Abstract
Kreft stilk-lignende celler (cscs) /kreft initiere celler (CIC) er definert som en liten bestand av kreftceller som har høy tumorigenicity. Videre cscs /CIC er resistente mot flere kreft terapier, og cscs /CIC er derfor antatt å være ansvarlig for kreft tilbakefall etter behandling og fjernmetastaser. I epithelial tilfeller kreft i eggstokkene (EOC), er sykdommen tilbakefall etter kjemoterapi ofte observert, noe som tyder på eggstokkene cscs /CIC er involvert. Det er fire store histologiske subtyper i EOC, og serøs adenokarsinom og klar celle adenokarsinom er høy grad av malignitet. Vi analyserte derfor eggstokkene cscs /CIC fra eggstokkene carcinoma cellelinjer (serøs adenokarsinom og klar celle adenokarsinom) og primær eggstokkreft celler i denne studien. Vi isolert eggstokkene cscs /CIC som et aldehyd dehydrogenase en høy (ALDH1
høy) befolkning fra 6 EOC cellelinjer (3 serøse adenokarsinomer og 3 klare celle adenokarsinomer) av ALDEFLUOR analysen. ALDH1
høye celler viste større sfære dannende evne, høyere tumorigenitet og større invasive evne, noe som indikerer at eggstokkene cscs /CIC er anriket i ALDH1
høye celler. ALDH1
høye celler kan også bli isolert fra 8 av 11 primær eggstokkkreft prøver. Immunhistokjemisk farging viste at høyere ALDH1 uttrykk nivåer i eggstokk kreft tilfeller er relatert til dårligere prognose i begge serøs adenokarsinom saker og klare celle adenokarsinom tilfeller. Til sammen tyder resultatene på at ALDH1 er en markør for eggstokkreft cscs /CIC og at uttrykket nivået av ALDH1 kan være en roman biomarkør for prediksjon av dårlig prognose
Citation. Kuroda T, Hirohashi Y, Torigoe T , Yasuda K, Takahashi A, Asanuma H, et al. (2013) ALDH1-High Ovarian Cancer Stem-lignende celler kan isoleres fra Serous og Clear Cell adenokarcinomceller, og ALDH1 Høy Expression er assosiert med dårlig prognose. PLoS ONE 8 (6): e65158. doi: 10,1371 /journal.pone.0065158
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 08.02.2013; Godkjent: 22 april 2013; Publisert: 06.06.2013
Copyright: © 2013 Kuroda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (tilskudds tall 16209013, 17016061 og 15659097) for Praktisk anvendelse Forskning fra Japan Science and Technology Agency, og for kreft forskning (15-17 og 19-14) fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan, Ono Cancer Research Fund (NS) og Takeda Science Foundation (til YH). Dette arbeidet ble støttet delvis av National Cancer Center Research and Development Fund (23-A-44). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en ondartet sykdom med høy dødelighet, og er den fjerde vanligste årsaken til kreft dødsfall hos kvinner over hele verden. [1], [2] Obscure og uklare symptomer gjøre påvisning av eggstokkreft i tidlig stadium vanskelig. [3] Vanligvis er eggstokkreft relativt følsom for førstelinje kjemoterapi basert på platina /taxan. [4] Klinisk komplett respons (CR) kan ofte oppnås ved cytoreduserende kirurgi og kjemoterapi i avanserte kreftpasienter på eggstokkene; Men de fleste av pasientene med fremskredet stadium få tilbakefall av sykdommen som er årsaken til den høye dødelighet av denne sykdommen. [5] Noen terapeutiske kandidater av molekylære målet legemidler for eggstokkreft var blitt testet, men merkbare forbedringer i prognosen ble ikke nådd. [2], [6].
Nyere fremskritt i kreft forskning har avdekket at kreft er sammensatt av en heterogen populasjon av celler, og at bare en liten populasjon av celler som kalles kreft stamceller lignende celler (cscs) /kreft -initiating celler (CIC) har høy tumor-initiering potensial (kreftstamcelle hypotese). Cscs /CIC er definert som en liten populasjon av celler som har (1) høy tumorigenicity, (2) multiple differensiering evne og (3) selvfornyelse evne. [7] – [9] Resultater av fersk studie har også vist at cscs /CIC er relatert til kreft tilbakefall og motstand mot stråling eller cellegift. [10], [11] Derfor er cscs /CIC antatt å være ansvarlig for kreft tilbakefall og fjernmetastaser, og eliminering av cscs /CIC er derfor uunnværlig for herding kreft.
Det finnes flere tilnærminger for å identifisere cscs /CIC fra kreft i en rekke organer vev. [12] Disse metodene inkluderer (1) bruk av merket celleoverflaten som CD44
+ CD24
– /lowESA
+ [13], CD133
+ [14], CD44
+ CD117
+ [15], og CD166
+ [16], (2) side populasjonen (SP) analyse [17], karakterisert ved at cellepopulasjon som har evnen til å pumpe ut et medikament (Hoechst33342 [18 ] eller Dye Cycle Violet [19]) gjennom ATP-bindende kassett transportør er å anse som cscs /CIC, og (3) ALDEFLUOR assay basert på nivået av aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) enzymaktivitet. [20].
funksjon av intracellulær ALDH er å katalysere oksidasjon av aldehyd, og ALDH spiller derfor en viktig rolle i cellulær homeostase. Nyere studier har vist at både normale og kreftceller med høye nivåer av ALDH1 aktivitet har potensial til å fungere som stamceller og muligheter for selvfornyelse evne og motstandsdyktige egenskaper. [20] -. [22]
Også i ovarialcancer (EOC), har noen forskere antydet nytten av ALDH1 aktivitet for å identifisere cscs /CIC. Eksistensen av celler med høy ALDH-aktivitet (ALDH1high celler, sammenlignet med ALDH1low celler) er også vist i EOC cellelinjer og i kliniske prøver. [23] – [25] Korrelasjonen mellom ALDH1 aktivitet og prognosen for pasienter, er imidlertid fremdeles kontroversiell i EOC. [26] Samtidig, relevansen til ALDH1 uttrykk for hvert histologisk subtype av EOC er ikke avklart ennå.
I denne studien har vi identifisert og evaluert stemness av ALDH1
høye celler i serøs adenokarsinom og klar celle adenokarsinom i ovarier, ikke bare fra etablerte cellelinjer, men også fra primære eggstokkreft celler. Vi har også statistisk analysert sammenhengen mellom ALDH1 uttrykk og klinisk utfall for eggstokkreft pasienter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Mus ble vedlikeholdt og eksperimenterte på i henhold til retningslinjer og etter godkjenning av komiteen fra Sapporo Medical University School of Medicine, forsøk med dyr senteret under lisensnummer 08-006. Noen dyr funnet usunn eller syke ble raskt avlivet. Alle studier ble godkjent av Institutional Review Boards (IRB) i Sapporo Medical University Hospital og IRB av Hakodate Goryokaku Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter i henhold til retningslinjene i Helsinkideklarasjonen.
Cellelinjer og kultur betingelser
I denne studien, 3 eggstokkene serøs adenokarsinom cellelinjer (AMOC-2, HUOA og OVCAR-3) og 3 eggstokk-adenokarsinom klare celle-cellelinjer (ES-2, RMG-1 og TOV21G) ble anvendt. AMOC-2 (vennlig levert av Dr. Yabushita, Institutt for obstetrikk og gynekologi, Aichi- Medical University, Aichi, Japan) [27], HUOA (vennlig levert av Dr. Ishiwata, obstetrikk og gynekologisk sykehus, Ibaraki, Japan) [28 ], OVCAR-3 og TOV-21G (ATCC, Manassas, VA, USA) ble dyrket i RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). ES-2-celler (ATCC) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Sigma-Aldrich). RMG-1 celler (JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) ble dyrket i DMEM /F-12 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Hvert medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Cellene ble inkubert i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
Isolering av Primær kreft celler fra kliniske prøver
Alle studier ble godkjent av Institutional Review Boards (IRB) Sapporo Medical University Hospital og IRB Hakodate Goryokaku Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene i henhold til retningslinjene i Helsinkideklarasjonen.
Solide svulster ble kuttet i fragmenter, vasket i fosfatbufret saltvann (PBS), og sentrifugert ved 2000 rpm i 10 minutter. Da celleaggregater ble inkubert ved 37 ° C i ca. 30 minutter med 2 mg Liberase ™ forskning klasse (Roche, Basel, Sveits) i 10 ml Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM, Life Technologies) inntil separert til enkle celler. Resultatene oppnådd ved disse fremgangsmåtene celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri, som beskrevet nedenfor.
ALDEFLUOR-analysen og isolering av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS)
Vi brukte en ALDEFLUOR analysesett (Stem Cell Technologies ™, Vancouver, BC, Canada) for å bestemme ALDH1 aktivitet av celler i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble suspendert i ALDEFLUOR analysebuffer inneholdende 1 ^ mol /l pr 1×10
6 celler av ALDH substratet, bor-dipyrromethene-aminoacetaldehyd (BAAA), og inkubert i 50 min ved 37 ° C. Hver prøve ble behandlet med 50 mmol /l av en ALDH-spesifikke inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), som en negativ kontroll. Fargede celler ble analysert ved BD FACSAria ™ II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Celler ble farget med 1 pg /ml propidiumjodid for å evaluere deres levedyktighet før analysen.
For isolering av epitelceller fra solide eggstokkreft prøver, vi sortert epiteliale kreftceller ved bruk av anti-CD326 (Ep-CAM) APC antistoff (BD Biosciences). Vi brukte anti-CD326 mikroperler (BD Biosciences) og en autoMACS system (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) for å berike epitelceller fra maligne ascites av eggstokkreft tilfeller før ALDEFLUOR analysen.
Cell Cycle Analysis og
in vitro
Cell vokse Analyse
ALDH1
høye og ALDH1
lave celler ble direkte festet med 70% etanol etter sortering. Deretter ble de resuspendert i PBS inneholdende 250 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich) i 30 minutter ved 37 ° C og farget med 50 ug /ml propidiumjodid i 10 minutter ved 4 ° C i mørket. Fargede celler ble analysert med en FACSCalibur (BD Biosciences), og dataene ble analysert ved hjelp av Mod-Fit cellesyklus analyse program.
For
in vitro
cellevekst analysen ALDH1
høy-celler og ALDH1
lave celler isolert fra AMOC-2 og RMG-1-celler ble sådd på en 6-brønners plate ved 5 x 10
4 celler per brønn. Etter inkubasjon i 48 og 96 timer, ble cellene fjernet av trypsin og levedyktige celler ble bestemt med Countess® (Life Technologies).
Sphere dannende analyse /enkelt Cell Sphere dannende analysen
ALDH1
høye og ALDH1
lave celler ble isolert ved FACS og deretter dyrket i 6-brønners ultra-lave vedlegg overflate retter (Corning, Tewksbury, MA, USA) ved 1000 celler per brønn. For enkelt celle sfære dannende analysen, ble begge ALDH1
høy og ALDH1
lav sortert i 96-brønnen ultra-lave feste retter (Corning) på en enkelt celle per brønn. Cellene ble dyrket i stamcelle medium, serum-fritt DMEM /F12 (Life Technologies) supplert med N-2-supplement (Life Technologies), 20 mg /ml rekombinant human epitelial vekstfaktor (Life Technologies), 10 mg /ml humant basisk fibroblast vekstfaktor (Sigma-Aldrich), 4 ug /ml heparin (Sigma-Aldrich), 4 mg /ml bovint serumalbumin (Life Technologies), 20 g /ml human insulin-sink løsning (Life Technologies), og 2,9 mg /ml glukose (Sigma-Aldrich). [29] morfologisk endring ble observert daglig under et lysmikroskop i 14 dager.
In vivo
tumorigenitet
Ordnet ALDH1
høye og ALDH1
lave celler ble resuspendert ved 1,0 x 10
2, 1,0 x 10
3 og 1,0 x 10
4 celler i 100 ul PBS og Matrigel (BD Biosciences) blanding (1: 1). Så hver blanding ble injisert subkutant i høyre /venstre midten bak områder av seks uker gamle kvinnelige ikke-obese diabetic /alvorlig kombinert immun-mangel (NOD /SCID) mus (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japan) under innånding anestesi ved isofluran. Tumor initiering og progresjon ble observert hver uke inntil Musene ble avlivet etter 7 uker etter injeksjon. Ekstern tumorvolumet ble beregnet som 0,5 × Dmax × (dmin)
2 [mm
3] (Dmax: lange aksen, dmin: korte aksen av masse).
immunhistokjemisk farging for Ovarian Cancer Tissue
Immunhistokjemisk farging av ALDH1 og Ki-67 ble utført med formalinfikserte, parafininnstøpte deler av 123 ovarialcancer vev (62 serøse adenokarsinomer, 37 klare celle adenokarsinomer, 18 endometrioid adenokarsinomer og 6 mucinkjertler adenokarsinomer) som beskrevet tidligere. [30] [31] Antigen gjenfinning ble utført ved koke seksjoner i 120 ° C i 5 minutter i en mikrobølgeovn i forvarmet 0,01 mol /l natriumcitrat (pH 6,0). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i etanol i 10 min. Etter blokkering med 1% fettfri tørrmelk i PBS (pH 7,4), ble seksjonene omsatt med mus anti-ALDH1 monoklonalt antistoff (1: 250, Sigma-Aldrich) eller mus anti-Ki-67 monoklonalt antistoff (1: 100 , DAKO, Glostrup, Danmark) i 1 time, etterfulgt av inkubering med biotinylert anti-muse IgG (Nichirei) i 30 min. Deretter ble seksjonene farget med setreptavidin-biotin kompleks (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan), etterfulgt av inkubasjon med 3,3′-diaminobenzidin anvendt som et kromogen og mot farging med hematoksylin. Cytoplasmatisk farging ble ansett som positivt for ALDH1, og atomkjerner flekker ble ansett som positivt for Ki-67. For evaluering av ALDH1 farging, ble sakene delt inn i to grupper (ALDH1
høy gruppe og ALDH1
lav gruppe) ved median (median for serøs adenokarsinom median og klarcellet adenokarsinom å være henholdsvis 20% og 15%,) .
Matrigel invasjonen analysen
Den invasive evne av celler ble evaluert ved bruk matrigel invasjons kamre (BD Biosciences). Isolerte ALDH1
høye og ALDH1
lave celler (1,0 × 10
4) ble belagt i hvert øvre kammeret i serumfritt DMEM. De ytre kammer ble fylt med DMEM inkludert 10% FBS som kjemotiltrekkende. Cellene ble inkubert i 48 timer, og invasive cellene ble farget med Hematoxylin, montert på lysbilder, og telte 400 ganger øvre felt ved lysmikroskopi.
Statistical Analysis
Statistisk analyse, data montering og grafikk ble utført ved hjelp av SPSS programvarepakke ver.19 (SPSS, Chicago, IL, USA). Data er vist som gjennomsnitt ±
SD
på minst 3 uavhengige eksperimenter, og t-test ble anvendt for å vurdere statistisk signifikante forskjeller (p 0,05). Total overlevelse (OS), definert som intervallet fra datoen for første diagnose til datoen for død av sykdomsprogresjon og progresjonsfri overlevelse (PFS), definert som intervallet fra datoen for første diagnose til datoen for sykdomsutvikling, ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test. Sammenslutninger av ALDH1 uttrykk med klinisk stadium, ble lymfeknutemetastaser og formidling analysert ved Fishers test.
Resultater
Isolering av ALDH1
høye Celler fra EOC cellelinjer
flere metoder for å isolere cscs /CIC har allerede blitt beskrevet [12], og et aldehyd dehydrogenase en høy populasjon (ALDH1
høy) identifisert ved ALDEFLUOR analysen ble beskrevet til å bli beriket med cscs /CIC. [20] Vi analyserte derfor eggstokkkreft cellelinjer ved ALDEFLUOR analyse for å isolere eggstokkene cscs /CIC. Vi undersøkte 3 menneskelige eggstokkene serøs adenokarsinom cellelinjer (AMOC-2, HUOA og ovčar-3) og tre menneskelige klare celle adenokarsinom cellelinjer (ES-2, RMG-en og TOV-21G) (figur 1). ALDH1
høy befolknings ble identifisert i alle ovarialcancer linje celler, og forholdet mellom ALDH1
høye celler varierte fra 0,7% for ES-2 celler til 7,9% for TOV-21g celler. Vi kunne isolere ALDH1
høye celler stabilt fra 4 cellelinjer (AMOC-2, ES-2, RMG-en og TOV-21G), og vi brukte derfor disse cellelinjene for videre analyse.
ALDH1
høye celler ble detektert i 3 serøse adenokarsinom-cellelinjer (AMOC-2, HUOA og OVCAR-3) og i 3 klare celle adenokarsinom-cellelinjer (ES-2, RMG-1 og TOV-21g). SSC-A: enkelt strand konformasjon analyse. BAAA: boron-dipyrromethene- aminoacetaldehyd. FITC-A: fluoresceinisotiocyanat analyse. Prosenter i boksene indikerer ALDH1
høye celle forholdstall. Diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en ALDH-spesifikk hemmer, ble brukt som en negativ kontroll.
Karakterisering av ALDH1
høye Cells
Siden cscs /CIC er kjent for å danne kuler i flytende dyrkningsforhold [29], analyserte vi ALDH1
høye celler ved en sfære dannende analysen. Totalt 10
3-celler per brønn ble sortert og inkubert i en 6-brønns plate i et forankrings-uavhengig miljø. På dag 10, ALDH1
høye celler avledet fra AMOC-2-celler viste større sfære dannende evne enn for ALDH1
lave celler. Lignende resultater ble oppnådd fra ES-2-celler, RMG-1-celler og TOV-21g-celler (figur 2A). Siden kuledannende assay er ikke egnet for kvantifisering av forholdene mellom cscs /CIC i ALDH1
høye celler, utførte vi en enkelt celle sfære dannende analyse. Sphere dannelse ble observert i 4,86% av brønnene av ALDH1
høye celler avledet fra AMOC-2 celler og i 3,13% av brønnene av ALDH1
høye celler avledet fra ES-2 celler (figur 2B). På den annen side, brønner av ALDH1
lave celler avledet fra både AMOC-2 og ES-2 celler viste ingen sfære formasjon.
En Sphere dannende analyse Ett tusen ALDH1
høye celler og ALDH1
lave celler ble dyrket i en flytende tilstand. Kulene ble talt på dag 10. Forstørrelse av bilder: × 100. Kriterium for spheroid størrelse: over 100 pm. Hver verdi er gjennomsnittlig antall sfæroider ± SD. * P-verdiene. B Enkel celle sfære dannende assay Ordnet ALDH1
høy-celler og ALDH1
lave celler ble dyrket i flytende tilstand ved en enkelt celle per brønn. Kulene ble talt på dag 12. Bare ALDH1
høye celler fra AMOC-s og ES-2 celler initiert encellete kuler. Forstørrelse av bilder: × 200. Hver verdi er gjennomsnittlig prosent av sfæroider ± SD. C Matrigel invasjonen assay Images: Matrigel-invadere celler avledet fra ALDH1
høy /lav celler av ES-2 og TOV-21g celler. Forstørrelse av bilder: × 100. Hver verdi er gjennomsnittlig antall invaderende celler ± SD. * P-verdiene.
Vi deretter undersøkt invasjonen evne ALDH1
høy og ALDH1
lave celler ved matrigel invasjonen analysen. ALDH1
høye celler avledet fra alle fire linje celler viste større matrigel invaderende evne enn gjorde ALDH1
lave celler (figur 2C).
cellesyklus status for ALDH1
høye celler og at ALDH1
lave celler ble analysert. Forholdene mellom ALDH1
høye celler i S-fasen og G2 /M fase var større enn forholdet mellom ALDH1
lave celler i S-fasen og G2 /M fase (figur 3A). Cell vokse analyse viste at ALDH1
høye celler avledet fra AMOC-2 og RMG-1 celler hadde høyere vokse priser enn de ALDH1
lave celler (figur 3B).
En celle syklus analyse ALDH1
høye og ALDH1
lave celler ble analysert av en cellesyklus analyse. Grafen viser forholdene mellom cellene i G0 /G1 fase, S-fasen og G2 /M-fasen. B Cellevekst analyse Vekst egenskapene ALDH1
høye celler og ALDH1
lave celler ble undersøkt. Hver verdier er gjennomsnittlig antall celler ± SD.
Høyere tumorigenitet av ALDH1
høye Cells enn for ALDH1
lave Cells
For å adressere
in vivo
tumorigenicity av ALDH1
høye og ALDH1
lave celler fra EOC cellelinjer, xenograft transplantasjon i NOD /SCID mus ved ALDH1
høy og ALDH1
lave celler avledet fra AMOC-2 og RMG-1-celler ble utført (figur 4A, 4B og 4C). Som vist i tabell 1, ble tumorer observert i 5 av 5 mus (10
4 celler injeksjon), 4 av 5 mus (10
3-celler injeksjon) og 2 av 5 mus (10
2 celler injeksjons ) der xenotransplantasjon av ALDH1
høye celler avledet fra AMOC-2-celler ble utført. På den annen side, ble svulster observert i kun 3 av 5 mus (10
4 celler injeksjon) og 2 av 5 mus (10
3-celler injeksjon) hvori xenotransplantasjon av ALDH1
lave celler ble utført. Videre vekst av svulster som stammer fra AMOC-2 ALDH1
høye cellene var betydelig raskere enn for svulster som stammer fra AMOC-2 ALDH1
lave celler (Figur 4C). Lignende resultater ble oppnådd for RMG-1 celler (Figur 4B og 4C).
En ALDH1
høy /lav svulster avledet fra AMOC-2 celler. B ALDH1
høy /lav svulster avledet fra RMG-1 celler. Bilde: NOD /SCID mus som ble injisert med 1,0 × 10
3 ALDH1
høy /lav celler og i hvilke svulster observert på begge sider av ryggen. Histologiske bilder: Hematoxylin-Eosin flekker (H-E, venstre panel), ALDH1 immunhistokjemisk farging (midtre panelet), Ki-67 immunhistokjemisk farging (høyre panel) av ALDH1
høy /lav svulster. Forstørrelse av bilder: × 400. C Vekstkurver av ALDH1
høy /lav svulster avledet fra AMOC-2 og RMG-1 celler. Venstre kolonne: AMOC-2 celler, 1,0 × 10
3 injeksjon. Middle kolonne: AMOC-2 celler, 1,0 × 10
2 injeksjon. Høyre kolonne: RMG-1 celler, 1,0 × 10
3 injeksjon. Hver verdi er gjennomsnittlig tumorvolum ± SD. * P-verdiene. D immunreaktivitet til ALDH1 eller Ki-67 av ALDH1
høy /lav svulster avledet fra AMOC-2 og RMG-1cells Hver verdi er middelverdien positiv prosent ± SD. * P-verdier.
Histologiske aspekter av svulster som stammer fra ALDH1
høye celler og ALDH1
lave celler som ble isolert fra AMOC-2 og RMG-1 celler ble undersøkt ( Figur 4A og 4B). Svulster som stammer fra AMOC-2 ALDH1
høye celler og AMOC-2 ALDH1
lave celler viste dårlig differensiert adenokarsinom og det var ingen signifikant forskjell. Tilsvarende svulster avledet fra RMG-1 ALDH1
høye celler og RMG-en ALDH1
lave celler viste dårlig differensiert klart celle adenokarsinom. Immunhistokjemisk farging viste at det var ingen signifikant forskjell i ALDH1-positiv hastighet mellom svulster avledet fra AMOC-2 ALDH1
høye celler og svulster avledet fra AMOC-2 ALDH1
lave celler, mens svulsten avledet fra RMG-en ALDH1
høye celler viste betydelige høyere ALDH1 positive priser enn for svulst avledet fra RMG-1 ALDH1
lave celler (Figur 4D). Videre svulster avledet fra AMOC-2 ALDH1
høye celler og RMG-1 ALDH1
høye celler viste signifikant høyere positive priser for Ki-67 (MIB-1) enn de av svulster avledet fra AMOC-2 ALDH1
lave celler og RMG-en ALDH1
lave celler (Figur 4D).
Identifikasjon av ALDH1
høye celler i Primær EOC Samples
for å oppdage ALDH1
høye celler i primær eggstokkkreft, analyserte vi elleve kliniske materialer ved ALDEFLUOR analysen (5 tilfeller av faste eggstokkreft celler og 6 tilfeller av ondartet ascites av eggstokkreft tilfeller, oppsummert i tabell 2). CD326-positive epitelceller ble identifisert i solide eggstokkreft vev, og de positive prisene varierte fra 8,1% til 81,0% (figur 5A, øvre paneler). ALDH1
høye celler ble påvist i 4 av de 5 tilfellene, og positive ALDH1
høye celle prisene varierte fra 0,9% til 12,0% (figur 5A, nedre paneler). Videre ble ALDH1
høye celler oppdages i CD326-positive celler avledet fra eggstokkreft ascites i 4 av de 6 sakene, og de positive tallene for ALDH1
høye celler varierte fra 1,7% til 4,2% (figur 5B). Derfor ALDH1 aktivitet bestemmes ved hjelp av ALDEFLUOR analysen kan være en nyttig metode for isolering av cscs /CIC fra primær eggstokkreft celler.
En analyse av primær solid eggstokkreft celler Øvre panel viser CD326 farging. Prosent .indikatorer positiv rate for CD326 celler. Nedre panel viser ALDEFLUOR analyse av CD326-positive celler. Venstre: Pasient No.1, ved scenen Ic klart celle adenokarsinom. Høyre: Pasient No.3, ved scenen Ic endometrioid adenokarsinom. B Analyse av primære kreftceller fra ascites CD326-positive valg ble gjort før ALDEFLUOR analyse. Venstre: Pasient No.4, ved scenen IIIc serøs adenokarsinom. Høyre: Pasient No.6, gjelder stadium IIIb klarcellet og endometrioid adenokarsinom. CD326: Epiteliale celleadhesjonsmolekyl (EpCAM). APC: allofykocyanin området. Prosent score i boksene indikerer CD326-positive eller ALDH1-aktivitetsforhold.
Association of High Expression Nivå ALDH1 er med dårlig prognose
Det er totalt 123 epitelial eggstokkreft vevene ble immunhistokjemisk farget med anti-ALDH1 antistoff (tabell 3, figur 6A). Medianer av ALDH1-positive priser i serøs adenokarsinom saker og klare celle adenokarsinom tilfellene var 20% og 15%, henholdsvis. Vi har derfor delt sakene inn i to grupper, ALDH1
høy gruppe og ALDH1
lav gruppe, ifølge medianverdier. Som vist i tabell 3, var det ingen signifikant korrelasjon av ekspresjonsnivået av ALDH1 med alderen, med hver FIGO klinisk stadium. Høy uttrykk nivå ALDH1 viste ingen signifikant korrelasjon med avanserte stadier (stadium III + IV), T faktor eller lymfeknutemetastase i begge serøs adenokarsinom saker og klare celle adenokarsinom tilfeller. Log-rank-test viste at høyere ekspresjonsnivå av ALDH1 er forbundet med dårligere prognose med en betydelig forskjell i operativsystemet til pasienter med serøs adenocarcinoma (P = 0,006) og OS av pasienter med lett celle adenokarsinom (P = 0,047) enn de til nedre uttrykk nivå ALDH1 (figur 6B). Høyere nivå av ekspresjon ALDH1 viste en tendens til kortere PFS enn for lavere ekspresjonsnivå av ALDH1, men forskjellene var ikke signifikante (serøs adenokarsinom: P = 0,062; klar celle adenokarsinom: P = 0,058).
A HE farging og ALDH1 immunhistokjemisk farging av primær eggstokk serøs adenokarsinom (til venstre) og primær eggstokk klart celle adenokarsinom (høyre) Øvre venstre panel: HE farging av ALDH1
høye prøven. panel øverst til høyre: ALDH1 immunhistokjemisk farging av ALDH1
høye prøven. Nedre venstre panel: H-E farging av ALDH1
lave prøven. høyre panel Nedre: ALDH1 immunhistokjemisk farging av ALDH1
lave prøven. Forstørrelse av bilder: × 400. B Log-rank test for ALDH1
høy /lav grupper av eggstokkreft serøs adenokarsinom og klare celle adenokarsinom pasienter. Serøs adenokarsinom: 62 saker /klar celle adenokarsinom: 37 tilfeller. Tilfeller i ALDH1
høy gruppen er saker med positiv ratio for ALDH1 på over 20% for serøs adenokarsinom tilfeller og 15% for klare celle adenokarsinom tilfeller. Venstre: kolonne: progresjonsfri overlevelse (PFS). Høyre kolonne: total overlevelse (OS). * P-verdier.
Diskusjoner
I denne studien isolert vi eggstokk cscs /CIC med høy tumorigenicity av ALDEFLURO analysen. En ALDH1
høy befolkning kunne bli isolert, ikke bare fra eggstokkreft cellelinjer, men også fra primær eggstokkreft prøver. Flere metoder for isolering av cscs /CIC har blitt rapportert. Faktisk, ovarian cscs /CIC har blitt isolert ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert den ALDEFLUOR analyse [25], side populasjon (SP) analyse [32], [33], og bruk av CD133
+ [34], CD44
+ CD24
– [35] og CD24
+ celler. [36] Det er imidlertid en kontroversiell rapport som viser at et CSC /CIC da ikke virker i visse typer celler. [37], [38] Det er derfor viktig å validere cellepopulasjonen isolert ved CSC /CIC markører av flere typer analyser. I denne studien fikk vi bekreftet at ALDH1
høy befolknings hadde høyere tumorigenicity og større sfære dannende evne. Disse observasjonene tyder på at ALDH1
høye celler vi brukt i denne studien er beriket med cscs /CIC. Det har vært noen rapporter om vellykket isolering av cscs /CIC fra primly eggstokkreft celler. Vi isolert ALDH1
høye celler fra 8 av 11 primær eggstokkkreft. Vi kunne ikke analysere ALDH1
høye celler fra primær eggstokkreft på grunn av begrensning av celle tall; derimot, er vår tilnærming et mulig og lovende metode for å isolere cscs /CIC fra primær eggstokkreft.
Store histologiske subtyper av EOC er serøs adenokarsinom, klarcellet adenokarsinom, endometrioid adenokarsinom og mucinous adenokarsinom, og disse undertyper er kjent å ha forskjellige egenskaper i risikofaktor for carcinogenese, molekylære biologiske aspekter og så videre. Mer informasjon om de enkelte undertyper er nødvendig for å forbedre overlevelse av pasienter. Serøs adenokarsinom er histologi subtype med verste prognosen; men er serøs adenokarsinom tilfeller ofte diagnostisert på avansert stadium. Clear celle adenokarsinom er gradvis økende opp til nesten 12% av EOC i asiatiske land, og sammenligning av sakene i samme stadium av 3 histologiske undergrupper (klarcellet adenokarsinom, endometrioid adenokarsinom og mucinous adenokarsinom) avslørte at klarcellet adenokarsinom er de fattigste prognose i alle stadier. Derfor er klart celle adenokarsinom antas å være den høyeste karakteren EOC, nylig. [39], [40] Serous adenokarsinom saker ble i hovedsak analysert i tidligere studier, og det har vært få studier hvor klare celle adenokarsinom saker ble analysert. [23] – [25] I denne studien analyserte vi ikke bare serøs adenokarsinom tilfeller, men også klare celle adenokarsinom tilfeller. Derfor vil disse opplysningene bringe innsikt ikke bare for serøs adenokarsinomer, men også mest høyeste grad klare celle adenokarsinomer.
Vi fant ut at 4 EOC cellelinjer, inkludert 3 klare celle adenokarsinom linjene var positive for sfære formasjon med 1000 celler /godt. På den annen side er bare to cellelinjer (aMoC-2 og ES-2) viste sfære dannelse i enkelt celle sfære analyse. Disse resultatene indikerer at cscs /CIC, som har evnen til å danne en kule fra bare en celle, er anriket i ALDH1
høy-celler; men prosenter av cscs /CIC er ikke så høy selv i ALDH1
høye bestander. Dette resultat indikerte at ALDEFLUOR analysen er bare en surrogatmarkør for cscs /CIC og at kombinasjonen av ALDEFLUOR analysen med andre markører kan være en bedre tilnærming til å isolere cscs /CIC.
I tidligere studier av immunhistokjemisk farging, motstridende resultater når det gjelder sammenslutning av ALDH1 uttrykk med prognosen i EOC ble oppnådd. Chang
et al
. rapportert at ALDH1 uttrykk korrelerer med gunstig prognose i serøs eller ikke-serøs ovarialcancer [26], mens Deng
et al
. og Wang
et al
.
