Abstract
Bakgrunn
Bedre leveringssystemer er nødvendig for rutinemessig brukt vaksiner, for å forbedre vaksine opptak. Mange vaksiner inneholder alum eller alum basert adjuvans. Her undersøker vi en ny tørr belagt tettpakket mikro-projeksjon rekke hud patch (Nanopatch ™) som en alternativ leveringssystem for intramuskulær injeksjon for å levere en alum adjuvans humant papillomavirus (HPV) vaksine (Gardasil) ofte brukt som en forebyggende vaksine mot livmorhalskreft.
metodikk /hovedfunnene
Micro-projeksjon arrays tørr belagt med vaksine materiale (Gardasil) levert til C57BL /6 mus øret huden utgitt vaksine i løpet av 5 minutter. For å vurdere vaksine immunogenisitet, doser svarende til HPV-16-komponenten av vaksinen mellom 0,43 ± 0,084 ng og 300 ± 120 ng (gjennomsnitt ± SD) ble administrert til mus på dag 0 og dag 14. En dose på 55 ± 6,0 ng levert intrakutant av mikrofremspring matrise var tilstrekkelig til å gi en maksimal virusnøytraliserende serum-antistoff-respons på dag 28 post vaksinasjon. Nøytraliserende antistofftiter ble opprettholdt ut til 16 uker etter vaksinasjon, og for sammenlignbare doser vaksine, ble noe høyere titre observert med intracutaneous lapp levering enn med intramuskulær levering med nålen og sprøyten på dette tidspunkt.
Konklusjoner /Betydning
bruk av tørre mikro-projeksjon arrays (Nanopatch ™) har potensial til å overvinne behovet for en vaksine kjølekjeden for vanlige vaksiner i dag levert av nål og sprøyte, og for å redusere risikoen for nålestikk skade og vaksine unngå på grunn av frykt for at nålen spesielt blant barn
Citation. Corbett HJ, Fernando GJP, Chen X, Frazer IH, Kendall MAF (2010) Skin Vaksinasjon mot livmorhalskreft Associated humant papillomavirus med en Novel Micro-Projection Array i en musemodell. PLoS ONE 5 (10): e13460. doi: 10,1371 /journal.pone.0013460
Redaktør: Sotirios Koutsopoulos, Massachusetts Institute of Technology, USA
mottatt: 21 juli 2010; Godkjent: 16 august 2010; Publisert: 18 oktober 2010
Copyright: © 2010 Corbett et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Cancer Council of Queensland, University of Queensland, National Health and Medical Research Council (Australia) Grants ID # 569726, ID # 456150, Australian Research Council Grant ID # DP077464 og Queensland Smart State ordningen finansiert denne forskningen. Professor Mark A. F. Kendall var mottakeren av en australsk Forskningsrådet Future Fellowship. Professor Ian H. Frazer var mottakeren av en Queensland regjering Premiers Fellowship. The University of Queensland og professor Ian H. Frazer utlede royalty inntekter fra salg av HPV VLP vaksiner. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste vaksiner er levert av nål og sprøyte. Men som en vaksine levering enhet, nål og sprøyte har mange viktige mangler. Disse inkluderer potensiell overføring av blodbårne sykdommer gjennom nål-stick skader [1] og nål gjenbruk – ca 30% av injeksjoner for formålet med vaksineringen i utviklingsland er usikre [2], og at nålestikk skader forårsaker mer enn 500.000 dødsfall per år [3]. Nål-fobi og smerten forbundet med en intramuskulær injeksjon er også ulemper – er det anslått at nålen fobi er til stede i minst 10% [4] av befolkningen, eller høyere [5]. Muskelen er også en svært ineffektive området for vaksinering, da det ikke har en høy tetthet av antigenpresenterende celler. I motsetning til dette er den hud et attraktivt alternativ stedet for vaksinering på grunn av sin tette nett av potente antigenpresenterende celler (APC) som innbefatter Langerhans-celler (LCS) [6], og mange sub-sett av dermale dendrittiske celler (DDC) [7] . Nærheten av disse cellene til hudoverflaten betyr at det kan være mulig å målrette dem på en måte som kan redusere smerte og potensialet for overføring av blodbårne patogener. Mens kutan levering har stort potensial, det nærmeste metoden som brukes i dag i klinikken – intradermal injeksjon – er teknisk vanskelig, nødvendig utvikling av avanserte målrettingsmetodene som anmeldt i [8], [9]
I denne studien en. roman hud patch kalt Nanopatch ™ brukes til å målrette disse hud immunceller. Den Nanopatch ™ er en mikro-projeksjon matrise med unikt tett projeksjon pakking ( 20 000 /cm
2) og korte anslag (110 mikrometer i lengde). Denne nål tetthet er designet slik at leverte vaksine har vært samlokalisert med 50% hud immunceller – i både epidermis og dermis -. Etter kutan applikasjon uten å være avhengig diffusjon (se figur 1) [10]
A todimensjonal matrise av fremspring lokaliserer tørre belagte vaksiner for å hudlagene rik på immunceller. Når vaksine hydrater, diffunderer det gjennom levedyktig epidermis og dermis.
Tidligere studier med Nanopatch ™ immunisering har utnyttet ovalbumin og splittet influensavaksine som antigener uten tilsetning av et adjuvans. Crichton et. al [11] viste høye antistofftitre etter en immunisering med underkant av 2 mikrogram via Nanopatch ™ ved hjelp av modellen antigen ovalbumin i C57BL /6 mus uten et løft ved hjelp av 65 mikrometer lange Nanopatch anslag. Fernando et. al. [10] demonstrert induksjon av beskyttende nivåer av funksjonelle antistoffer mot influensa hos mus med 110 um lange Nanopatch ™ fremspring (samme som anvendt i denne studien) ved hjelp av en splittet virus, unadjuvanted trivalent influensavaksine (Fluvax 2008®); med en faktor på 100 i levert dose-sparing, sammenlignet med nål og sprøyte. I disse tidligere studier ble vaksiner levert uten adjuvans.
I denne studien vi utvide til å utforske nytten av Nanopatch ™ i å levere en alum adjuvans. Dette er viktig, fordi mange vaksiner adjuvans -. Med Alum i den mest brukte [12]
Ja, helt til den siste lisens av AS04, alum var den eneste adjuvans å være lisensiert av FDA [13] . AS04 er alun basert på, med tillegg av en lipid basert toll-lignende reseptor 4 agonist 3-O-desacyl-4′-monofosforyl lipid A (MPL) [14]. «Alum» er kjemisk enten aluminium oksyhydroksyd eller aluminium hydroxyphosphate. For nye teknologier for å utnytte tiden lisensiert vaksiner, ideelt sett bør man arbeide med alun-adjuvans. Så langt har fast preparat arbeid blitt utført med alun adjuvant for immunisering epidermal pulver (EPI) med hepatitt B [15], [16], [17], og difteri- og tetanus-toksoider [17]. Omfattende alun gel koagulering i løpet av tørkingen er mistenkt for å hemme frigjøring av antigenet, slik at det ikke kan gjenvinnes ved rehydratisering [16], og tap av effekt har blitt rapportert etter lyofilisering eller fryse [18], [19], [20]. For å minimalisere disse tapene uten i betydelig grad å redusere mengden av alun i det totale faststoff (mindre enn 1% [18])., Hurtig frysing blir brukt til å forhindre frysing konsentrasjon av oppløste stoffer i kombinasjon med glassdannende eksipienser
Imidlertid i vår mikro-projeksjon belegg, er et frysetrinn ikke bare mer teknisk krevende, men har potensial til å redusere den mekaniske integriteten av det belagte lag. Malingen må være mekanisk sterk nok til å forbli festet på p penetrasjon, og ulik termisk utvidelse egenskaper mellom anslagene og vaksinen kan forårsake sprekker eller delaminering av belagte lag mens enheten er brakt til romtemperatur.
Lufttørking av alun inneholdende preparater ble undersøkt i Maa et al [17], og ble funnet å forårsake omfattende koagulering selv i nærvær av trehalose, og /eller mannitol og /eller dekstran. Som omløps belegg protokoller er nærmere lufttørkeprotokoller som er beskrevet i [17] i motsetning til lyofilisering eller frysetørking, er det forventet at vaksinering med mikrofremspring tørr belagt med et alun inneholdende formulering ville resultere i en dårlig immunrespons. I denne artikkelen bruker vi den løselige polymer methyl-cellulose for å redusere koagulering av gelen på dehydrering, og for å hjelpe til med oppløsningen på rehydratisering etter påføring.
sykdom test for denne undersøkelsen er humant papillomavirus (HPV) fordi – bortsett fra de samfunnsmessige betydning vaksinen – assays for å måle virusnøytralisering er godt etablert. Antigen struktur er viktig for å heve en virusnøytraliserende antistoffrespons [19], noe som gjør systemet følsomt for forstyrrelser i antigen struktur som kan være forårsaket av alun dehydrering under tørre belegget.
HPV-infeksjon er utløsende i praktisk talt alle tilfeller av livmorhalskreft – med HPV DNA til stede i 99,7% av livmorhals karsinomer [20]. Vaksinasjon ble gjort mulig ved moderne rekombinant protein ekspresjonssystemer og den oppdagelse at ekspresjonen av L1 større kapsidprotein alene var tilstrekkelig til å frembringe selvsammenviruslignende partikler (VLP-er) [21], [22]. VLP er en tom viral partikkel -. Slik at det ikke inneholder det virale genomet som koder for de onkogene proteiner som forårsaker malignitet [23], [24], [25] i en naturlig infeksjon
Kommersielt tilgjengelige vaksiner Gardasil [Merck] og Cervarix® [GlaxoSmithKline] demonstrert utmerket profylaktisk tiltak i kliniske studier, hindrer pre-maligne og påfølgende kreft i nesten 100% i henhold til protokoll analyser [26], [27], [28]. Begge vaksiner inneholde en form for alun adjuvans. Vaksinasjoner gis som tre doser i løpet av seks måneder. Disse vaksinene er forebyggende. HPV er den vanligste seksuelt overførbare infeksjoner [29], og kumulativ infeksjon forekomst over 2 år etter første samleie er ca 30%, med kondom bruker ikke viser signifikant beskyttende effekt [30]. Immunisering må skje før første samleie for å være fullt beskyttende. Mange nasjoner har nå nasjonale vaksinasjonsprogrammer rettet mot 11 og 12 år gamle jenter. Dette har ikke vært uten problemer. Mass besvimelse og hodepine er antatt å være forårsaket av en nål fobi og massehysteri [31], og vaksinering uten nåler kan forbedre vaksineopptak og aksept.
Langsiktig effekt av HPV-vaksiner er viktig. Mens forekomsten varierer med alder, er utbredelsen selv hos kvinner mellom 40 og 49 anslått til 25,2% [32], så potensialet for infeksjon fortsetter over livsløpet. Varighet av beskyttelse er en betydelig faktor i kostnadseffektivitet av HPV-vaksiner [33], og eventuelle andre generasjon vaksiner må vise langvarig beskyttelse.
Intra-dermal injeksjon av Canine Oral papillomavirus (COPV) L1-glutathione- S-transferase fusjons pentamers – ligner HPV pentamers – har vist seg å være beskyttende i beagler på 400 ng /hund [33]. Suzich, J.A., et al. [34] viste at samlet COPV-VLP resulterte i fullstendig beskyttelse til en 50 ng dosenivå, og delvis beskyttelse på 0,125 ng hjelp av intra-dermal i beagler.
HPV VLP er satt sammen fra 72 pentamers av L1-proteinet [35], [36]. Demontering av VLP kan utføres reversibelt
in-vitro
ved høy pH, lav saltkonsentrasjon, og med tilsetning av reduksjonsmidler (for eksempel pH 8,2, NaCl 0.166M med 2 mM DTT). Dialyse mot en pH 6,8 buffer med en saltkonsentrasjon på 0,5-1 M resulterer i sammenstillingen av partiklene [37]. Lenz, P., et al. [38] viser at HPV16L1-VLP alene, men ikke beskaffenhet L1-pentamers indusere modning av dendrittiske celler
in vitro
. Thones et. al. [39] anslår at immunisering med L1-pentamers krever også 20-40 ganger mer protein administrert for å oppnå tilsvarende antistoffrespons. Denaturert L1-proteinet ikke gir en virusnøytraliserende antistoffrespons [19], og mens tørre formuleringer kan bety lengre holdbarhet ved høyere temperatur, kan en dårlig formulering forårsake betydelig nedbrytning av proteinprodukter. Egnede flytende formuleringer for HPV-VLP stabilitet er definert for både Gardasil [40] og Cervarix [41]. Som formuleringen har en innvirkning på montasjen av VLP (og muligens strukturen av kapsomerer selv) og VLP er mer immunogene enn de kapsomerer, er formuleringen viktig for styrken av en tørr belagt vaksine. Begge vaksinene en del av alun adjuvant – Gardasil inneholder aluminium hydroxyphosphate. Så vidt vi vet, har studier med faste formuleringer ikke publisert for HPV, eller HPV adsorbert til alum.
Nanopatch ™ design brukt i denne studien benytter en 58 × 58 matrise av mikro anslag 110 mikrometer høye, og 30 mikrometer i diameter basen, med en avstand på 70 um mellom projeksjonssentrene (se figur 2). Vaksinen er tørr belagt på mikro anslag som beskrevet i [42], og Nanopatches ™ anvendes på 2 ms
1. Denne konfigurasjonen gir materialet inn i de epidermale og dermale lag av museøre hud med en inntrengningsdybde på 42 um (SD = 9,9, N = 365), som bestemt ved avbildning av fluoriserende sporstoff i kryo-seksjonert mus ører som beskrevet i [11] , men med tilsvarende anslag for de som brukes i [10]
Sekundære elektron bildene viser overflatemorfologien mens tilbakespredte elektron bildene viser sammensetning -. med lave atommasse elementer som gir lavt signal – dvs. belagt området vises mørkt i sammenligning med den ikke-belagte Nanopatch ™. Micro-anslag er belagt på b) 800 ng, c) 80 ng, d) 8 ng og e) 0,8 ng av HPV-16 protein per lapp. Mens noen bridging skjer i 800 ng gruppen (panel b – hvit pil)., Er belegg sett på den koniske delen av anslagene i alle dosegrupper
I denne artikkelen viser vi tørre belegg og utgivelsen av en alum adjuvans HPV-VLP vaksine med Nanopatch ™. Vi viser en påfølgende immunrespons som er langvarig, og nøytraliserer viruset til nivåer tilsvar med intramuskulær injeksjon med nålen og sprøyten.
Resultater
Projection morfologi tørr belagt Nanopatches ™ er egnet for nålkraft
Coated patcher ble undersøkt ved scanning elektronmikroskopi (SEM) med sekundær elektron og tilbakespredte moduser (figur 2) for å undersøke fordelingen av den belagte vaksinen sammen anslag. Sekundære elektron-modus viste flate form av de belagte nåler, mens tilbakespredte elektron modusen ble anvendt for å bekrefte kvalitativt tykkelsen av belegget på grunn av forskjeller i den atommasse av gull Nanopatch ™ overflaten og belegget. Forsøk på å tørke pelsen alum adjuvant uten tilsetningsstoff resulterte i minimal vaksine belegg på nål tips, og krystallisering av alun adjuvant (figur S1). Derfor har vi lagt methyl-cellulose for å stabilisere vaksinen og forbedre belegg morfologi (figur 2). En betydelig andel av belegget var lokalisert til den avsmalnende del av fremspringene. Dette kan sees i de sekundære elektron bilder ved forskjellen i morfologi før og etter maling, og i den tilbakespredte elektron bildene ved det mørke signal på projeksjons tips. I 800 ng gruppen, ble observert noen bygge bro mellom anslag i visse områder av Nanopatches ™ (indikert med pilen i figur 2b) sannsynligvis på grunn av høyere konsentrasjon av vaksiner enn i andre grupper.
Vaksine er løslatt fra projeksjon tips, og bulk levering effektivitet er i tråd med forventningene basert på belegg morfologi og penetrasjon data
tidoblet serielle fortynninger av Gardasil® ble utarbeidet og 14C merket ovalbumin lagt til som en tracer til hver prøve, belagt på Nanopatches ™ og påført den ventrale øreflippen av C57BL /6 mus (N = 5 pr dose) som beskrevet i Materialer og Metoder. En massebalanse ved å bruke den radiomerkede tracer ble utført mellom det totale belagte mengde, og det som ble levert inn i øret huden, igjen på Nanopatch ™, eller avsatt på overflaten av huden. Effektivitet for frigivelse var: 19% (SD = 7,5), 34% (SD = 4,7), 36% (SD = 10), og 27% (SD = 5,2) til 800 ng, 80 ng, 8 ng og 0,8 ng belagt HPV-16 henholdsvis (se figur 3).
Meldingen er bestemt ved massebalanse, og varierte mellom belagte mengder med et gjennomsnitt på 19%, 34%, 36% og 27% for preparater som brukes for 800 ng, 80 ng, 8 ng og 0,8 ng av belagt HPV-16 per Nanopatch ™.
levering prosenter ble så brukt til å beregne effektive doser ved å multiplisere leveringsdyktighet ved belagt beløp. Levering beløp ble anslått til 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5,7 ng (SD = 1,6), og 0,43 ng (SD = 0,084) av HPV-16L1.
Nanopatches ™ post-applikasjonen ble også visualisert med SEM for å avgjøre om noe belegg løsning fortsatt forble på anslag. Lav molekylmasse materiale ble oppdaget på bunnen i noen tilfeller, men sjelden på projeksjons tips (Figur S3)
Nanopatch ™ vaksinasjon utløser langvarig virusnøytraliserende immunrespons, kan sammenlignes med intramuskulær
Nanopatch ™ doser ble fordelt over hvert øre (dvs. en lapp per øre), og administreres på dag 0 og igjen på dag 14. Sera ble samlet på dag 28 og dag 112 etter vaksinering for å undersøke umiddelbar respons, og på lengre sikt utholdenhet av antistoffer innlegg vaksinasjon. Sera ble analysert med hensyn på evne til å nøytralisere den HPV-virus med en pseudovirionbasert nøytralisasjonsanalyse (PBNA) (figur 4). En non-inferiority analyse ble brukt (Materialer og metoder) som ligner på tidligere humant papillomavirus immunisering sammenligning studier [43].
Nanopatch ™ doser var 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5,7 ng (SD = 1,6) og 0,43 ng (SD = 0,084). Intramuskulære doser var 10 ug, 1 ug, 100 ng, 10 ng, og 1 ng. På dag 28, har Nanopatch ™ 300 ng og 55 ng dosegruppene sammenlignes nådd virusnøytraliserende titere til alle intramuskulær injeksjon gruppene (p 0,05). Etter dag 112, har alle Nanopatch ™ doser nådd sammenlignnøytraliserende titer mot alle intramuskulær injeksjon gruppene (p 0,05). Gjentak er forskjøvet i x-aksen til hjelp i visualisering. Immunisert plottet i en dose på 0,05 ng grunn til å logge skala.
På dag 28 etter immunisering, titere i 300 ± 120 ng og 55 ± 6,0 ng dose Nanopatch ™ gruppene var statistisk ikke-inferior til alle intramuskulære doser (p 0,001) med geometrisk gjennomsnitt titer (GMT) på 30 500 og 26 000 henholdsvis (figur 4). I hver av de 5,7 ± 1,6 ng og 0,43 ± 0,084 ng dosenivå Nanopatch ™ grupper, to mus gjorde ikke seroconvert.
nøytraliserende antistoffer ble titrert på dag 112 post-immunisering (figur 4) for å etablere langsiktige effekt. På dagen 112 post-immunisering, alle Nanopatch ™ gruppene viste 100% sero-konvertering. På dagen 112, alle Nanopatch ™ doser statistisk ikke var dårligere enn alle intramuskulære doser (p 0,05).
Når man sammenligner respons ved dag 112 og dag 28 i hver gruppe (figur 4), dagen 112 titer ikke oppfyller ikke-mindreverdighets kriterier mot dag 28 titer i både 100 ng og 1 ng intramuskulære grupper (forhold på titere: 100 ng 90% CI (0,40, 1,2), og 1 ng 90% konfidensintervall (0.39,1.2) ). I motsetning til i gruppe Nanopatch ™ titer sammenligninger viste titer på dag 112 var ikke dårligere i alle tilfeller, og overlegen på 0,43 ± 0,084 ng dosenivå, med dagen 112 titer være 1.2-5.8 ganger høyere enn dag 28 titer ( p 0,05) med samme dose
Diskusjoner
Dette papiret demonstrerer effektivt belegg og utgivelsen av en alum som inneholder vaksine Gardasil fra en roman mikro-projeksjon rekke patch (Nanopatch ™) designet til. levere vaksine direkte til omtrent 50% av det rike hud antigenpresenterende celler [10], for effektiv induksjon av en virusnøytraliserende antistoffrespons.
utløsning effektivitet varierte mellom doseringsgrupper. Det er anslått at dette er først og fremst avhengig av belegget morfologi. Dette støttes av våre teoretiske leverings forventninger (figur S2). Våre spådd utgivelser (Figur S2) sammenlignet med målte utgivelsen var mest nøyaktig innenfor de laveste dosegruppene. Vi over-spådde utgivelsen i de høyeste dosegruppene. Dette avviket er sannsynlig å skyldes bygge bro mellom fremspringene og overdreven belegg på basis av Nanopatches ™ (figur 2b) som fører til tap av beleggoppløsning. Siden belegg på bunnen og bygge bro mellom anslagene ble ikke regnskapsført i beregninger, hvor disse beløpene er betydelige, vil det resultere i en overvurdering av levert mengde som de teoretiske beregningene var bare basert på belegg løsning på anslagene. Denne brodannende vil sannsynligvis reduseres ved tilsetning av et overflateaktivt middel i senere formuleringer. Disse data og etterapplikasjons bildene viser at utslipp fra anslagene er komplett, og dermed med utviklingen innen belegg teknologi for å isolere lag utelukkende til deler av anslagene som penetrerer huden, komplett utslipp 100% effektivitet er mulig med disse formuleringene.
Fast utgivelsen er sannsynlig å hjelpe til med å sikre konsekvent vaksinedose er levert, som det er lettere å sikre etterlevelse av immuniseringsprotokoll. En observasjonsperiode på 15-20 minutter etter en standard intramuskulær immunisering er generelt anbefalt som de fleste anafylaktisk sjokk vil skje i løpet av denne perioden [44]. Frigjøring av den tørre belagte vaksine fra Nanopatch ™ skjedde i løpet av fem minutter -. Dermed lett møteobservasjonsperioden retningslinjer
For å demonstrere at virusnøytraliserende antistoffer ble reist, serum ble vist av en pseudovirionbasert nøytralisasjonsanalyse (PBNA) – regnet som «gullstandard» i WHOs retningslinjer for HPV-vaksiner [45], [46]. Denne analysen måler effektiviteten av antistoffer eller andre forbindelser i å blokkere inntrengning av HPV-viruset inn i 293TT celler [47]. Dette er viktig, som beskyttelse antas å være et resultat av antistoff-mediert virusnøytralisering [48], [49]. Fremgangsmåten fjerner også forspenningen for å bruke det samme materiale for både immunisering og immunologisk analyse som oppstår når ELISA anvendes. Analysesignal genereres bare av intakte pseudovirions som etterligner det naturlige virus, og således en hvilken som helst immunrespons frembrakt mot forurensninger eller denaturert protein vil ikke påvirke resultatene av nøytralisering analysen. Nanopatch ™ immunisering med 0,43 ± 0,084 ng av HPV-16 resulterte i virusnøytraliserende respons på dag 112 etter vaksinasjon. Dette innebærer at den tørre belagte L1-protein opprettholder en viss naturlig virus-lignende struktur. Vi spekulerer i at en viss grad av demontering av VLP inn pentamers kan ha skjedd. Denne påstanden er basert på våre tilsvarende studier med virale vektorer (upubliserte data). På grunn av den økte immunogenisitet av VLP i sammenligning med pentamers, hvis demontering inn pentamers tiden oppstår under tørr-belegg, er en stor økning i aktiviteten trolig gjennom reformulering til ytterligere bevare VLP struktur.
Mens tidlige resultater viste bare 50% sero-konvertering i den 5,7 ± 1,6 ng og 0,43 ± 0,084 ng Nanopatch ™ grupper, fordeler bli klarere på terminalen blø når alle mus har sero-konvertert. Ved de lavere doser intramuskulær begynte å svikte, med titere på to mus som faller under påvisningsgrensen. Det er mulig at Nanopatch ™ immunisering med alun inneholdende vaksiner, har langsommere frigjøringskinetikken som sammenlignet med intramuskulær administrasjon – på grunn av de forskjellige administrasjonsstedet, og en større depoteffekt fra dehydrert alun. Mens ekstremt lave doser av HPV-VLP vises immunogen intramuskulært i mus, doser for mennesker i de godkjente vaksiner er i 20-40 mikrogram rekkevidde per subtype. Langsomme frigjøringskinetikken kan med fordel endre immunologiske utbytte og bistå i å oppnå en optimal aktivering av APC uten behov for fysisk å anvende flere doser. Videre arbeid er nødvendig for å undersøke dette.
Tidligere studier av intradermal immunisering med COPV [33], [34] benyttet en ELISA-analyse slik at en direkte sammenligning med våre resultater er ikke mulig. Suzich et al [34] studerte intradermal levering av sammensatte COPV-VLP og fått delvis beskyttelse på sub-nanogram dosenivå. Til sammenligning, en senere studie av Yuan, et. al. [33] med intradermal administrasjon av COPV-L1-GST fusjonsprotein (kan ikke montere inn VLP) viste ingen påvisbar respons ved ELISA under en 400 ng dose. Dette arbeidet fokusert på montering inkompetente pentamers som et billig alternativ til VLP. I begge tilfeller ble delvis beskyttelse mot utfordring bemerkes også når antistoffer ikke ble detektert. Nanopatch ™ immunisering med splittvirus influensavaksine gir reduksjon overlegen dose mot intramuskulær [10] sammenlignet med hva som har blitt vist i intradermal administrasjon [50]. Ved demontering av HPV-VLP-er oppstått i vårt Nanopatch ™ tørt belegg, er det nærmeste effektive dose sammenligning med arbeidet til Yuan et al. Dette ville foreslå at Nanopatch ™ immunisering kan gi økt immunogenisitet i en direkte sammenligning med intradermal administrasjon (og dermed antagelig intramuskulær administrasjon) av L1-pentamers. Men som for tiden er lisensiert vaksiner er VLP basert, reformulering å bevare VLP integritet vil være fokus for det videre arbeidet
Våre utslipp analyser måler andelen av belegg som er sluppet inn i huden -. De måler ikke hva andelen av antigen effektivt frigjøres fra alum, eller dets konformasjon på utgivelsen. Dersom alun gelen koaguleres, i overensstemmelse med tidligere studier [17], antigen kan ikke unnslippe sammenfoldede alun matrise – og dermed redusere den effektive dose. Denne effekten kan faktisk negere noen adjuvant fordeler alun ellers gir, men videre studier er nødvendig for å fastslå i hvilken grad det alum matrise svekker utgivelsen, og dens innvirkning. Fremtidig arbeid vil undersøke proteinstruktur og koagulering av alum samt hjelpestoffer for å redusere den. Som HPV-L1-VLP er svært immunogene, selv uten adjuvans, vil formuleringene uten alun også bli undersøkt. Vi spekulerer i at med forbedrede formuleringer, kan Nanopatch ™ immunisering slutt bety lavere doser av alun adjuvans VLP kan brukes til å lokke fram en varig immunrespons hos mennesker.
Fremtidig arbeid vil fokusere på å forbedre dose sparing i Nanopatch ™ immunisering, og undersøker termostabilitet. For dette formål, tørr belagt VLP integritet, utforske unadjuvanted VLP og bedre formuleringer vil bli utredet.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til university of Queensland dyreetiske regler.
Nanopatch ™ Fabrication
Nanopatches ™ ble fabrikkert av Deep ioneetsning ifølge patent [51] i Rutherford Appleton Laboratory, Oxford, UK. Nanopatches ™ ble frese belagt med gull til en tykkelse på 100 nm. Uniform morfologi ble bekreftet av Scanning elektronmikroskopi (SEM) på en Philips XL30. Prøvene ble skråstilt i 45 ° for å bekrefte passende fremspring profil.
Nanopatch ™ Coating
Gardasil® (Merck, USA) ble sentrifugert ved 5000 g i 15 minutter for å klumpe alun med den adsorberte virus lignende partikler. Supernatanten ble fjernet og pelleten på nytt suspendert i metylcellulose til en sluttkonsentrasjon på 10 ug /ul metylcellulose, og 100 ng /mL av HPV-16-VLP. Ti-ganger seriefortynninger ble fremstilt i 10 ug /mL metylcellulose for å formulere forskjellige doser. Methocel® 60 HG – Methyl-cellulose (katt # 646555) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia)
Nanopatches ™ med 110 mikrometer lange nåler ble belagt med pipettering 8 mL av belegg løsning på. overflaten og tørre belegget via nitrogen stråle som tidligere beskrevet [42]. Passende belegg morfologi ble bekreftet av SEM.
Nanopatch ™ Immunization
Fire grupper (N = 5) av kvinnelige C57BL /6 mus på 6 uker gammel ble bedøvet med Ketamil® og Xylasil®. Musene ble deretter lappet en gang i hvert øre på ventral side ved hjelp av en fjær enhet for å bruke oppdateringen på 2,0 ms
-1 – en hastighet funnet å gi maksimal nålkraft uten å skade vev (data ikke vist). Dosene er angitt i dette dokumentet refererer til total HPV-16 dose for hver immunisering fordelt over to Nanopatches ™, og musene ble immunisert på dag 0 og forsterket ved dag 14. Patches ble holdt in situ i 5 minutter. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Health and Medical Research Council (Australia). Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved University of Queensland (Permit Number SHT /020/10 (NF)). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
intramuskulære injeksjoner
Gardasil doser ble konsentrert ved sentrifugering ved 5000 g i 15 minutter. Overskudd av Supernatanten ble fjernet og pellet ble resuspendert i den passende mengde av supernatant for å gi et HPV-16-VLP-konsentrasjon på 0,2 pg /pl. Fire 10-gangers seriefortynninger ble fremstilt i overskudd av supernatanten.
Fem grupper (N = 5) fra C57BL /6 mus i 6 uker gamle ble immunisert intramuskulært på dag 0 og forsterket på dag 14 med 25 pl levert ca 2 mm i hver hale muskel av bakben med hver gruppe mottok 10 ug, 1 ug, 100 ng, 10 ng, eller en ng av HPV-16 per mus per immunisering.
Kontroll Søknad
Aktuelt kontroll: En gruppe (N = 5) fra C57BL /6 mus i 6 uker gamle ble bedøvet med ketamil og xylasil. Mus ble tilbakeholdne med ventral øre overflate flat, og 125 ul av Gardasil® (inneholdende 10 ug av HPV-16) ble påført topisk i fem minutter
Fluvax immunisert kontroll. En gruppe (N = 5) fra C57BL /6 mus på 6 uker gammel ble bedøvet med Ketamil® og Xylasil®, og immunisert intramuskulært med 6 mikrogram Fluvax 2008® (CSL Ltd., Melbourne, Australia) i et volum på 30 mL.
immunisert kontroll : En gruppe (N = 5) av C57BL /6 mus på 6 uker ble bedøvet med Ketamil® og Xylasil® og ofret umiddelbart etter opphør av reflekser ved hjertestans punktering
Sera samling
Blood. prøvene ble tatt på dag 28 og 112 etter vaksinasjoner av retro-orbital blødninger, og serum separert. Sera ble lagret ved -20 ° C inntil analyse.
Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Prøvene ble undersøkt i sekundærelektron og tilbake spredte elektron moduser i en Philips XL30.
