PLoS ONE: mikroRNA La-7F hemmer tumorinvasjon og metastasering av målretting MYH9 i Human Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

microRNAs (mirnas) er viktige regulatorer som spiller nøkkelroller i tumorigenesis og tumorprogresjon. En tidligere rapport har vist at la-syv familiemedlemmer kan fungere som tumor suppressors i mange kreftformer. Gjennom miRNA array, fant vi at la-7F ble nedregulert i de svært metastatiske potensielle magekreft cellelinjer GC9811-P og SGC7901-M, sammenlignet med sine foreldrecellelinjer, GC9811 og SGC7901-NM; imidlertid mekanismen var ikke klar. I denne studien undersøker vi om la-7F fungerer som en tumor suppressor å hemme invasjon og metastasering i mage kreft.

Metodikk /Principal

Real-time PCR viste reduserte nivåer av la-7F uttrykk i magekreft med spredning vev og cellelinjer som er potensielt svært metastatisk. Cell invasjon og migrasjon ble betydelig svekket i GC9811-P og SGC7901-M cellelinjer etter transfeksjon med la-7f-etterligner. Nude mus med xenograft modeller av magekreft bekreftet at la-7f kunne hemme magekreft metastaser in vivo etter transfeksjon av lentivirus pGCsil-GFP- la-7f. Luciferase reporter-analyser viste at la-7f direkte binder til 3’UTR av MYH9, som koder for myosin IIA, og real-time PCR og Western blotting videre indikert at la-7f downregulated ekspresjonen av myosin IIA på mRNA og proteinnivåene .

Konklusjon /Betydning

Vår studie viste at overekspresjon av la-7F i magekreft kunne hemme invasjon og migrasjon av magekreftceller gjennom direkte rettet mot svulsten metastaseassosierte genet MYH9. Disse data tyder på at la-7F kan være en roman terapeutisk kandidat for magekreft, gitt sin evne til å redusere celle invasjon og metastase

Citation. Liang S, Han L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, Guo C, et al. (2011) mikroRNA La-7F hemmer tumorinvasjon og metastasering av målretting MYH9 i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10,1371 /journal.pone.0018409

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

mottatt: 27 september 2010; Godkjent: 07.03.2011; Publisert: 18 april 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 30801330, nr 30871143, nr 81030044)) og National Basic Research Program of China (No. 2010CB529300, nr 2010CB529306). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den vanligste gastrointestinal malignitet i Øst-Asia, Øst-Europa, og deler av Sentral- og Sør-Amerika, og er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1]. Utbredt metastase har vært en viktig årsak til den dystre utfallet av GC pasienter. Metastase er en komplisert, flertrinns prosess hvor kreftceller migrere fra det primære neoplasmer til et fjernt sted [2]. Prosessen starter når primærtumorceller å invadere tilstøtende vev, etterfulgt av celler som kommer inn i blodstrømmen (intravasation), translocating gjennom vaskulaturen, som kommer ut fra blodårer (ekstravasasjon) i det omkringliggende vev parenchyma, initiere mikrometastaser og endelig prolifererende å danne makroskopiske sekundær tumorer [3]. En av de kritiske regulatorer som er involvert i denne prosessen er en mikroRNA (miRNA) [4].

microRNAs (mirnas) er en klasse av endogene og små ikke-kodende regulatoriske RNA som regulerer gener ved post- transkripsjonsnivået [5]. Moden mirnas kan bli transkribert av RNA polymerase II og blir generert fra sekvensiell behandling av primære miRNA transkripsjoner av drosha og dicer; de da tjene som posttranskripsjonelt regulatorer av genuttrykk gjennom komplementær baseparing til messenger RNA [6]. Mange rapporter viser at mirnas spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, herunder celledifferensiering, spredning, apoptose, stress motstand, fettstoffskiftet, tumorigenesis og tumormetastase [7], [8], [9].

den la-7 familien er en konservert familie av miRNAs. La-7 opprinnelig ble observert i nematoden Caenorhabditis elegans [10], og fjorten medlemmer har blitt funnet å tidspunkt [11]. Nylig ble ekspresjonsnivåene til mange la-7-familiemedlemmer funnet å være redusert i en rekke kreftformer. For eksempel, la-7 er nedregulert i lungekreft, melanom, og hode og nakke plateepitel karsinom, mens overekspresjon av la-7 kan hemme veksten av kreft celler [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Flere onkogener som RAS, MYC, og HMGA2, er direkte mål av la-7 [19], [20], [21]. La-7F er ett medlem av utleid-7 familien. Tidligere studier har vist at la-7F er oppregulert i primær brystkreft og fremmer angiogenese [22]; nedregulering i PAH [23] ble forårsaket av kronisk hypoksi eller monocrotaline i rotter, og nivået ble redusert i plasma vesikler av NSCLC [24]. I tillegg kan la-7F påvirke celleproliferasjon ved å målrette Kallikrein-relaterte peptidaser (KLKs), en familie av serin proteaser som har vist seg å være dysregulerte i flere maligniteter, inkludert kreft i eggstokkene [25].

lab har tidligere identifisert en gruppe forskjellig uttrykt mirnas mellom GC9811 og GC9811-P-celler gjennom høyprofilerte mikroRNA chip analyser som inneholder la-7F [26]. Under den videre karakterisering av utleid-7F i ulike kreftcellelinjer, fant vi at la-7F fungerer som en metastase lyddemper. Den økede ekspresjon av la-7F kan undertrykke GC celle invasjon og migrering in vitro og in vivo. Ved bioinformatikk analyse, vi identifisert at MYH9, som koder for en myosin IIA tung kjede involvert i markedsføringen av kreft celle migrasjon eller invasjon, som en antatt la-7f mål. Senere forsøk bekreftet at la-7F kan nedregulere myosin IIA uttrykk ved å målrette den 3’UTR av MYH9, som gir et mulig mål for GC-behandling.

Materialer og metoder

Tissue samling

Primær mage tumorvev, tilstøtende ikke-tumor mage vev og fjerne metastatisk adenokarsinom vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Xijing Hospital of Digestive Diseases i Xi’an, Kina. Alle prøver ble klinisk og patologisk vist seg å være korrekt merket. Pasienter som tilbyr prøvene for studien signert informert samtykke former.

Cell kultur

Den menneskelige mage kreft cellelinjer GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M ble bevart i vårt eget laboratorium og ble dyrket i RPMI1640 (HyClone), supplert med 10% føtalt bovint serum. (FBS, GIBCO), 100 enheter /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5% karbondioksyd-inkubator

RNA ekstraksjon og real-time PCR

QRT-PCR ble utført for å bestemme uttrykket nivåer av potensielle la-7F målgener. Total RNA ble ekstrahert fra vev eller dyrkede celler ved hjelp TRIZOL reagens (Invitrogen Life Technologies). Komplementært DNA (cDNA) ble generert ved hjelp av en TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-Time PCR-analyser ble utført med en TaqMan Micro-RNA-analyse kit (Applied Biosystems). Primer av la-7F ble kjøpt fra Ambion (MI0000437). Primer av MYH9 sekvensen ble utformet ved hjelp Primer Express programvare (versjon 1.5). Primeren-MYH9 sekvens: (Forward) 5’AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 «(revers) 5’TGACCACACAGAACAGGCCTG3».All protokollene ble utført i henhold til produsentens anvisninger. Uttrykket nivået av la-7F var normalisert til 5S (Forward: 5’GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 «;

Omvendt: 5’GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3′). Uttrykket nivået av MYH9 var normalisert to18S (Forward: 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA3 «;

Omvendt: 5’GCTGGAATATCCGCGGCT3′) PCR og datainnsamling ble utført på en iCycler (Bio-Rad).. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer

Vektor konstruerer og Lentivirus Produksjon

pri-la-7F sekvensen ble konstruert som følger:. (Forward) HSA-la-7F-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (revers) HSA-la-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Sekvensen ble amplifisert og klonet inn i pGCsil-GFP Vector (GENECHEM) for å generere pGCsil-GFP- la-7f. Negativ kontroll var PGC FU-RNAi-NC-LV. Virus emballasje ble utført i HEK 293T-celler etter kotransfeksjon av 20 ug pGCsil-GFP-la-7f vektor med 15 ug av emballasje plasmidet pHelper 1,0 vektor og 10 ug av konvolutten plasmidet pHelper 2,0 vektor ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virus ble høstet 48 timer etter transfeksjon, og virale titere ble bestemt.

oligonukleotid bygging

la-7f etterligner, la-7F hemmer og negativ kontroll siRNA oligonukleotider ble chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co, Ltd). De oligonukleotider brukes i disse studiene var has-la-7F ligner: 5’UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3’and 5’CUAUACAAUCUACCUCAUU3 «;

Ligner negativ kontroll: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUT3’and5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 «, har-la-7F inhibitor: 5’AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 «. MircoRNA inhibitor negativ kontroll: 5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 «

Cell transfeksjon

Cellene ble dyrket til 80% til 90% konfluens etter blir sådd ut i 6-brønns plater og ble transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. For transient transfeksjon, ble cellene i hver brønn av en 6-brønns plate transfektert med 12,5 ul miRNA inhibitor eller 7,5 ul miRNA ligne oligonukleotider. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene høstet for videre eksperimentering. For stabilt transfekterte celler, ble celler transfektert med lentivirus på 30% -50% konfluens. Målceller (1 x 10

4), inkludert GC 9811-P og SGC7901-M-celler ble infisert med 1 x 10

6 rekombinante lentivirus-overførende enheter i nærvær av 6 ug /ml polybrene (GENECHEM) .

Invasion analysen

invasiv evne av cellene ble analysert ved hjelp Transwells (8-mikrometer porestørrelse, Corning Costar Corp). De Transwells ble satt inn i 24-brønners plater. Først ble 0,1 ml Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) lagt inn på plateoverflaten og inkubert i 2 timer, og deretter ble supernatanten ble fjernet. Ferskt trypsinert og vaskede celler (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) ble suspendert i RPMI1640 inneholdende 1% føtalt bovint serum. Deretter ble 100 ul av cellesuspensjonen (1 x 10

5-celler) ble tilsatt til det øvre kammer av hvert innsatsen som var belagt med Matrigel. Deretter ble 450 ul av RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum tilsatt i det nedre kammeret, og cellene ble tillatt å invadere for 24 h-48 h ved 37 ° C i en 5% CO

2 fuktet inkubator. Etter inkubering ble cellene fiksert med 95% absolutt alkohol og farget med krystallfiolett. Celler på den øvre overflaten av filteret fjernet med en bomullspinne og cellene som hadde invadert inn i bunnflaten av filteret ble tellet og avbildes i henhold til et invertert mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) ved 200 x forstørrelse i løpet av ti tilfeldig felt i hver brønn. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.

Cell migrasjon

Evnen GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, og SGC7901-M-celler til å migrere ble oppdaget ved hjelp Transwells [8-mikrometer pore størrelse, Corning Costar Corp]. De Transwells ble satt inn i 24-brønners plater. Ferskt trypsinert og vaskede celler ble suspendert i RPMI1640 inneholdende 1% føtalt bovint serum. 5 x 10

4 celler /brønn ble anbrakt i den øverste kammeret til hver innsats (BD Biosciences, NJ), med den ikke-belagte membran. 450 ul av RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum ble tilsatt til de nedre kamre. Etter inkubering i 24 h-48 h ved 37 ° C i en 5% CO

2 fuktet inkubator ble cellene fiksert med 95% absolutt alkohol og farget med krystallfiolett. Cellene i det indre kammer ble fjernet med en bomullspinne og cellene festet til undersiden av membranen ble tellet og avbildes i henhold til et invertert mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) ved 200 x forstørrelse over ti tilfeldige felt i hver brønn . Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.

In Vivo metastase analysen

For in vivo metastase analyser, de stabile cellelinjer GC9811-P og SGC7901-M ble høstet fra vevskulturflasker etter transfeksjon med lentivirus pGCsil-GFP- la-7F og tak pGCsil-GFP ved hjelp av trypsin og vasket tre ganger med PBS. Deretter 2 x 10

6-celler ble suspendert i 0,2 ml serumfritt RPMI 1640 for hver mus (seks i hver gruppe, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 uker gamle), og cellene ble injisert i halevenen. Etter fire uker etter injeksjon ble musene ofret. Levervev ble observert med det blotte øye, og antall synlige tumorer i leveren overflaten ble telt. Leveren vev ble delt inn i seriesnitt, fast med fosfat-bufret nøytral formalin, farget med hematoxylin og eosin og undersøkt histologisk. Nude mus ble manipulert og omsorg i henhold til NIH Animal Care og bruk komité retningslinjer i Experiment Animal Center for fjerde Military Medical University (Xi’an, Shanxi-provinsen, Kina).

luciferaserapportørplasmid analysen

For å undersøke om MYH9 uttrykk ble regulert av la-7f, ble en dual-luciferase reporter analysen utført. 3 «UTR av MYH9 inneholder la-7F bindingssetet ble forsterket av PCR. Forsterkning av MYH9 brukt følgende primere: (Forward) XhoIF: 5’CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 «(revers) NotIR: 5’ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3»

Som en negativ kontroll, den muterte bindingssetet av 3′-UTR sekvens (ved hjelp av revers komplement av bindingsstedet) ble forsterket ved hjelp av primere: (Forward) mutlet7MYH9F: 5’TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 «(revers) mutlet7MYH9R: 5’CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3». Produktene ble gjenvunnet via agarosegel-elektroforese, og klonet inn i luciferase reporter PsiCHECK vektor (Promega, Madison, WI). Alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Logg fase GC9811-P-celler ble sådd på 24-brønners plater og kotransfektert med Let-7F-hemmere eller kontroll, og luciferase journalister bruker Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) ved å følge veiledningen. Etter 48 timers inkubering, ble ildflue og Renilla luciferaseaktivitet målt med den doble luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega).

Western Blot

Cellene ble vasket to ganger med iskald PBS og skrapet inn RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) med ferskt tilsatt protease inhibitor cocktail (Roche) i 15 minutter på is, og deretter sentrifugert ved 13000 rpm i 10 minutter og supernatantene ble samlet. Ti mikrogram av hver prøve ble oppløst under anvendelse av 6% SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA). Båndene ble inkubert med 10% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann-0,1% Tween-20 for å blokkere ikke-spesifikke bindingsseter, og inkubert med et primært antistoff: kanin polyklonalt anti-humant myosin IIA (fortynnet 1:500; Cell Signaling Technology ) over natten ved 4 ° C. Etter gjenoppvarming og gjentatt vasking tre ganger, 15 minutter for hver enkelt, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology), fortynnet 1:2000 i to timer ved romtemperatur. Båndene ble oppdaget ved hjelp av en forbedret chemiluminescence system (Amersham Biosciences).

Immunohistochemistry

To vev arrays ble kjøpt fra Shanxi CHAOYING BIOTEKNOLOGI CO., LTD. En var magekreft vev og matchet tilstøtende normalt vev magen, den andre ble magekreft vev og matchet lymfeknutemetastase .Tissue matriser ble avvokset på 60 ° C i 2 timer, høy temperatur antigen gjenvinning i 10 minutter, rehydrert, inkubert i 10% normalt geiteserum i 1 time, deretter inkubert med kanin-polyklonalt anti-human-myosin II A (fortynnet 1:100; Cell Signaling Technology) over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble vasket i PBS tre ganger i 5 minutter hver. Vevene ble inkubert i geite-anti-kanin-serum (DAKO) i 1 time, skylt med PBS. Snittene ble oppdaget ved hjelp av DAB og kontra med hematoksylin. Den fargeintensitet ble scoret ved hjelp av en firetrinns skala (0, 1+, 2+ eller 3+) og andelen positive celler ble anslått av tre forskjellige patologer (0 = ingen, 1 = 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30% 4 = 30-70%, 5 = 70% av tumorceller). Totalt gjennomsnittlig score ble deretter gruppert i fire kategorier: negativ (ingen påvisbar farging da vurderes i forhold til ikke-spesifikk bakgrunnsfarging, svak (+), moderat (++) eller sterk (+++) og sammenlignet ved hjelp av Mann-Whitney test

Statistical Analysis

t-test (to-halet), One-way ANOVA og Mann-Whitney test ble benyttet for å analysere in vitro og in vivo data ved hjelp av SPSS 12.0 programvare (Chicago, IL , USA) P-verdi. 0,05 ble definert som statistisk signifikant *

P

. 0,05; **

P

. 0,01

Resultater

nivået~~POS=HEADCOMP la-7F uttrykk ofte ble redusert i menneskelig GC metastatisk cellelinjer og vev

Vi har undersøkt mRNA uttrykk nivåer av la-7F i to par menneskelige mage kreft cellelinjer, GC9811, GC9811 -P og SGC7901-NM, SGC7901-M. Som vist i figur 1A, ekspresjon av la-7F var lavere i GC-celler, GC9811-P og SGC7901-M, med høy metastatisk potensial, mens la-7f ble mer høyt uttrykt i GC-celler, GC9811 og SGC7901-NM, med lav metastatisk potensial. For ytterligere å validere rolle la-7F i magekreftceller metastaser, vi sammenlignet uttrykket nivåer av la-7F i ferske humane mage kreft vevsprøver med metastaser fra åtte individer (Tabell S1), til normale mage vev (NG), primær mage kreft vev (GC) og fjerne magekreft med spredning vev (MC), henholdsvis ved real-time PCR. Forbløffende nok det var bemerkelsesverdig nedregulering av la-7F i MC og GC, sammenlignet la-7F uttrykk i NG (figur 1B). Vi observerte at enten tap av eller redusert uttrykk av la-7F i tumorer og deres metastatisk vev resultert i forbedret metastaser i mage kreft vev. Resultatene alle antydet at uttrykket av la-7F er negativt korrelert svært tett med nedsatt GC metastaser og kan spille en viktig rolle i patologiske prosesser. Vi har derfor gitt klinisk og cellulær konseptuelle bevis for en metastatisk bryter i kreftutvikling som antyder en nøkkelrolle for uttrykket av la-7F i kreftutvikling.

(A) De gjennomsnittlige fold-endringer la-7F genuttrykk i GC9811 og GC9811-P (til høyre). De gjennomsnittlige fold-endringer la-7F genuttrykk i SGC7901-NM og SGC7901-M (til venstre). T-test, n = 3. (B) Den relative uttrykk for la-7f til 5S. *

P

0,05. **

P

0,01. en-veis ANOVA, n = 8. real-time PCR viser at den relative ekspresjon av la-7F i åtte tilstøtende ikke-kreft gastriske vevsprøver, og i magecancercellelinjer GC9811, er SGC7901-NM høyere enn det som i deres primære magekreft og fjerne magemetastaseprøver og høyt potensial metastase magekreft celle GC9811-P og SGC7901-M.Each prøve ble analysert i tre eksemplarer og normalisert til 5S. Brett endringen ble beregnet ved 2-

ΔΔ

Ct.

La-7F hemmet invasiv og metastatiske evner av GC-celler in vitro

Fordi la-7F handlinger som en agitator i invasjon og metastatiske prosesser, undersøkte vi effekten av redusert la-7F på mindre metastatiske cellelinjer og økt la-7F på mer-metastatisk cellelinjer. For å oppnå dette, korte interfering RNA (siRNA) oligonukleotider av la-7F ble konstruert og innført i GC9811 celler og SGC7901 -Nm celler for metastase analyser in vitro, som GC9811-la-7F-siRNA celler, SGC7901-NM-la-7F -siRNA celler og kontrollceller. Samtidig etterligne-la-7f og negative kontroll oligonukleotider ble også konstruert og innføres i GC9811-P-celler og SGC7901-M-celler for metastase analyser in vitro, som GC9811-P-la-7f-etterligner-celler, SGC7901-N-har latt -7F-ligne celler og kontrollceller. Uttømming av la-7f betydelig svekket evne GC9811 celler til å migrere og invaderer gjennom Matrigel-belagte membraner eller de ikke-Matrigel-belagte membraner mot serumholdig medium i et modifisert Boyden kammer analyse (figur 2A). Øket ekspresjon av la-7f undertrykte betydelig evne GC9811-P-celler til å migrere og invaderer gjennom Matrigel-belagte membraner eller ikke-Matrigel-belagte membraner mot serumholdig medium i et modifisert Boyden kammer analysen (figur 2B), sammenlignet med kontrollcellene. Lignende resultater ble funnet i SGC7901-NM celler (figur 3A) og SGC7901-M-celler (Figur 3B), mens la-7F knockout i GC cellelinjer førte til høyere invasjon og migrasjonsrater.

(A) Invasion og migrasjon analysen. Representative felt av invasiv (opp) eller migrasjon (ned) celler på membranen (til venstre). (Forstørrelse x 200). Gjennomsnittlig invasiv eller migrasjon celle nummer per felt (til høyre). Den invasive eller migrasjon celle antall GC9811 celler transfektert med let-7F-hemmere er drastisk økt enn det tilført med negativ kontroll. * P 0,05, t-test, n = 10. (B). Den invasive eller migrasjon celle antall GC9811-P-celler transfektert med let-7F-etterligner er drastisk redusert enn det tilført med negativ kontroll. * P 0,05, t-test, n = 10.

(A) Invasion og migrasjon analysen. Representative felt av invasiv (opp) eller migrasjon (ned) celler på membranen (til venstre). (Forstørrelse x 200). Gjennomsnittlig invasiv eller migrasjon celle nummer per felt (til høyre). Den invasive eller migrasjon celle antall SGC7901-NM transfektert med let-7F-hemmere er drastisk økt enn det tilført med negativ kontroll. * P 0,05, t-test er n = 10. (B) invasiv eller migrering celle antall SGC7901-M-celler transfektert med la-7f-etterligner blir dramatisk redusert enn det transfektert med negativ kontroll. * P 0,05, t-test, n = 10.

La-7F hemmer tumorinvasjon og metastase i en naken mus xenograft modell

GC9811-P eller SGC7901-M tumorceller transfektert med lentivirus pGCsil-GFP- la-7f eller negativ kontroll pGCsil-GFP ble injisert inn i nakne mus, og musene ble avlivet fire uker etter vaksinering. Antallet metastatisk Nodi ble dramatisk redusert i nakne mus injisert med pGCsil-GFP- la-7f transfekterte celler, sammenlignet med de negative kontroller (figur 4A, 4B). Disse dataene gir sterke bevis for at la-7F kan hemme tumorinvasjon og metastasering in vivo.

GC9811-P og SGC7901-M-celler ble transfektert med lentivirus pGCsil-GFP-la-7F eller negativ-kontroll lentivirus pGCsil- GFP, og deretter injisert inn i nakne mus via halevenen, som beskrevet i Materialer og Metoder. Dyrene ble avlivet 4 uker etter injeksjon. (A) Representative anatomiske bilder av liv fra mus injisert med GC9811-P- pGCsil-GFP eller GC9811-P- pGCsil-GFP- la-7F (til venstre). Det gjennomsnittlige antall synlige tumorknuter i leveren (til høyre). P 0,01. T-test, n = 6. (B) Representative anatomiske bilder av liv fra mus injisert med SGC7901-M – pGCsil-GFP eller SGC7901-M – pGCsil-GFP- la-7F (til venstre). Det gjennomsnittlige antall synlige tumorknuter i leveren (til høyre). P 0,01. T-test, n = 6.

La-7F nedregulerer myosin IIA uttrykk ved direkte rettet mot sin 3 «UTR

For ytterligere å undersøke mekanismen som la-7F undertrykker GC invasjon og metastasering, analyserte vi potensielle nedstrøms tumor metastaserelaterte målgener i silico. Vi fokuserte på la-7F målgener, særlig de gener som var migrasjon og /eller invasjon-relatert, og funnet ut at myosin IIA, er involvert i markedsføringen av kreft celle migrasjon eller invasjon, kan være målet genet av la-7F. I et forsøk på å bestemme hvorvidt myosin IIA reguleres av la-7f gjennom direkte binding til dens 3′-UTR, vi konstruert fullengdes vill-type og mutante fragmenter av MYH9 mRNA 3 «UTR, og satt dem inn i området umiddelbart nedstrøms av et luciferase reporter-gen (figur 5A). Deretter la-7F ligne oligonukleotidene ble ko-transfektert med forskjellig luciferase 3 «UTR konstruerer i GC9811-P-celler. Vi fant at la-7f redusert relativ luciferaseaktivitet i villtype-3 «UTR av MYH9 (figur 5B). Imidlertid gjorde luciferase aktiviteten ikke falle kraftig i UTR med muterte bindingsseter, sammenlignet med de Mut-type motparter (figur 5C). Disse data støtter at MYH9 er direkte mål for la-7f.

(A) Forut duplex dannelse mellom menneske MYH9 3’UTR (øverst) og har-la-7F (nederst) og sekvensen av brev 7f-bindingssetet i MYH9 3’UTR og mutant (Mut) MYH9 3’UTR. Luciferase-aktivitet av MYH9 3’UTR (B) eller mut MYH9 (C) 3’UTR reportergen i GC9811 celler infisert med den la-7F, la-7F-inhibitor, blank eller tom etterligner oligo. Analysene viste at luciferase aktivitetene i konsernet ble betydelig redusert sammenlignet med de av muterte og negative kontrollgrupper. * P 0,05. (D) Et uttrykk for MYH9 ble analysert ved QRT-PCR. MYH9 ble redusert i GC9811 celler og SGC7901-celler transfektert med la-7f-etterligner sammenlignet med GC9811 celler og SGC7901 celler transfektert med la-7f -negative kontroll. (E) la-7F undertrykker endogene proteinnivå MYH9, som oppdaget av Western blot. Stabil transduced SGC7901-NM og GC9811 celler ectopically uttrykker la-7F ble brukt for Western blot analyse. Effekt av la-7F på MYH9 i GC9811 celler (øverst). Effekt av la-7F på MYH9 i SGC7901-NM celler (nederst).

RT-PCR viste at uttrykket av MYH9 i GC9811 celler og SGC7901-NM celler transfektert med la-7F-etterligner er downregulated sammenlignet med de celler transfektert med kontroll-konstrukter (figur 5D). Western blotting resultater viste ekspresjon av myosin IIA i GC9811 og SGC7901-NM-celler transfektert med la-7f-etterligner er nedregulert i forhold til de som er transfektert med negativ kontroll (figur 5E). Furthmore viser Real-time PCR at mRNA relative uttrykk for MYH9 i GC vev og fjernt metastatisk vev er nedregulert i forhold til sine normale grenser ikke-kreft prøver (Figur 6A). Immunohistokjemi viste at ekspresjonen av myosin IIA i GC lymfeknutemetastase er oppregulert i forhold til sin primære GC vev (tabell 2; figur 6C, figur S1B), og det er oppregulert i GC vev sammenlignet med sin tilpasset tilstøtende normale mage vev (tabell 1, figur 6B, figur S1 A) .Disse data viser at la-7F kan ned-regulere mRNA uttrykk for MYH9 og kan undertrykke protein oversettelse av det

(A) real-time PCR-show. at den relative ekspresjon av MYH9 i åtte fjernt gastriske metastase prøver er høyere enn det som i deres primære magekreft og tilstøtende ikke-kreft prøvene gastrisk vev. Hver prøve ble analysert i triplikat og normalisert til 18S. (B) Uttrykk for MYH9 i grunnskolen magekreft (Ca) og dens tilstøtende normal mage vev (N) ved IHC. (C) Uttrykk for MYH9 i grunnskolen magekreft (Ca) og matchet lymfeknutemetastase vev (M) av IHC.

Diskusjoner

I studien, viste vi at la-7F uttrykk i metastatisk GC cellelinjer ble nedregulert i forhold til la-7F uttrykk i ikke-metastatiske GC-celler. Ektopisk uttrykk og siRNA knockdown av la-7F bekreftet sin invasjon-undertrykkende aktivitet in vitro og in vivo. Videre viser vi at MYH9 er et direkte mål for la-7F og dette la-7F mediert hemming av MYH9 er avhengig av sin 3′-UTR. Derfor er disse resultatene markere betydningen av la-7F som en tumor suppressor i celle invasjon og metastasering ved å målrette MYH9 i magekreft.

Nyere studier viser at mirnas kan virke som aktivatorer eller hemmere av tumormetastase [27] . For eksempel, mikroRNA-10b [28], MIR-373 og MIR-520C [29], [30] stimulert kreft celle migrasjon og invasjon i brystkreft. I tillegg kan MIR-155 fremme tumorinvasjon og metastase i brystkreft med downregulating sitt mål, RhoA [31] og fremme tumorinvasjon og metastase i bukspyttkjertelen duct carcinoma av undertrykke uttrykket av TP53INP1 [32]. Den miRNA-200 familien (miRNA-200A, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 og miRNA-429) kan hemme tumorinvasjon og metastase ved å regulere EMT [33]. MiR-126 ble funnet å hemme celleadhesjon, migrering og invasjon delvis gjennom undertrykkelse av CRK i en in vitro modell av ikke-små-celle lunge karsinom [34]. Det har vist seg at Mir-29c er betydelig redusert i svært invasiv og metastatisk nasofaryngeal karsinom [35]. MiR-218 hemmer invasjon og metastasering av magekreft ved å målrette den Robo1 reseptoren [26]. Selv om mange studier har blitt gjort for å undersøke mekanismen av miRNA og metastase, mekanismen ikke var klart. Viktigst er det få studier blitt gjort på mekanismer for GC metastase regulering av mikroRNA.

la-7f-genet er lokalisert på 9q22.3, og er involvert i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert angiogenese [36], immunocytt differensiering [37], replicative senescence [38], vekst arrest [39], pulmonal arteriell hypertensjon og kreftutvikling [23]. La-7F er nedregulert i flere kreftformer. En sterkt karakterisert eksempel er nyrecellekarsinom, hvori la-7f nedregulering førte til en betydelig reduksjon i kallikrein (KLK) ekspresjon [40]. KLKs kan også bli målrettet av la-7F i eggstokkreft [25]. I papillær skjoldbruskkjertelkreft, redusert uttrykk for la-7F kan være en viktig molekylær hendelse i RET /PTC malign transformasjon [41]. I tilfelle av primær brystkreft, imidlertid, ble la-7f oppregulert i forhold til normale tilstøtende tumorvev [22]. I vår studie, viste vi at la-7F er også nedregulert i MC vev og GC cellelinjer med høy metastatisk potensial, og vi utforsket videre mekanismen som la-7F redusert tumorinvasjon og metastasering.

MYH9 er genet for ikke-muskel-myosin tungkjede IIA (NMHCIIA), som har mutasjoner er ansvarlig for en kompleks lidelse heter MYH9-relatert sykdom, karakterisert ved en kombinasjon av forskjellige fenotypiske egenskaper [42].

Legg att eit svar