver brønn (tre brønner for hver ASC) ble tatt av Leica DMI6000B mikroskop og analysert av Inform programvare: regioner i rødt Alizarin eller Oil Red O farget ble definert på 4-6 bilder, og anerkjennelse programvaren ble brukt på alle bildene. Flekker i piksler ble kvantifisert for hvert bilde, og andelen av farging ble beregnet og gjennomsnitt fra alle bildene for en endelig prosentandel.
qPCR analyse
mRNA fra Ob /Le avledet SC- ASC eller v-ASC på forskjellige dager under adipogenese induksjon ble isolert ved anvendelse av TRIzol og omdannet til cDNA ved anvendelse av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen). Kvantitativ RT-PCR analyse ble utført basert på TaqMan primere /Universal PCR Master Mix (Invitrogen) plattformen ved hjelp av ABI 7900 arbeidsstasjon og SDS 2.4 programvare (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) og 2 ^ -Delta Ct-verdien ble brukt til analyse [15]
proliferasjonsanalyse
Luciferase-merket ID8 og IG10 celler ble sådd ut ved en tetthet på 500 celler per brønn i et BD Falcon 96-brønns plate alene eller i en:. 1 coculture med tidlig passeres ASC. Etter 24 timer, ble luciferase-ekspresjonen målt i 0,15 mg /ml D-luciferin. Etter 1 times inkubering ved 37 ° C, ble luminescens målt med et spektrofotometer (FLUOstar Omega, BMG Labtech). Mediet ble deretter erstattet, og målinger ble gjentatt annenhver dag inntil cellene nådde samløpet.
Migrasjon analysen
Betinget Medium (CM) fra tidlig passert subkutan eller visceral ASC av overvektige eller mager WAT ble samlet inn fra en 6-brønns plate som var belagt med 300.000 celler per brønn med serumfritt medium i 48 timer. ID8 og IG10 migrasjon ble analysert i ASC CM i en 24-brønns transwell (Corning Inc.) med 8-mikrometer porer. CM ble plassert i den nedre del av transwell og ID8 på den øvre del av transwell. Hver CM ble analysert i triplikat. Antall celler som hadde migrert til bunnen av transwell ble målt etter 8 timer ved farging membraner med en Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific), og deretter mekanisk fjerning av gjenværende celler på den øvre membranen. Celler som er festet til undersiden av membranen ble skilt fra membranen ved anvendelse av 2% deoxycholicacid. Den optiske densitet av den resulterende suspensjonen ble påvist ved en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA)-plateavleser (BioTek Instruments) avleses ved 590 nm i en 96-brønns plate [16].
sfæroide dannelsesbestemmelsen
totalt 40000 tidlig passert ASC eller eggstokk-cancer-celler ble sådd ut i 2 ml av sfæroide analysemedium (MEM med 0,1 mg /ml gentamycin, 1% penicillin /streptomycin, 10 ml B27, 10 ug FGF, og 10 ug av EGF fra Gibco) i lave festeplater for 5 dager og samlet som spheriod kondisjonerte medium (spheroid-CM). Sfæroide kulturer ble initiert ved poding av 100 kreftceller eller ASC i 100 ul av medium bestående av 50% ASC eller kreftcelle sfæroide-CM og 50% faste sfæroid analysemedium i 96-brønners plater. Fjorten dager senere ble 7,5 ul av MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid) tilsatt til hver brønn. Sfærer ble tellet manuelt med en diameter på minst 50um å utelate enkeltceller eller rusk. Hver prøve ble gjentatt i 8 brønner.
Luminex analyser
spheroid CM beskrevet ovenfor ble analysert for angiogenese /vekst eller cytokin /chemokin faktor panel inkludert IL-6, SDF-1, MCP- 1, TNF-a, IL-10, MIP-1a, 1b, MIP-2, og VEGF med Luminex 100 ved hjelp av en Milliplex MAP-sett (EMD Millipore Corp, Billerica, MA, USA). Data ble behandlet av Bioplex manager programvare.
In vivo
studier
Dyreforsøk ble gjennomført i henhold til MD Anderson Institutional Animal Care og bruk komité-godkjent protokoll (120.914.932). Alle mus ble oppbevart og behandlet i henhold til institusjonelle standarder. Musestammer C57BL /6 var fra Jackson Lab. For DIO induksjon [17], HFD D12492 (60 kcal% fett) og LFD D12450B (10 kcal% fett) fra Forsknings dietter ble brukt. Alle musene i våre eksperimenter ble gitt 2-4% isofluran for bedøvelse og dybden av anestesi ble overvåket ved respirasjonsfrekvens og fravær av uttak refleks til footpad klemme. For å evaluere effekten av fedme på kreft totalt 10
6 luciferase-uttrykkende ID8 i 200 ul PBS ble injisert intraperitonealt (IP) inn i HFD eller LFD mus, og tumorer ble dyrket i 10 uker fedme for tumorvekst. For å undersøke nærmere de forskjellige påvirker av visceral avledet ASC og subkutan avledet ASC på kreft, ble seks uker gamle magre mus bedøvet som før og injisert intraperitonealt med 1 × 10
6 luciferase-uttrykke ID8 celler og 1 x 10
6 tidlige passasjer av SC-ASC eller V-ASC fra overvektige eller magert mus i magen (5 mus per gruppe). Luciferase-signaler ble målt for å bestemme den tumorstørrelsen ved IVIS Imaging system 200-serien (Xenogen Corporation) to ganger i uken etter 4 dager, og bilder ble analysert ved hjelp av levende bilde programvare (Sylinder Lifesciences). På rundt dag 50, ble musene avlivet ved innånding overdose av isofluran, ble ascites samlet, og tumornoduler nærheten magen ble gjenvunnet fra avlives mus. Ascites ble sentrifugert, og røde blodcellelyse (eBioscience) ble anvendt for å fjerne røde blodceller i cellepellets; Dette ble etterfulgt av 10 ml a-MEM med 20% FBS for nøytralisering. Celler fra ascites ble lagret ved -80 ° C og ble senere analysert ved strømningscytometri for celleblanding. Immunfluorescens på formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt ble utført etter antigen henting, vasking med 0,2% Triton X-100, og blokkerer i serumfritt Protein blokk (DAKO); Dette ble etterfulgt av inkubasjon med primære antistoffer (4 ° C, 12 timer) og sekundære antistoffer (romtemperatur, 1 time) i PBS inneholdende 0,05% Tween-20. De primære antistoffene som ble brukt var som følger: kanin-anti-Ki-67 (Thermo Scientific, 1: 200), biotinylert GSL I-isolectin B
4 for tumorkarene farging (Vector, 01:50), rotte-anti-F4 /80 (Abcam, 1: 100), rotte anti-CD3 (Abcam, 1: 100), og kanin anti-perilipin (Cell Signaling Technology, 1: 100). Sekundær esel Alexa 488-konjugert (1: 150) IgG var fra Invitrogen, Cy3-konjugert (1: 300) IgG var fra Jackson Immunoresearch, og streptavidin-Cy3 (1:20) var fra Invitrogen. Kjerner ble farget med Hoechst 33258 (Invitrogen).
MicroCT Scan på mus SC-WAT og V-WAT
For å bestemme volumet av viscerale og subkutane fettvev, brukte vi MATLAB (Mathworks, Natick, MA) til å lage en in-house program. MicroCT skanninger ble anskaffet ved hjelp (skanner) og tatt på (kVp, mA, FOV, slice tykkelse). CT-bilder for hver mus ble importert som en serie av DICOM-bilder. Regionen av interesse (ROI) for adipose volum besluttsomhet var begrenset til magen. Følgelig ble de øvre og nedre grenser av ROI definert fra bunnen av diafragmaet til den overlegne aspektet av de femorale hodet. Neste, vi trakk manuelt elliptiske konturer på innsiden av magemuskulaturen som strekker seg baktil i ryggvirvel kroppen slik at visceral fettvev var inneholdt innenfor ellipsen og underhud fettvev var utenfor ellipsen. Ellipsene ble trukket på toppen, øvre kvartil, midtre nedre kvartil, og bunn skiver av avkastningen. I løpet av denne prosessen, bestemt vi den optimale plassering og størrelse av ellipsen for å separere visceral fettvev og subkutane fettvev så mye som mulig. Programmet går så lineært interpolert disse konturer for resten av skivene, effektivt separere ROI i 2 regioner. Den vedlagte av ellipsen område inneholdt i bukhulen, som omfattet visceral adipose vev og organer. Området utenfor til ellipsen inneholdt subkutane fettvev.
Endelig programmet beregnet fettvev volum ved automatisk å telle antall voksler som tilsvarer fettvev, og multiplisert med volumet av hvert volumelement. Subkutan adipose besto av vev mellom – 50 og 150 Houncefield enhet (HU) og visceral adipose besto av vev mellom -50 og 200 HU. Områdene ble valgt ut basert på visuell analyse av HU fordelingen av fettvev.
Bilde oppkjøp og dataanalyse
Bilder ble kjøpt opp av Vectra Automated multispektrale Imaging System (Perkin Elmer) og analysert ved Inform programvare: regioner av interesse ble definert på 4-6 bilder, og gjenkjennelse programvare ble brukt til å klassifisere alle bildene. Fluorescens av interesse i piksler ble kvantifisert for de ulike kreft kategorier av hvert bilde, og andelen av fluorescens fra målet svulsten Kategorien ble beregnet og i gjennomsnitt fra alle bildene av en svulst for en endelig prosentandel. Minst 10 bilder per lysbilde ble kvantifisert. Tre tumorer ble analysert fra hver av ID8 eksperimentelle grupper. Statistisk analyse ble utført med Mann-Whitney test, to-tailed.
Flowcytometri
ASC eller celler fra svulsten eller ascites ble resuspendert i PBS supplert med 2% FBS (10
6 celler /100 ul /farging reaksjon). 1 ug av hvert antistoff ble tilsatt til cellesuspensjonen og inkubert ved 4 ° C i 30 minutter. Merkede cellepopulasjoner ble deretter analysert ved Gallios flowcytometer (Beckman Coulter) LSRII (BD Biovitenskap) med Kaluza eller FlowJo programvare. Prøve oppkjøpet ble akkompagnert med bruk av kontroll unstained, ensfarget farget, og isotype kontroller for å finne riktig spenning, kompensasjoner, og plassering av porter for datainnsamling. Ascitesceller ble pre-gated for å utelukke smuss, celleklumper, kontaminerende polymorfonukleære celler, røde blodceller, og døde celler basert på DAPI farging. Celle komposisjoner ble analysert basert på Texas Red (Texas Red kanal) og følgende IgG kloner: APC-anti-CD34 (RAM34), PE-Cy7-anti-CD31 (MEC 13.3), APC-Cy7-CD45 (30-F11) eller Texas Red, PE-Cy7-anti-CD11b, og APC-F4 /80, og de tilsvarende isotype kontroller (BD Biosciences). Isotyper og posisjonene til tidligere preget blodkreft og endothelial bestander på tomter [18,19] ble brukt til å sette porttidsavgrensninger.
Statistiske analyser
For analyse av
in vivo
data, tumorstørrelse målt som luminescens intensitet ble forvandlet av basen 10 logaritmer til tilnærmet normalitet for lineær modell. En lineær blandet effekt modell med gjentatte målinger ble brukt til å evaluere forskjeller mellom gruppene (Le-V-ASC, Le-SC-ASC, Ob-V-ASC, Ob-SC-ASC, og ID8 bare) på tvers av flere tidspunkter. Vår endelige modell inkludert den faste effekten av gruppe (5 grupper), og dag (samspillet mellom gruppen og dag var ikke signifikant), vilkårlig effekt av mus nestet i gruppen, og gjentatte målinger med den første-ordens auto regressivt kovarians struktur. Vi undersøkte normalitet av restene av normal quantile-quantile plot (Q-Q tomten) [20]. Analysen av
in vitro
data ble utført ved hjelp av SAS 9.3 (Gary, NC). In vitro resultater ble rapportert som betyr +/- standardfeil av gjennomsnittet.
P
verdier ble oppnådd ved hjelp av tosidige Mann-Whitney test. Den log-rank test ble brukt for å sammenligne tid til deteksjon av sykdom ved hjelp av luciferase bildebehandling.
Resultater
Fedme øker veksten av ID8 eggstokkreft
For å avgjøre om fedme har en direkte effekt på veksten av murine eggstokkreft, vi brukte en syngene murine modell av eggstokkreft i C57Bl /6-mus som er utsatt for DIO. C57BL /6 hunnmus ble matet en fettrik diett (60% av kcal fra fett) eller en lav-fett diett (20% av kcal fra fett). Etter 4 måneder ble mus foret med en fettrik diett hadde nesten dobbelt så stor kroppsvekt av mus foret med lav-fett diett (gjennomsnittlig kroppsvekt, 37,6 g vs 22,6 g) (figur 1A). For å avgjøre om mus med DIO hadde økt visceral WAT samt subkutan WAT, ble volumet av visceral WAT målt med microCT skanninger. Mus med DIO inneholdt mer enn en 16,7 ganger høyere volum av visceralt fett og 6,5 ganger høyere volum av underhudsfett enn mager mus (figur 1B). Musene ble deretter isografted med 1 x 10
6 ildflue luciferase-uttrykke ID8 ovarian kreft celler intraperitonealt. 11 dager, luciferaseaktiviteten var signifikant høyere i mus med DIO enn i magre mus (figur 1C og 1D), viser at diett-indusert fedme akselererer ID8 ovarian tumorer.
A, C57BL /6 mus ble foret med en HFD eller LFD i 4 måneder. N = 10 per gruppe. Mus som ble matet en HFD hadde høyere kroppsvekt enn mus som ble matet en LFD (gjennomsnittlig kroppsvekt, 37,6 g vs 22,6 g). B, CT av HFD eller LFD mus (HFD: bety visceral WAT: 7.2 cm
3 og mener SC WAT 6,6 cm
3; LFD: bety visceral WAT: 0,4 cm
3 og mener SC WAT 1.0 cm
3) og HU distribusjon av visceralt og subkutant fett fra HFD eller LFD mus. Gule stjernene indikerer visceralt fett, og rød stjerne indikerer underhudsfett. Røde vertikale linjer betegner de øvre og nedre vales som definerer HU intervall svarende til fettvev. Feil barer, SEM. ***,
P
0.001 (Student
t
test). C, representant HFD og LFD mus med luciferase signaler fra svulster. Mus var i.p. isografted med 1 x 10
6 luciferase-uttrykke ID8 tumorceller. Tumorer ble målt ved hjelp av luciferase signaler deteksjon innenfor abdominal side av mus. D, Diet indusert fedme akselerert ID8 ovarietumorer. Tumorvekst i HFD og LFD mus i 11 dager.
Isolering og karakterisering av ASC fra subkutan og visceral adipose fra magre og overvektige mus
For å avgjøre om fedme effekter ble formidlet av ASC , vi isolert og karakterisert SC-ASC og v-ASC av tumorfrie mus foret med en HFD eller LFD, som beskrevet ovenfor. ASC ble isolert i henhold til tidligere publiserte protokoller [11]. Morfologisk, SC-ASC og V-ASC fra overvektig eller mager mus viste en lignende mesenchymale fenotype (Fig 2A). Celleoverflaten markør uttrykk var preget i tre eksemplarer med flowcytometri etter celler ble passert 3 ganger (S1 fig og S1 Table). Alle ASC var negative for endothelial markør CD31, monocytter markør CD11b, og blodkreft avstamning markør CD45. Mesenchymale markør, CD29 ble uttrykt på alle fire ASC linjer, mens mesenchymale markører CD90 og 105 var tilstede på de fleste av SC-ASC og Le-V-ASC men sjeldnere i Ob-V-ASC. Disse resultatene viser at det var ingen tegn til forurensning med ikke-mesenchymale avstamning celler fra fettvev og at SC og Le-V-ASC hadde lignende celleoverflaten markør uttrykk. Ob-v-ASC viste seg å ha mindre ekspresjon av CD90 og 105 som er karakteristisk for MSC. Neste, for å avgjøre om SC-ASC og V-ASC fra overvektige eller magert mus opprettholde samme vekst, ble celleproliferasjonsprosesser analyser utført. Lean SC-ASC (Le-SC-ASC) spredte seg raskere enn ASC fra andre kilder (
P
0,05, S2 figur).
A, morfologi av heftende celler som viser likheten SC-ASC og V-ASC fra overvektige og magre mus. Scale bar, 1 pm. B, adipogenese av SC-ASC og v-ASC. Differensierte celler ble farget med olje rød-O og kvantifisert ved andelen piksler olje rød-O i bilder. Feil barer, SEM. **
P
0.01 (Mann-Whitney test). Scale bar, 100μm.C, Osteogenesis av SC-ASC og V-ASC. Differensierte celler ble farget med alizarin rød S. Feilfelt, SEM. **
P
0.01 (Mann-Whitney test). Scale bar, 100 pm. D, Kvantitativ RT-PCR-analyse av mRNA-nivåer for gener hallmarking adipocyttdifferensiering og lypolysis normalisert til 18s RNA-ekspresjon i ASC indikert ved start og etter 14 dager etter induksjon adipogenese. Feil bar. SEM
In vitro
ASC differensiering
For å finne ut om SC-ASC og V-ASC fra overvektig eller mager mus utstillings multipotency
in vitro
, ble adipocyttuttrykte og osteocyte avstamning differensieringsanalyser utført som rapportert tidligere (fig 2B og 2C) [11]. Adipocyte kvantifisering var basert på olje Red O farging av lipid dråpe etter adipogenesen induksjon. SC-ASC dannet flere Oil Red O-positive lipid dråper enn V-ASC. (Fig 2B,
P
0,01). Osteogenesis ble detektert ved bruk av Alizarin rød farging for å påvise alkalisk fosfatase, som indikerer differensiering osteoblastisk (figur 2C). Osteogenesis var også mer robust for SC-ASC enn for V-ASC (
P
0,01) med en trend mot fedme svekke osteogene differensiering potensial. Kombinert, disse funnene tyder på at SC-ASC har høyere multipotency enn V-ASC og at overvektige WAT-avledet ASC har mer begrenset differensiering potensial enn mager WAT-avledet ASC.
For å finne ut om vev kilde og fedme påvirket adipogenic programmering, uttrykk for adipocyte (adipsin, leptin, GLUT4), lipolyse (ATGL) og nøkkelen adipogenesen regulere transkripsjonsfaktor (PPAR-γ) ble profilert i ASC ved baseline og etter 14 dager adipocyte induksjon (fig 2D). Vi fant at Le-SC-ASC gikk 30 gangers induksjon av den kritiske adipogensis regulerende gen, PPAR-γ følgende adipocyttdifferensiering induksjon, i motsetning ASC fra andre kilder. Nivået på PPAR- γ var fortsatt høy etter differensiering i Ob-V-ASC gruppe, men inneholdt noen Olje-Red-O-farging (Fig 2C). Dette kan skyldes økt lipolyse, noe som gjenspeiles i høyere nivåer av ekspresjon i ATGL Ob-v-ASC. Adipocyte gener inkludert adipsin, leptin og GLUT4 ble uttrykt på mye høyere nivåer i Le-SC-ASC, i samsvar med vår observasjon at SC-ASC differensierte mest robust i adipocytter. Lipolyse regulerer gen ATGL var høyest i obese visceral avledet ASC.
In vitro
analyse av ASC og eggstokkreft co-kulturer
For å finne ut om ASC har en direkte mitogen effekt på ondartede celler, vi analyserte spredning av ID8 og IG10 C57 avledet eggstokkreft cellelinjer
ex vivo
. Luciferase-merket ID8 og IG10 celler ble ko-dyrket med eller uten ASC. Tumorcelle-proliferasjon ble målt med anvendelse av luciferase avbildning. ASC fra alle kilder hadde en beskjeden pro-proliferativ effekt på ID8 og IG10 celler (S3A og S3b Fig). For å avgjøre om ASC påvirke invasiv potensialet for eggstokkreft celler, ble en
ex vivo
migrasjon gjennom Boyden Chamber Transwell-analyse utført. ASC fra alle kilder, sammenlignet med eggstokkceller alene, økt migrasjon av eggstokkreft celler (
P
0,01). (S3C og S3D figur)
Ondartede eggstokkreft celler samlet og form sfæroide -lignende strukturer i ascites fluid som kan lette omental metastase [21]. Vi har tidligere rapportert at benmargs avledet MSC forbedre dannelsen av brystkreft sfæroider [22]. Når ASC ble dyrket som kuler på 100 celler belagt per brønn uten tumorceller, Ob-V-ASC dannet vesentlig flere kuler som ASC fra alle andre kilder (figur 3A). For å bestemme effekten av ASC på eggstokkreft sfæroide dannelse, ble ID8 og IG10 celler dyrket som sfæroider med eller uten ASC sfæroide-CM. ID8 celler dannet signifikant flere kuler i alle ASC-spheroid-CM enn ID8 celler alene (figur 3C,
P
0,05). IG10 celler dannet vesentlig flere kuler da dyrket med Ob-V-ASC spheroid-CM (Fig 3B og 3D). I sammendrag, fedme og vev kilde synes å påvirke ASC sfæroide formasjon, og støtte av IG10 eggstokk-kreft-celle avledet sfæroider.
Celler ble sådd ut i en tetthet på 100 celler totalt 100 ul i 96-brønners plater og dyrket i 14 dager. Cellene ble deretter farget med MTT, og sfæroider ble tellet manuelt. Hvert forsøk ble utført in triplo. A, Kvantifisering av ASC spheroid i vanlig medium. B, Sammenligning av IG10 spheroid dannelse i ulike ASC spheroid-CM. Representative bilder vist på 10x forstørrelse. Scale bar, 100 pm. C, Kvantifisering av ID8 spheroid analysen i ulike ASC spheroid-CM. (Vist er gjennomsnitt ± SEM, ***,
P
0,001, Student
t
test, to tailed.). D, Kvantifisering av IG10 spheroid analysen i ulike ASC spheroid-CM. (Vist er gjennomsnitt ± SEM, *,
P
0,05; **
P
0,01, ***,
P
0,001, Student
t
test, to halet).
Effekt av overvektige og mager WAT avledet ASC på
in vivo
veksten av eggstokkreft
å undersøke
in vivo
effekter av vev kilde og fedme på ASC i eggstokkreft, ASC var co-injisert med luciferase-uttrykke ID8 tumorceller i lean kvinnelige C57BL /6 mus intraperitonealt (1: 1-forhold, 10
6 /hver). Tumorveksten ble overvåket med luciferase avbildning. Høyere nivåer av luciferase-aktivitet ble detektert i mus injisert med Ob-SC-ASC, Le-v-ASC og Ob-V-ASV sammenlignet med mus injisert med ID8 celler alene (tabell 1 og fig 4A-4D). Tumorvekst i mus injisert med Le-SC-ASC var lik tumorvekst hos mus som fikk ID8 celler alene. Ob-SC-ASC forfremmet tumorvekst mer enn gjorde Le-SC-ASC (
P
= 0,049). Ob-SC-ASC og Ob-V-ASC hadde lignende tumor fremme effekter (
P
= 0,84). I tillegg ble svulster hos mus injisert med Le-SC-ASC oppdaget senere enn var svulster hos mus injisert med ASC fra andre kilder (
P
= 0,024, fig 4C).
ASC var coinjected med luciferase-uttrykkende ID8 tumorceller inn i C57BL /6 mus intraperitonealt (1: 1 forhold, 10
6 /hver). N = 5 per gruppe. En sammenligning av tumorbyrde målt ved luciferase uttrykk ved abdominal side mellom Ob-SC-ASC og Le-SC-ASC grupper. Feil bar: 90% konfidensintervall. B, Sammenligning av tumorbyrden målt ved hjelp av luciferase-ekspresjon ved abdominal side mellom Ob-v-ASC og Le-v-ASC-grupper. Feil bar: 90% konfidensintervall. C, Sammenligning av startfasen mellom grupper. D, Luciferase signal måling av mage side i musene på dag 46.
Effekt av ASC på svulsten mikromiljøet
For å bestemme effekten av ASC på in-vivo tumorcelleproliferasjon, kvantifisert vi antallet Ki-67-positive celler innenfor ID8 tumorer under anvendelse av immunfluorescens (figurene 5A og S4). Antallet bildeelementer som representerer positive hyppighet av celler for Ki-67 var høyere i ASC injisert tumorer, men det var ikke forskjellig mellom fete og magre grupper (figur 5A og 5B). Svulster fra Ob-SC-ASC gruppen inneholdt litt høyere Ki67 signaler enn Ob-V-ASC gruppen (P 0,05) (figur 5A og 5B). Vi hadde tidligere vist at ASC støtte dannelsen av blodkar i livmor xenografter [11]. For å avgjøre hvorvidt disse ASC virkninger på tumor vaskularitet modifiseres ved fedme og vev kilde, ble tumorsnitt farget med GSL I-isolectin B4, som spesifikt bindes til endotele celler (figur 5A). Vaskulariteten var høyere i alle ASC injisert svulster i forhold til ID8 svulster alene med et betydelig høyere antall skip ved co-injeksjon av Ob-SC-ASC enn Le-V-ASC eller Ob-V-ASC (
P
