Abstract
Bakgrunn
Proteomikk er ventet å spille en sentral rolle i kreft biomarkører. Selv om det har blitt mulig å raskt analysere proteiner fra rå celleekstrakter ved hjelp av massespektrometri, vanskeliggjør komplekse prøvesammensetningen denne type måling. Derfor, for effektiv proteom analyse, blir det avgjørende å berike prøver for analyttene av interesse. Til tross for at en tredjedel av proteiner i eukaryote celler er tenkt å bli fosforylert på et tidspunkt i sin livssyklus, er bare en lav prosentandel av intracellulære proteiner fosforylert på et gitt tidspunkt.
metodikk /hovedfunnene
i dette arbeidet har vi brukt kromatografiske phosphopeptide berikelse teknikker for å redusere kompleksiteten i kliniske prøver. En ny metode for high-throughput peptid profilering av humane tumorprøver, ved hjelp av parallell IMAC og MALDI-TOF MS, er beskrevet. Vi har brukt denne metoden til å analysere menneskelige normale og kreftlunge prøver i jakten på nye biomarkører. Ved hjelp av en svært reproduserbar spektral behandling algoritme for å produsere peptid masse profiler med minimal variasjon på tvers av prøvene ble det lineære diskriminantfunksjoner baserte og beslutnings tree-basert klassifiseringsmodeller generert. Disse modellene kan skille normal fra tumorprøver, samt skille de ulike ikke-småcellet lungekreft histologiske subtyper.
Konklusjon /Betydning
En roman, optimalisert prøveopparbeidelse metode og en forsiktig data anskaffelses strategi er beskrevet for high-throughput peptid profilering av små mengder av normale humane lunge- og lungekreft prøver. Vi viser at den passende kombinasjon av peptid uttrykk verdier er i stand til å diskriminere normal lunge fra ikke-småcellet lungekreft prøver og mellom ulike histologiske subtyper. Vår studie gjør understreke det store potensialet for proteomikk i molekylær karakterisering av kreft
Citation. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro jeg, Nistal M, Calvo E, Madero R, Díaz E et al. (2009) MALDI Profilering of Human Lung Cancer Subtyper. PLoS ONE 4 (11): e7731. doi: 10,1371 /journal.pone.0007731
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 03.07.2009; Godkjent: 08.10.2009; Publisert: 05.11.2009
Copyright: © 2009 Gámez-Pozo et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte : FIS CP05 /00248, FIS PI050668 og Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Cancer (RTICC, RD06-0020-1022) fra Fondo de Investigacion Sanitaria (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacion, Spania). Finansiert av Fundacion Mutua Madrilena. A. Gamez-Pozo er mottaker av et fellesskap av Ministerio de Educacion, Spania. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i vestlige land, representerer lungekreft den ledende årsak til kreft dødsfall [1]. Den 5-års overlevelse rate er 15% og det har ikke bedret seg over mange tiår. Dette er hovedsakelig fordi omtrent to tredeler av lungekrefttilfellene oppdages ved avanserte stadier. Videre, selv blant tidlig stadium pasienter som behandles primært etter kirurgi med kurativ hensikt, vil 30-55% utvikler og dør av metastase tilbakefall [2].
I dag er lungekreft klassifisert i henhold til histologiske kriterier. De fire viktigste undertyper er: småcellet lungekreft (SCLC), plateepitelkarsinom (SC), adenokarsinom (AC), og stor celle karsinom (LC). Klinisk, er de siste tre anses som ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som står for ca 85% av alle lungekrefttilfellene [3]. Presis diagnose og klassifisering av kreft er avgjørende for valg av passende terapier. Ankomsten av effektive målrettet terapi for lungekreft, for eksempel epidermal vekstfaktor reseptor hemmere erlotinib og gefitinib, og utsiktene til å utvikle flere målrettede terapier, har understreket viktigheten av nøyaktig diagnose [4].
Proteomikk er forventes å spille en nøkkelrolle i kreft biomarkører. Selv om det har blitt mulig å raskt analysere proteiner fra rå celleekstrakter ved hjelp av massespektrometri, prøve kompleksitet kompliserer disse studiene [5], [6]. Derfor, for effektiv proteom analyse er det nødvendig å anrike prøver for analytten av interesse [7]. Til tross for det faktum at en tredjedel av proteiner i eukaryote celler er antatt å være fosforylert på et eller annet punkt i deres livssyklus, er bare en lav prosentandel av intracellulære proteiner fosforylert på et gitt tidspunkt [8], [9]. Dermed vil et rensetrinn eller anrikning som isolerer fosforylerte art redusere kompleksiteten og øke følsomheten [10].
MALDI profilering er en av de mest lovende teknikker for å redusere gapet mellom high-throughput proteomikk og klinikk [7] , [11]. MALDI MS kan brukes som en high-throughput-metoden med fremragende følsomhet [6], slik at studier kompromitterende store serier av pasientene, og har potensial til å revolusjonere tidlig diagnose av mange sykdommer [12]. Denne kapasiteten er eksemplifisert ved MALDI protein profilering på kreftprøver, som tillot identifisering av markører som kan være korrelert med histologiske vurdering og pasientens utfall gjennom statistisk analyse [13], [14]. I dette arbeidet har vi brukt phosphopeptide berikelse teknikker til små kliniske prøver basert på immobilisert Metal Affinity Chromatography (IMAC) for å redusere prøve kompleksitet. For å oppdage nye biomarkører, har vi definert en dataanalyse arbeidsflyt anvende lineære diskriminantfunksjoner baserte og beslutningstrær baserte klassifiseringsmetoder for å analysere peptid profiler fra humane normale og kreftlungeprøver ved massespektrometri.
Metoder
Etikk uttalelse
på tidspunktet for første diagnose, hadde alle pasientene gitt samtykke i den forstand at deres tumorprøver kunne brukes til investigational formål. Institusjonelle godkjenning fra vårt etiske komiteen ble innhentet for gjennomføringen av studien (Comité Ético de INVESTIGACION Clínica, Hospital Universitario La Paz). Data ble analysert anonymt. Pasienter gitt skriftlig samtykke, slik at deres prøver og kliniske data kan brukes til investigational formål
Prøve utvalg
Frosne prøver fra pasienter diagnostisert med lungekreft. (15 adenokarsinom (AC), 15 Squamous cell carcinoma (SC) og 14 store karsinom (LC) prøver) og 15 normal lunge (NL) prøver ble hentet fra Avdeling for patologi Hospital Universitario La Paz (Madrid, Spania). De histopatologiske funksjonene i hver prøve ble anmeldt av en erfaren lunge patolog for å bekrefte diagnosen og tumor innhold. Kvalifiserte prøvene måtte omfatte minst 50% av kreftceller.
Total protein utvinning, oppløselighet, og fordøyelsen
Prøver ble kuttet i en Leica CM3050S cryostat, skaffe 10 deler av 10 mikron tykkelse hver. Vev ble behandlet med TRIzol reagens (Invitrogen, Carsbald, CA, USA) etter produsentens anvisninger. Pellets ble resuspendert i guanidinhydroklorid 6 M og oppvarmet 10 minutter ved 95 ° C under omrøring. Deretter ble 950 ul 50 mM ammonium-bikarbonat (pH 7-9) per prøve tilsatt. Protein prøvekonsentrasjon ble målt ved MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Trypsin MS Grade gull (Promega, Madison, WI, USA) ble tilsatt til hver prøve i et 01:50 forhold. Fordøyelse ble utført over natten ved 37 ° C. Det fordøyde Prøven ble delt i to alikvoter.
Parallell IMAC (PIMAC)
IMAC-Fe (III) basert ble utført på en porsjon av fordøyde protein med PHOS-Select Jern affinitetsgel (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) etter produsentens anvisninger. IMAC-baserte Ga (III) ble utført i den annen delmengde av fordøyd protein med Phosphopeptide Isolation Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) etter produsentens anvisninger. Prøvene ble lagret ved -20 ° C inntil videre analyse.
Phosphopeptide analyse ved massespektrometri
Peptide Blandingene ble vakuumtørket og oppløst i en oppløsning inneholdende acetonitril (30%) og TFA (0,1% ). Etter bad-sonikator (3 min), peptidene var 01:01 blandet med enten α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) eller 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) anvendt som matriser. Et volum på 0,5 ul ble avsatt på MALDI plate og ble holdt ved romtemperatur inntil tørket. MALDI-MS-spektrene (to replikater) ble målt på et Bruker Ultraflex TOF /TOF MALDI massespektrometer (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, USA) [15] i den positive ion reflektoren modus. For protein identifikasjon, peptid-ionene av interesse var utsatt for MALDI-MS /MS-analyse i TOF /TOF-modus, og den tilsvarende MS /MS-spektra ble overført via MS BioTools program (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, USA) som innganger til å søke på NCBInr databasen ved hjelp MASCOT programvare (Matrix Science, London, UK) [16].
Differensial m /z topper utvalg
ClinProTools (CPT) programvare 2.1 (bruker-Daltonics , Billerica, MA, USA) ble anvendt for å velge differanse m /z topper blant prøver undertyper (NL, AC, SC og LC). Spectra ble behandlet som følger:
Normalisering av alle spektre til deres totale Ion Count, etter
kalibrering av spektra på hverandre ved hjelp av de mest fremtredende m /z topper, etter
Baseline subtraksjon og m /z toppdeteksjon.
Når standardisert og justert, velger CPT masse områder som ble ansett som m /z topper, og beregner topparealene for hvert spektrum [17]. Spectra ble delt inn i to sett (Set 1 og Set 2), som inkluderer en annen spot måling per prøve. Hvert sett ble delt i fire spektra grupper avhengig av kombinasjoner mellom MALDI matrise og IMAC metall (Mx-Mt) som brukes for å få tak i dem (DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe og CHCA-Ga). Hver av disse spektra gruppene ble deretter delt inn i histologiske undergrupper (NL, AC, SC og LC) og analyseres separat av CPT. CPT innstillingene var S /N 3 og Savitzky-Golay glatting (en syklus, m /z område = 5) [18]. Kombinasjonen av disse listene gir en kombinert Mx-Mt m /z topp-listen. Da vi inkludert alle spektre av en Mx-Mt kombinasjon i CPT å måle alle m /z topper i korrespondent kombinert Mx-Mt m /z topp liste. Topper med Kruskal-Wallis p-verdi 0.1 ble forkastet. Felles m /z topper mellom to sett ble valgt. Til slutt ble test Pearson mellom arealverdier for hver m /z topp oppnådd i Set 1 og 2 sett for alle prøver utført, og m /z topper med r 0,4 ble utelatt. Dermed fikk vi fire finale Mx-Mt lister m /z topper: DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe og CHCA-Ga lister. Valgte m /z toppene ble betraktet som konsekvent topper.
diskriminant analyse og modell generasjon
diskriminant analyse av hver endelige Mx-MT m /z topp listene ble utført i SPSS 9.0. m /z toppene på hvert diskriminant modellen ble inkludert i en andre Trinnvis diskriminant analyse, som tillot opprettelsen av en global diskriminering modell, inkludert m /z topper fra alle Mx-Mt kombinasjoner.
Veiledet hierarkisk clustering
i korthet er en vektor som er tilordnet hver pseudo-element, og denne vektoren benyttes for å beregne avstandene mellom denne pseudo-elementet og alle de gjenværende elementer eller pseudo-elementer ved hjelp av den samme likheten metrisk som ble brukt for å beregne den første likhetsmatrise. Analyser ble utført i BRB-ArrayTools v3.6.1 utviklet av Dr. Richard Simon og Amy Peng Lang.
Decision-tree ensemble algoritme
Med sikte på å velge topper som kan skille mellom histologiske subtyper av lungekreft prøver, bygde vi en multi-peak klassifikator hjelp AdaBoost beslutningstre baserte klassifiserings ensemble [19], [20]. Tre uavhengige analyser ble utført: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) og SC vs. (AC + LC) med den endelige DHB-Ga m /z topp liste. Normaliserte m /z toppintensitetsverdier fra set1 ble brukt som treningssett. Normaliserte m /z toppintensitetsverdiene fra SET2 ble anvendt som testsett. 200 iterasjoner ble utført i alle tilfeller. Arealet under ROC (Motta Drifts Karakteristisk) kurven (AUC) er lik sannsynligheten for korrekt klassifisering av ett par av prøver, hver for en egen klasse, og blir brukt som et mål på klassifikator ytelse (20). Statistiske analyser ble utført i R versjon 2.4 med Boost programvarepakken versjon 1,0 til 0 og SPSS 9.0.
Statistiske analyser for identifiserte topper
Etter protein identifikasjon av MS /MS, ANOVA (når det er mulig ) og Kruskall-Wallis analyser ble utført for å vurdere forskjeller i ekspresjon av slike proteiner i de forskjellige histologiske subtyper. Mann-Whitneys U ble brukt til å studere forskjellene mellom to undergrupper etter Kruskall-Wallis analyser. Statistiske analyser ble utført i SPSS 9.0.
Immunohistochemistry
Formalin fiksert, parafininnstøpte vevsblokker, representant for NSCLC diagnose, ble hentet følgende rutine histopatologisk vurdering. Snittene ble behandlet ved hjelp av en Dako Autostainer universell farging system (Dako, Glostrup, Danmark). For denne studien ble 3,5-mikrometer seksjoner immunostained med monoklonalt antistoff CK8 (1:100 fortynning, Novacastra, Newcastle upon Tyne, UK). To vevssnitt fra hver prøve ble evaluert.
Resultater
Hovedmålet med denne studien var å teste om tryptiske peptid profiler, fra menneskelige normale og kreftlunge prøver ved hjelp PIMAC og MALDI- TOF MS teknikker, kunne diskriminere Normal Lung (NL) fra lungekreft, samt mellom de vanligste lungekreft histologiske undergrupper: adenokarsinom (AC), Large Cell karsinom (LC) og plateepitelkarsinom (SC). Bare 49 fra 59 prøver ble valgt for påfølgende analyse fordi prøvene uten et minimumsinnhold på 50% tumorceller ble kastet. Således, 15 NL, 14 AC, 9 LC og 11 SC prøver ble deretter analysert. Massespektret generert for hver prøve inneholdt typisk flere hundre topper med S /N . 3 [5]
Massesignalintensitetene av tryptiske peptider avledet fra komplekse proteinblandinger blir formidlet av flere faktorer, nemlig relativ proteinkonsentrasjonen , varierende enzymatisk fordøyelse effektivitet, og sekvensavhengig desorpsjon /ionisering effektivitet. Vi utførte en meget reproduserbar spektra prosesseringsprosedyre for å oppnå topp-profiler med en høy grad av overensstemmelse i prøven serie. Konsistente m /z topper ble valgt etter følgende kriterier: massetopper måtte være til stede i begge prøve flekker og Pearsons korrelasjon mellom intensitetene av hver topp oppnådd i Set 1 og 2 sett for alle prøver måtte være 0,4. Mean Pearsons korrelasjonskoeffisient var 0,8 for DHB topper og 0,65 for CHCA topper. Et tilleggskrav (Kruskal-Wallis p-verdi 0,1) ble brukt for å inkludere topper med diskriminerende makt mellom prøve subtyper. Disse kriteriene gitt en konsekvent og reproduserbar metode, slik som vist ved midlere Pearsons korrelasjonskoeffisient på utvalgte massetoppene.
Vi har undersøkt den overlappingen mellom toppene som er valgt av hver av de Mx-Mt kombinasjoner (fig S1). Overall, 97 konsistente masse toppene ble identifisert på tvers av de fire Mx-Mt kombinasjoner. Angå MALDI matriser, ble 81 topper målt i DHB og 41 i CHCA analyser. Contrastingly, ble 80 topper målt i Ga-baserte iMac og 42 i Fe-baserte iMac-analyser. I begge tilfellene ble 25 overlappende topper funnet. Bare fire toppene var konsekvent stede på tvers av alle Mx-Mt kombinasjoner.
Når konsekvente toppene hadde blitt valgt, ble en Trinnvis diskriminant analyse utført i hver finale Mx-Mt topp liste. Derfor ble fire diskriminantfunksjoner modeller konstruert og masse signalene som er involvert i hver modell er oppført i Tabell S1. Alle disse diskriminantfunksjoner modellene var i stand til å klassifisere prøvene inn i fire grupper, tilsvarende NL, AC, SC og LC. Prosenter av korrekt klassifisert prøver av hver modell og leave-one-out kryssvaliderings prosenter av korrekt klassifisert prøvene er vist i tabell S1. En annen Trinnvis diskriminant analyse ble utført med topper som inngår i de fire Mx-Mt diskriminantfunksjoner modeller (22 topper) for å unngå å inkludere støyende masse signaler i analysen. The Global Model inkludert 9 m /z topper og riktig klassifisert 98,0% av prøvene (48 av 49) i LOOCV.
Vi utførte en Overvåket hierarkisk Tyngdepunktet Heis Clustering bruke de 9 toppene som inngår i den globale modellen. Som vist i figur 1, er det to hoved klynger, som skiller normale lungeprøver fra de fleste tumorprøver. Det er imidlertid ikke perfekt adskillelse mellom histologiske subtyper. Med mål om å velge masse signaler som kan karakterisere prøver fra en histologisk subtype sammenlignet med de andre subtyper av NSCLC prøvene, ble AdaBoost beslutningstre baserte klassifiserer ensemble utført. Tre uavhengige analyser ble utført: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) og SC vs. (AC + LC), ved hjelp av data i Set en som treningssett og data i Set 2 som testsett fra den endelige DHB-Ga topp liste. Arealet under kurven (AUC) fra ROC ble beregnet for hver sammenligning i både trening og testsett. Den relative betydning av hver topp i modellgenerer ble oppnådd. Arealet under ROC-kurven og topp topper for hver sammenligning er vist i tabell 1.
Varmekart av tilsyn Hierarkiske Tyngdepunktet Heis Clustering av normalisert m /z topparealer, i to dimensjoner, for de 49 prøvene og de 9 m /z topper som inngår i den globale diskriminant modellen.
MS /MS identifisering av noen m /z topper valgt av diskriminant og AdaBoost analyser ble utført av MALDI-TOF /TOF ( Tabell S2). For å evaluere forskjellene i de identifiserte peptid signaler mellom histologiske subtyper, analyser ANOVA og Kruskal-Wallis ble utført. p-globin masse signaler viste en betydelig redusert intensitet i tumorprøver sammenlignet med normal lunge seg, mens GAPDH og p-aktin toppene viste økt intensitet i tumorprøver. CK8 peak intensitet redusert i store cellekreft sammenlignet med adenokarsinom og plateepitelkarsinom prøver.
Mønsteret uttrykks ved immunhistokjemi (IHC) av noen av disse markørene ble analysert. Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) [21] viser ekspresjon og lokalisering av proteiner i et stort utvalg av humane normale og kreft vev, samt cellelinjer ved hjelp av IHC. IHC uttrykk profiler for β-aktin og GAPDH ble evaluert på dette nyttig database. Det er en økt ekspresjon av β-aktin i enkelte lungekreft prøvene sammenlignet med normale seg. Imidlertid er GAPDH uttrykk i lungekreft svært variabel. I tillegg utførte vi IHC analyse av CK8 uttrykk i fem AC, LC og SC prøver. Positive celler for CK8 farging ble funnet i alle LC og AC prøver. I motsetning til bare tre av fem SC prøvene viste positiv farging. Positivt farget prøvene viste i gjennomsnitt 20-70% fargede celler (figur 2).
CK8 farging (Forstørrelse × 40). Pilene peker på tumorceller. (A) Plateepitelkarsinom i lungene som viser negative fargede tumorceller. Lungeepitelet viser positiv farging. (B) Plateepitelkarsinom i lungene positivt farget. (C, D) Stort cell carcinoma av lungen som viser ulike grader av positiv farging. (E, F) Adenokarsinom i lungene som viser ulike grader av positiv farging.
Diskusjoner
Globalt gen-uttrykk profilering har forbedret vår forståelse av histologiske heterogenitet av ikke-småcellet lungekreft og har identifisert potensielle biomarkører og gen signaturer for å klassifisere pasienter med signifikant forskjellige overlevelses utfall [22]. En helhetlig forståelse av mekanismene bak kreftutvikling, tumorprogresjon, og metastase vil kreve en grundig analyse av ikke bare genomet, men også proteomet [23]. Analyser på gennivå kan ikke oppdage de biologiske spissfindigheter introdusert gjennom posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner og krever dermed en proteomikk tilnærming [5], [24].
reproduserbarhet har vist seg å kompromisse protein profilering i alle ledd, fra peptid isoleringsmetoder for å prøve spektra kjøp og behandling [5], [11], [25], [26]. I denne studien har vi brukt phosphopeptide berikelse kromatografiske teknikker for å redusere kompleksiteten i humane lungekreftprøver og analysert isolert peptider ved MALDI-TOF MS. Vi beskriver en masse topp valgmetode som gir en reproduserbar peptid profil fra MALDI MS eksperimenter ved hjelp ClinProTools. Groseclose et al. beskrevet en begrensning av ved hjelp av CPT er at toppene som kan ha betydning blant en liten undergruppe av spektra i en gruppe, kan bli ubetydelig når midlet sammen med de andre spektrene i den gruppen [5]. For å kunne vurdere så mange topper som mulig, utførte vi et tidligere trinn i topp valg med CPT. I hvert Mx-Mt analyse ble alle spektre fra en enkelt prøve subtype introdusert i CPT, få en subtype karakteristisk topp liste. Når alle undertype listene ble erholdt, ble en ny liste generert av kombinasjonen, inkludert alle topper er tilstede i disse subtype lister. Etterpå spektra fra alle prøve undergrupper ble inkludert i CPT, og alle toppene i denne kombinerte listen ble målt. Vi bekreftet at noen diskriminantfunksjoner topper ble ekskludert da spektra fra alle prøve subtyper inngår direkte i CPT og standard Analysen er utført.
Det er bemerkelsesverdig at når du bruker DHB som en MALDI matrise gitt et høyere antall masse topper som sammenlignet med CHCA. Likeledes produserer Ga-baserte IMAC tilnærming flere masse signaler i forhold til Fe-baserte analysen. I tillegg er topplistene avledet fra DHB spektra viste en høyere middel korrelasjon mellom datasettene. Disse resultatene tyder på at MALDI-analyser ved hjelp av Ga-baserte IMAC og DHB som MALDI matrise er mer reproduserbar og gir et høyere antall massesignaler. Toppene er identifisert som stammer fra høyt uttrykte proteiner og de resterende diskriminerende peptider kunne ikke bli identifisert med MALDI MS. Alternative strategier identifikasjons bør testes for å øke identifisering av lav intensitet signaler i MALDI MS studier.
diskriminant analyser tillater oss å separere normale lunge og NSCLC-prøvene og identifisere peptider som best diskriminerte mellom normal og sykelig vev, som vist ved clustering analyse (figur 1). Imidlertid er denne oppgaven vanligvis ikke problematisk på grunn av de viktige forskjeller mellom normale og kreft vev. Hva beviser vanskeligere er å finne forskjellene mellom ulike histologiske subtyper. Som vist i figur 1, er det to hoved klynger av lungekreftprøver, inkludert adenokarsinomer og store cellekreft separat, men plateepitelkarsinom prøvene er delt mellom disse klyngene.
Det har blitt beskrevet som ensemble classifiers utkonkurrere enkelt beslutning trær klassifiserer ved å ha større nøyaktighet og mindre prediksjonsfeil når den brukes til proteomikk datasett [27]. Så testet vi om AdaBoost analyserer kunne klassifisere de forskjellige NSCLC prøvene riktig. Våre resultater tyder på at AdaBoost kan diskriminere prøver av en lungekreft histologisk subtype fra de to andre. Bruk av tekniske replikater som testsett tillatt oss å vurdere robust av de sysselsatte metodikk.
Våre data tyder på at både GAPDH og β-aktin har en betydelig økt uttrykk i lungekreft prøver. Overekspresjon av GAPDH i humane lungekreft ble beskrevet tidligere av Tokunaga et al [28] og det finnes mange publikasjoner som viser økt ekspresjon av GAPDH i bryst [29], bukspyttkjertel [30] og [cervikale 31], [32] humane kreftformer. På den annen side er flere studier indikerte at β-aktin ble uttrykt forskjellig i human cancer (oversikt i 28). Begge proteiner viste økt nivå i rotte hepatoma [33]. Videre IHC uttrykk profiler for β-aktin og GAPDH, vurdert i Human Protein Atlas, var svært variabel i lungekreft prøver. Disse resultatene spørsmålstegn ved anvendelsen av disse proteinene som husholdningsprodukter i proteomic analyser av kreftprøvene.
Cytokeratin 8 (CK8) er en type II mellomliggende filamentprotein som er vedvarende uttrykkes i de fleste epitel-maligniteter [34], inkludert alle NSCLC-subtyper [35]. Økte nivåer av CK8 i sera har vært forbundet med tumorprogresjon og redusert overlevelse hos pasienter med NSCLC [36]. I motsetning til disse rapportene, kan vi ikke observere økt uttrykk for CK8 i tumorprøver ved MALDI-MS analyser. Men vi fant ut at CK8 nivåer er redusert i store cellekreft prøvene sammenlignet med normal lunge.
For å vurdere nytten av CK8 uttrykk som en biomarkør for store cellekreft, utførte vi IHC analyser av CK8 uttrykk i 15 lungekreft prøver (fem AC, fem LC og fem SC). Etter vår mening, kunne ingen konklusjon gjøres om forholdet mellom IHC og peptid uttrykk profilering fra våre data. Denne forskjellen mellom teknikker kan skyldes phosphopeptide berikelse før prøveanalyse eller kunne innebære at MS tilnærminger er mer følsomme enn IHC. Peptidet identifisert ved MALDI MS /MS (DVDEAYMNKVELES) inneholder et potensielt fosforyleringssete i det Tyr204, relatert til fosforylering av onkogene kinaser [37]. Tidligere studier som vurderer nytten av CK8 som en biomarkør for kreft i lunge inkluderte ikke noen stor cellekreft [35], [36].
Studien har noen begrensninger. Det er således begrenset kapasitet til å identifisere små massetopper basert på MS /MS-analyse av forholdsvis kompliserte peptidblandinger. Imidlertid har MALDI MS noen fordeler for biomarkører og protein ekspresjon og relative kvantifisering data kan genereres for flere pasient vevsprøver i et enkelt eksperiment. På den annen side, sammenligning av IHC og peptid profilering uttrykk verdier forholdet bør gjøres nøye, så virker det som før affinitet anrikning av prøvene kunne introdusere noen skjevhet.
Men vår studie viser imidlertid at det store potensialet for proteomikk i den molekylære karakterisering av kreft. Identifisering av forskjellig uttrykt proteiner ved PIMAC og MALDI-TOF /TOF MS ble utført på fraksjonerte tryptiske fordøyer som stammer fra små mengder vev oppnådd fra normal lunge og NSCLC prøvene. Ved hjelp av en optimalisert prøveopparbeidelse metode og en forsiktig datainnsamling strategi, overvant vi den store utfordringen med reproduserbarhet av MALDI MS-baserte peptid profilering. Uavhengig av arten av peptidene identifisert ved MS /MS, er den passende kombinasjon av peptid uttrykk verdier i stand til å diskriminere normal lunge fra NSCLC prøver og blant de forskjellige NSCLC histologiske subtyper. Fremtidige studier er rettet mot å etablere peptid profilering som et nyttig verktøy i oppdagelsen av nye biomarkører med diagnostisk eller theragnostic relevans.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Venn-diagrammer som viser m /z topper overlappende mellom endelige m /z peak lister fra:. (A) fire ulike Mx-Mt kombinasjoner, (B) IMAC harpiks, og (C) MALDI matriser
doi: 10,1371 /journal.pone.0007731.s001 product: (0,04 MB PPT)
Tabell S1.
Prosenter av riktig klassifisert prøver, leave-en ut kryssvaliderings prosenter av korrekt klassifisert prøver og m /z topper som inngår i hver Mx-Mt kombinasjon diskriminant modell. Toppene i fet skrift er også inkludert i 9 m /z topper global diskriminering modell
doi:. 10,1371 /journal.pone.0007731.s002 plakater (0,03 MB DOC)
Tabell S2.
forskjellig uttrykt peptid masser fra CHCA-MALDI spektra identifisert av MALDI-TOF /TOF og MASCOT søkemotor. Individuell MASCOT ioner score er signifikant (p 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0007731.s003 plakater (0,03 MB DOC)
