Abstract
Nye biomarkør analyser og oppgraderte analyseverktøy er sterkt behov for å nøyaktig skille benign prostatahyperplasi (BPH) fra prostatakreft (CAP). For å møte dette udekket klinisk behov, rapporterer vi en piezeoelectric /magnetiske kuler-baserte analysen for å kvantifisere prostataspesifikt antigen (PSA, fritt og totalt), prostata syre fosfatase, karboanhydrase 1 (CA1), osteonectin, IL-6 løselig reseptor (IL -6sr), og spondin-2. Vi brukte sensor for å måle disse syv proteiner i serumprøver fra 120 godartet prostata hypertrofi pasienter og 100 Gleason scorer 6 og 7 Cap hjelp serumprøver tidligere innsamlede og banked. Resultatene ble analysert med mottageroperatøren karakteristisk kurve analyse. Det var signifikante forskjeller mellom BPH og lue pasienter i Ptil, CA1, og spondin-to analyser. Den høyeste AUC diskriminering ble oppnådd med en spondin-2 eller gratis /total PSA drift-området under kurven var 0,84 med en p-verdi under 10
-6. Noen av disse data synes å motsi tidligere rapporter og fremheve viktigheten av utvalgs og riktig analyse bygning i utvikling av biomarkør måle ordninger. Denne perle-baserte systemet gir viktige fordeler i analysen bygningen, deriblant lav pris, høy gjennomstrømming og rask identifisering av et optimalt tilpasset antistoff par
Citation. Jokerst JV, Chen Z, Xu L, Nolley R, Chang E Mitchell B, et al. (2015) En magnetisk Bead-Based Sensor for kvantifisering av Multiple Prostate Cancer Biomarkers. PLoS ONE 10 (9): e0139484. doi: 10,1371 /journal.pone.0139484
Redaktør: Chandan Kumar-Sinha, University of Michigan, USA
mottatt: 22. januar 2015. Godkjent: 13 september 2015; Publisert: 30.09.2015
Copyright: © 2015 jokerst et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av USA National Cancer Institute Grant U01 CA152737, R25-T CA118681 og Canary Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er den nest største årsaken til kreftdød i amerikanske menn, har ennå effektiv screening og prognostication verktøy vært unnvikende på grunn av ikke-spesifikke analyser og biomarkører [1]. Mens enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) er gullstandarden for måling av serumproteiner, det lider av lang analyseutviklingstiden for nye biomarkører, høye prøvevolumer, og krever mange kompliserte betjeningstrinnene. ELISA kan også lider av høyt bakgrunn og ikke-spesifikke forstyrrelser fordi den bruker en optisk-baserte rapporteringsordning.
For å løse dette, har mange konkurrerende teknologier er foreslått inkludert chemiluminescent-, microfluidic- [2], nanotechnology- [3], og magnetbaserte [4] tilnærminger. Imidlertid er mange av disse fremgangsmåter lider av høye kostnader, lav gjennomstrømning, lange assay byggetider, og behovet for en erfaren operatør. Dermed vil en kraftig men enkel analyse plattform med universell nytte for et bredt spekter av protein biomarkører har ennå ikke rapportert. Spesielt ville det biomarkør samfunnet være tjent med analytiske verktøy for paneler av biomarkører.
Ja, flere nyere studier har antydet at paneler av biomarkører kan være mer effektiv på tidlig identifisering av kreft og klassifisering av sykdom aggressivitet enn prostata spesifikt antigen [5] eller andre enkeltpunkt assays [6, 7]. Faktisk, på grunn av det dype biologiske kompleksiteten av kreft, gjør det synes logisk at bestemmelse av mer enn en biomarkør ville være fordelaktig i nøyaktig prognosticating eller detektere sykdom i det høyeste antall pasienter. Disse panelene omfatter transmembranproteiner [8], metabolitter [9], autoantistoffer [10], ikke-kodende RNA for eksempel
PCA3 product: [11], genfusjoner inkludert
TMPRSS2-ERG
[12], sirkulerende tumorceller [13, 14], DNA metylering mønstre [15], genet profilering [16], exosomes /prostasomes [17], og mange andre [18].
Her beskriver vi en piezoelektrisk membran basert tilnærming som bruker spesifikke interaksjoner med magnetiske kuler for å kvantifisere prostata kreft biomarkører med mange fordeler for analysen bygning: 1) Denne tilnærmingen er nesten matrise-fri fordi den bruker magnet og piezo-basert kvantifisering ordninger snarere enn optikk; 2) Systemet kan hurtig (mindre enn 2 dager) identifisere en matchet antistoff par for immunoanalyse; 3) Systemet har deteksjonsgrenser log ordrer lavere enn ELISA på grunn av aviditet av det tredimensjonale vulsten versus plane ELISA; og 4) Systemet er i stor grad operatøruavhengig.
Vi brukte dette verktøyet for å skape en prostatakreft biomarkør panel og evaluert sin nytte fra prøver fra Cap pasienter og pasienter med benign prostatahyperplasi (BPH). Vi fokuserte på serumproteiner på grunn av deres enkle prøvetaking, etablert rolle i sykdoms identifisering og overvåking, og det store antallet banked serumprøver tilgjengelig for testing. Vi inkluderte nylig identifiserte markører samt etablerte PSA-baserte tester. Syv proteiner ble inkludert i dette panelet basert på dagens litteratur forståelse av Cap:
PSA [5] er en enzymatisk glykoprotein produsert av prostata med funksjon i sperm motilitet [7]. Dette panelet omfatter både fritt PSA (fPSA) kompleksbundne å anstand karbohydrater proteiner og total PSA (TPSA) som inkluderer både kompleksdannede og isomerer [19, 20].
prostata syre fosfatase (PAP) er et 100 kD glykoprotein syntetiseres i prostata som hydrolyserer fosfatestere ved sur pH. PAP er dokumentert i den historiske litteraturen og ble brukt før identifisering av Ptil for å oppdage og overvåke Cap [21]. Paneler utnytte PAP har vist økt spesifisitet, men ingen økning i følsomhet [22].
karbonanhydrasehemmere 1 (CA1) er en metalloenzyme innblandet i omdannelse av oppløst CO
2 og vann i bikarbonat og er ansvarlig for pH regulering. CA1 har nylig blitt vist å være oppregulert i Cap pasienter gjennom massespektrometrisk profilering [23].
utskilt protein syrlig og rik på cystein (SPARC), også kjent som osteonectin eller kjeller-membranprotein 40 er en 40 kD protein innblandet i migrasjon av prostatakreftceller [24] og metastatisk prostatakreft [25].
interleukin-6 (IL-6) er en inflammatorisk cytokin. IL-6 og dens ligand IL-6 oppløselig reseptor (IL-6SR) er korrelert med aggressiv sykdom, inkludert høyere Gleason score, avansert stadium, utvikling av metastase og redusert overlevelse [26, 27]. Sirkulerende nivåer av både IL-6 og IL-6SR antas å resultere fra den primære svulsten i motsetning til metastatisk innskudd [7].
Spondin-2 (SPON2) arbeider med Wnt veien å aktivere beta catenin og kan lette morfogenese [28]. SPON2 har vist seg å være overuttrykt i vevskulturmedia av androgen-reseptor-positive prostatacancercellelinjer [29, 30]. SPON2 serumprøver ble også vist å være forhøyet hos pasienter med hetten i forhold til friske kontroller [31].
Dette magnetiske kuler-basert system korrelerer konsentrasjonen av biomarkør for endringer i akustisk frekvens av en piezoelektrisk membran [32]. Den lineære dynamiske området av analysen var innstilt for å passe den aktuelle konsentrasjonen av disse biomarkører i fortynnet serum [33]. Vi først identifiserte matchet antistoff par og deretter preget analysene for reproduserbarhet, analytisk følsomhet, og matrise forstyrrelser. Vi endelig undersøkt klinisk sensitivitet og spesifisitet av panelet med en retrospektiv studie av 240 banked humane serumprøver. Så langt vi kjenner til, er dette det første eksempelet på disse proteinene integrert i en enkelt panel og den mest detaljerte bruken av denne perlen basert piezoelektrisk analysesystem med viktige implikasjoner i Cap screening, overvåking og behandling.
Materialer og metoder
Antistoffer
med mindre annet er angitt, ble immunoreagenser funksjon i vår lab og validert med enten rekombinant eller pasient renset protein standarder. Optimale matchet par inkludert fangst antistoff (c.Ab) og detektere antistoff (d.Ab) ble hentet fra følgende leverandører:
TPSA: The c.Ab (Meridian p /n M66280M) den d.Ab (Meridian p /n M66276M) var begge monoklonalt IgG
fPSA. den c.Ab (Meridian p /n M86806M) den d.Ab (Meridian p /n M66276M) var begge monoklonalt IgG. For både TPSA og fPSA vi brukte naturlig humant PSA forberedt i vårt laboratorium som standard [34]
PAP. Den c.Ab (CosmoBio p /n SIM-2ZHCMP2-EX, klone Hyb-7432, beskrevet nedenfor som COS2) var en mus monoklonalt, og d.Ab (CosmoBio p /n SIM-2ZHCMP1-EX, som er beskrevet nedenfor som Cos1) var en mus monoklonalt. En rekombinant protein standard (Fitzgerald p /n 30C-CP1016x) validert analysen. Andre antistoffer evaluert inkluderer et monoklonalt IgG1 klone 690017 fra R p /n 33-5500 (On1-1)) var en mus monoklonalt, og d.Ab (R p /n AF941) var et mål polyklonale. En rekombinant protein standard (R D Systems p /n 941-SP-050) validert analyse
CA1. Den c.Ab (Abnova; p /n H00000759-M21) var en kanin affinitetsrenset polyklonale, og d.Ab (Abnova; p /n H00000759-D01P) var mus monoklonalt anti-CA1, IgG2b Kappa. En rekombinant protein standard (Abnova p /n H00000759-P01) validert analyse
IL6-sr. Den c.Ab (R D Systems p /n AF227) var en geitepolyklonalt, og d. Ab (R se S1 Video). Dette systemet består av en benk topp analysator og engangs reagensforpakningen stand til å analysere 288 eksemplarer og standarder for hver kjøring. Analysatoren har innebygd væskehåndtering, avfallshåndtering, og datahåndtering [33, 35]. Signal er rapportert i relative enheter via innebygd programvare og er proporsjonal med antallet av perler immobilisert på membranen og dermed analyttkonsentrasjon. Maskinvare kontroll og dataanalyse ble utført med Bioscale kommersiell programvare (Vibe versjon 0.7.3).
Dette systemet består av en engangs 8-kanals patron som er koblet til fluidhåndterings robotikk og en elektrisk styrt magnet. Prøver og standarder ble forberedt på 1: 10-1: 1000 fortynning faktor og belagt i 96 brønners plater sammen med perler og fluorescerende antistoff. Prøvene ble fremstilt ved å blande 80 ul av prøve eller standard med 20 ul av kuler belagt med c.Ab (900000 kuler /ml) og 20 ul av fluorescein-merkede d.Ab (1200 ng /ml). Disse reagensene danner et immunokompleks sandwich i nærvær av biomarkør antigen (figur 1A).
A. Den c.Ab. er kovalent bundet til en på magnetiske kuler som inkuberes med prøven og fluorescein-merket d.Ab. Denne prøven innføres i en strømningscelle avkortet med en piezoelektrisk membran belagt med et anti-fluorescein-antistoffet. En elektromagnet over membranen styres med innebygd programvare. B. Ved magnetisk forstyrrelse, alle perler (svarte sirkler) bevege seg mot membranen (Bi), og perler med en fullført immun (svarte sirkler belagt med røde prikker) binder seg til anti-fluorescein-antistoff (Bii). Etter at banen er fjernet og strøm gjenopprettet, forblir bare perler med et utfylt immunokompleks bundet (BIII). Disse perlene endre oscillasjon av membranen (angitt som orange sinusformet kurve), som blir tolket som signal i vilkårlige enheter [36]. Se S1 Video. I B, viser den faste blå linjen som er merket Pos til perler i nærvær av antigen, og den stiplede linjen som er merket rød Neg refererer til perler i fravær av antigen.
Opp til 100 ul av denne blanding var nødvendig for magnetisk sortering og analyse. Denne blanding ble inkubert med risting i 4 timer. Løsningen i hver kolonne av platen (8 brønner) ble deretter auto-pipettert inn i de enkelte strømningskanaler innenfor åtte-kanals patron. Etter at oppløsningen ble lastet inn i kammeret, ble et magnetisk felt påføres og alle kulene ble trukket inn i anti-fluorescein-IgG-belagte piezo membran i front av det magnetiske felt. Strømning og fortynningsfaktorer ble justert slik at antallet immobiliserte perlene var mellom 2000-3000.
Ettersom disse perlene kommer i kontakt med dette piezo membran, oscillasjonsfrekvensen forandret og opp (figur 1B). Det magnetiske felt ble opprettholdt for å tillate interaksjonen mellom perlene med fullstendige immunokomplekser og membran-fluorescein-koden på d.Ab lettes binding av immunkompleks til et anti-fluorescein IgG på den piezoelektriske membranen. Feltet ble deretter avbrutt, og strømningen gjenopptatt for å fjerne ikke-spesifikt bundne kuler. Endringen i piezo frekvens ble deretter registrert som et mål på antallet bundne kuler og således antigenkonsentrasjon som fullfører immunokompleks (figur 1B).
Prøvene
doserte serumprøver hadde blitt samlet inn over 20 år med informert samtykke ved Urologi avdeling ved Stanford University. Vi brukte serum fordi den har blodlevringsfaktorer fjernet, som kan produsere ikke-spesifikt signal og bakgrunn i plasmaproteinanalyser. Diagnosen ble bekreftet med 10- eller 12-kjerners biopsier på tidspunktet for prøvetaking. Den interne Review Board of Stanford University godkjent denne studien og utformingen av informert samtykke. Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke på tidspunktet for prøvetaking, og deltaker samtykkeerklæring ble kuratert sammen med prøvene ved Stanford Department of Urology. Disse prøvene ble tint, de-identifisert, fortynnet i PBS, og alikvotert for testing. Vi studerte 240 prøvene som ble valgt tilfeldig fra en bank av ~ 2200 eksemplarer kuratert ved Stanford Radiologi. Gjennomsnittsalderen på de BPH kontrollene var 65,9 ± 9,2 (30-87), og gjennomsnittsalderen for CAP pasientene var 62,6 ± 6,4 (46-77); Det var en statistisk signifikant forskjell alder mellom de to gruppene (p = 0,002). Vi har tatt med denne informasjonen i teksten. Det var 120 BPH prøver og 100 tilfeller av bekreftet prostatakreft valgt; alle prøvene hadde PSA-verdier mellom 2-20 ng /ml. Av CAP prøvene, 32 var Gleason scorer 6 og 68 var Gleason scorer 7. Som en kontroll, var det også 20 prøver fra menn med hetten samlet inn etter radikal prostatektomi. Fortynningsfaktorer var optimalisert empirisk for å gi en pigg gjenvinning av 100% ± 10%. Sammenslått normal kvinnelig serum ble kjøpt fra Atlanta Biologicals.
Data Tolkning og statistikker
Signal enheter av de ukjente ble omgjort til konsentrasjonsenheter ved hjelp av en standard sigmoidkurven med Bioscale programvare (Vibe versjon 0.7.3 ). Registreringsområdet ble definert som de kalibreringspunkter som kan bli diskriminert fra deres neste nærmeste kalibreringspunkter. Referanseområder ble tatt fra kliniske retningslinjer eller litteraturen, avhengig av status for biomarkører. Vi gjorde en 2-tailed Student t-test for å sammenligne resultatene av BPH og Cap prøver i Excel 2010. AUC og ROC kurver og tilhørende statistikken ble utarbeidet med GraphPad Prism 6.04.
Resultater
identifisering av matchet par
Vi først måtte identifisere en optimal antistoff par, og følgende avsnitt beskriver denne tilnærmingen bruker PAP som eksempel-resultater for andre analyser er presentert i tabell 1. figur 2 viser representative data om hvordan dette ble oppnådd for PAP biomarkør med en såkalt «sjakkbrett-assay». Her ble fire forskjellige PAP-antistoffer, så vel som en isotypekontroll anvendt som både c.Ab og d.Ab. Alle fire antistoffer og en isotype-kontroll ble anvendt ved antigen-konsentrasjoner på 0 og 1 ng /ml. Fig 2A plotter signal forskjellen mellom disse to konsentrasjoner. For PAP høyeste signalet var med Cos1 d.Ab og COS2 c.Ab med et signal på 0,65 a.u. (Fig 2A). Snu rekkefølgen, dvs. COS2 d.Ab og Cos1 c.Ab hadde en verdi på 0,43 a.u. Paret fra R 0,01 a.u. Således ble Cos1 og COS2 anvendt for resten av forsøkene.
A) Optimal antistoff parene ble identifisert med en «checkerboard» analyse som evaluert forskjellige antistoff parene samt isotype kontroll. Metrisk plottet her er signalforskjell mellom den negative kontrollen og 1 ng /mL rekombinant PAP. De ulike antistoffene er definert i Materialer og metoder. B) En full kalibreringskurve viser de forskjellige følsomheter av forskjellige antistoff par for PAP. Par 1: COS2 c.Ab .; Cos1 d.Ab. Par 2: RDPo c.Ab .; RDMo. d.Ab. De røde Feilstolpene representerer standardavviket av minst tre gjentatte målinger. C) reproduserbarhet fra dag til dag er 8%. D) Den piezo-basert tilnærming viser 3 logg bestillinger forbedring i analytisk sensitivitet versus direkte ELISA når identiske antistoff parene er brukt (Cos1 /COS2).
Den best matchet par med resulterende dynamisk område, referanse rekkevidde, og utvannings faktorer er vist for de 7 biomarkør analyser samt representative intra-analysevariantverdier.
Selvfølgelig, endre antistoff paret endrer følsomheten av kurven. Figur 2B illustrerer at ved å endre c.Ab til RDPo og d.Ab til RDMo, den følsomhetsområde endret 0,01 til 1,0 ng /ml til 1 til 100 ng /ml. Til slutt sammenlignet vi responskurvene for PAP via kulebasert system med ELISA ved å bruke den samme Cos1 /COS2 par (Fig 2D). Vi viser et 3-log for forbedring i analytiske følsomheten med perle basert tilnærming som fremhever den forbedrede analytiske følsomhet på grunn av grådighet av perlen versus planar ELISA underlaget.
Hvor mye c.Ab og d. Ab per analysen ble også undersøkt (S1 fig). Produsenten anbefaler en perle arbeider konsentrasjon på 150.000 perler /ml og 200 ng /ml d.Ab. Vi testet d.Ab verdier på 100 og 400 ng /ml samt 10,000-300,000 perler /ml, men fant ikke noen forbedring i doseavhengig kurve 10,0 til 0,015 ng /ml. Ved 1 ng /ml av rekombinant standard PAP, ble den høyeste signal oppnådd med 10.000 perler /ml og 100 ng /ml av d.Ab. Men disse betingelsene resulterte også i høyere bakgrunnssignal ved lavere konsentrasjoner (S1 Fig). Således 150000 kuler /ml og 200 ng /mL d.Ab ble anvendt for alle etterfølgende analyser.
Assay Karakterisering
neste undersøkt både intra-assay (mellom brønnene kjøres på den samme dagen på samme tid) og inter-assay varians (differansen mellom den gjennomsnittlige av kjører på forskjellige dager, fig 2C). For PAP, intra-assay varians varierte fra 0,05% relativt standard avvik [37] på 6 ng /ml til 5,47% ved 0,02 ng /ml. Den inter-assay variasjon på tre forskjellige dager var 7,1% RSD. Alle andre forsøk hadde 7% varians for intra-assay varians og mindre enn 10% for inter-assay varians. Ved å gjøre dag-til-dag sammenligninger var det av avgjørende betydning at kalibreringskurvene være anordnet i 96-brønners plater på samme måte på hver påfølgende dag. Fordi hver rad i 96-brønners plate tar ~ 5 minutter for å analysere, endre plasseringen av kulene gjør det mulig for lengre inkubasjonstider, noe som kan resultere i høyere vulst /immunokompleks opphopning og dermed høyere signal.
Med en optimalisert matchet antistoff par i hånden, vi neste avdekket og korrigert eventuelle matrise forstyrrelser igjen illustrerer med PAP. Vi brukte sammenslått normal kvinnelig serum som skal inneholde noe PAP. Serum ved fortynningsfaktorer fra 1: 2 til 1: 256 ble fremstilt og analysert. En annen gruppe med fortynnede prøver ble tilsatt 0,5 ng /ml PAP. Prøvene ble analysert og prosent gjenvinning plottet i figur 3A, samt pigg gjenoppretting av data for SPARC- spiking ved 125 ng /ml og CA1 spiking ved 10 ng /ml. Resultatene viste at 100% gjenvinning ble oppnådd med 16-gangers fortynning faktorer for disse analyttene. Redusert og økt pigg gjenvinnings-verdier er på grunn av ikke-spesifikk binding av andre serumproteiner til antistoffene. De øvrige fem biomarkører ble optimalisert på samme måte.
A) prosent recovery for tre representative biomarkører. Matrix effekter kan enten dempe signalet (CA1, PAP) eller blåse signal (SPARC). Ideelle fortynningsfaktorer var avhengig av analysens følsomhet og referanseområdet av den biomarkør (tabell 1). Svart stiplet linje angir 100% pigg utvinning. B) Bland-Altman plott [38] validere prøven integritet av en undergruppe (N = 35) av de kliniske prøver med høye prøvevolumer. Rød stiplet linje angir 95% konfidensintervall.
kliniske prøver
Første skritt var å validere prøve stabilitet. For å gjøre dette, reanalysert vi PSA-verdier av en undergruppe (N = 35) av prøvene som hadde store mengder serum ved hjelp av en Beckman Tilgang klinisk analysator (Hybritech) ved Stanford University Medical Center og sammenlignet dette til opprinnelig målt til verdier tidspunktet for samlingen. Vi skapte en Bland-Altman plott og viste at 92% av prøvene var innenfor 95% konfidensintervall (Fig 3B). Denne valideringen brukes bare de prøver som hadde tilstrekkelig volum for både klinisk system og perle-baserte analysen. Resultatene indikerte at Ptil integritet ble opprettholdt under lagring.
Deretter målte vi biomarkør nivåer av alle analytter i serum fortynnet til konsentrasjoner som er vist i tabell 1. Dataene for BPH, cap, og etter operasjonen Cap prøvene er vist i figur 4. den gjennomsnittlige verdien fra Cap pasientprøver er 1,5-, 1,6-, 0.83-, 0.94-, 0,79 og 1,03 ganger høyere enn BPH for CA1, Ptil, IL6-sr, PAP, og SPARC analyser, henholdsvis. Forsøk med en betydelig forskjell mellom BPH og Cap var PSA (p 0,0001), CA1 (p = 0,03), SPARC (p = 0,049), og SPON2. (P 0,10
-6)
rå verdier med midler for BPH, lue, og etter operasjonen (PS) prøver. Biomarkører omfatter TPSA (A), fPSA (B), CA1 (C), PAP (D), IL6-sr (E), SPARC- (F), og SPON2 (G). Horisontale linjer indikerer middelverdier.
Vi skapte ROC kurver og målte AUC for alle biomarkører ved hjelp av biopsi-bekreftet diagnose og målte verdier (figur 5). PAP AUC var 0,51; 95% konfidensintervall 0,43 til 0,58 med p 0,50. SPARC AUC var 0,51; 95% konfidensintervall 0,43 til 0,59 med p 0,50. CA1 AUC var 0,55; 95% konfidensintervall 0,47 til 0,63 med p = 0,17. IL-6SR AUC var 0,57; 95% konfidensintervall 0,50 til 0,65 med p = 0,06. Den SPON2 AUC var 0,76; 95% konfidensintervall 0,69 til 0,82 med p. 0,0001
A) Gjennomsnittsverdier med standardavvik for de syv biomarkører med BPH, lue, og etter operasjonen [39] prøver. Enheter er ng /ml. Den p-verdi rapporteres her er betydningen mellom BPH og Cap prøver. AUC-verdier er også gitt og rapportere diskriminering mellom lokket og BPH. Nedre panel viser ROC-kurver for PSA, SPON2, og Ptil OR SPON2. OR-operatoren øker AUC til 0,84 fra 0,80 for PSA alene.
AUC-verdien for PSA er typisk for litteraturverdier [40-42]. I en meta-analyse ved hjelp av fritt og totalt PSA, samlet for 41 studier med 19,643 deltakere var en AUC på 0,70 [41]. Dessverre gjorde andre biomarkører ikke bedre AUC med unntak av SPON2. At markeringen hadde en AUC-verdi på 0,76 i forhold til PSA AUC på 0,80. Når de to ble brukt i en ELLER-operasjon, økte AUC litt 0.84. Ingen andre operasjoner eller andre kombinasjoner av biomarkører økte AUC kurven.
Vi studerte også om eventuelle biomarkører kan diskriminere mellom Gleason 6 og Gleason 7 pasienter (S1 Table). Ingen av de nye proteinene viste en p-verdi 0,05. Selv om dette datasettet gjorde viser en meget signifikant forskjell for TPSA ( 0,01), er dette sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av noe uteliggerverdier-p-verdien var 0,06 når vi brukte de opprinnelige kliniske PSA-verdiene. Vi gjorde også ROC analyse for ulike Gleason score versus BPH og bemerket betydning med IL-6SR. I sammenligne Gleason 7 pasienter versus BPH med IL-6SR, fant vi en AUC-verdien på 0,66; 95% konfidensintervall var 0,57 til 0,76 med p = 0,005. Segregerende av Gleason score ble ikke bedre AUC-verdiene for andre biomarkører.
Diskusjoner
Det er mange måter å måle nye CAP biomarkører utover tradisjonelle ELISA. En av de fundamentale flaskehalsene i de fleste analyse utvikling ordninger er identifikasjonen av en passende avstemt antistoff par. Dette er kanskje den viktigste fordelen av vulsten tilnærming benyttes i den aktuelle arbeids identifisering av et samsvarende antistoff par vanligvis tar mindre enn 2 dager fra syntesen av reagenser til det endelige valg av den optimale paret. Dette systemet har god inter- og intra-assay reproduserbarhet (CV 10%) og kan raskt redusere matrise forstyrrelser. Andre fordeler er lavere deteksjonsgrenser på grunn av grådighet i perle design så vel som lav terskel for brukeropplæring. Begrensninger av systemet omfatte de forholdsvis høye krav på grunn av begrenset multipleksing prøvevolum. For å løse dette, er vi utvikle flere analytiske verktøy i våre laboratorier som magneto-nanosensor for multiplex analyser med store dynamiske områder og lavt prøvevolum (40 mikroliter) krav kritiske for dyreprøver [4].
Det er viktig at biomarkør verifisering få lov til å svikte raskt før betydelige investeringer i testutvikling eller bruk av dyrebare kliniske prøver. Dette perle basert ordning tillater rask verifisering av biomarkør potensial. Våre data viser at mange av protein biomarkører rapportert tidligere for å diskriminere mellom lokket og BPH pasienter mislyktes med våre spesifikke pasientprøver. Kanskje mest overraskende var CA1. I tidligere arbeid ved hjelp av 54 Cap prøver og 60 friske kontroller [23], dette proteinet hadde en AUC-verdien på 0,64 og en AUC-verdien på 0,76 når den kombineres med PSA. En viktig forskjell er at studien begrenset sine prøver til pasienter i den såkalte «gråsonen» av PSA-testing-PSA-verdier mellom 4 og 10 ng /ml. IL-6SR har også vist seg å korrelere med progresjon [27] og beinmetastase [26] og det var sannsynlig at differensial ekspresjon ville ha blitt målt i BPH versus Cap pasientprøvene, men vi bemerket noen signifikant forskjell mellom disse to pasientpopulasjoner.
Vårt arbeid med SPON2 viser at det har noen nytte i Cap testing. En merkelig trekk fra denne studien er at nivåene i BPH pasienter (126,5 ng /ml) var faktisk høyere enn Cap pasienter (73,0 ng /ml). Denne forskjellen var meget signifikant på p = 10
-6. I en tidligere artikkel [31], SPON2 nivåer i Cap pasienter (77,5 ng /ml) var høyere enn hos pasienter med «ingen tegn på malignitet» (23,6 ng /ml). Mens forskjellene i absolutte verdier er trolig skyldes forskjeller i standard og antistoff valg, er trenden litt forvirrende. En mulig forklaring er i pasientutvalgsforskjeller. Disse friske kontrollene er en helt annen pasient kohort enn BPH gruppen brukes til sammenligning i vår studie. Det er faktisk mulig at SPON2 nivåene øker under BPH ovenfor verdier sett i enten normalt eller cap fag. Fremtidig arbeid vil ha for å studere SPON2 nivåer i flere pasient og kontrollgrupper med høyt antall pasienter for å bedre forstå disse avvikene.
En annen studie antydet at SPON2 gjelder kun for pasienter med PSA-verdier under 10 ng /ml [30]. Begrense våre prøver å disse pasientene ga en bety BPH verdi på 119,9 ± 65,9, en middel cap verdi på 82,6 ± 50,36 (p = 0,004) og AUC på 0,72. Dermed begrenser våre data til disse pasientene ble ikke bedre AUC.
Analyse av post-kirurgi pasienter viste at de mest dramatiske endringene i biomarkør-nivåer forekom hos PSA-baserte tester. Den TPSA i post-prostatektomi pasienter redusert 18 ganger mot BPH og 30 ganger for hetten pasientene. PAP nivåer i post-prostatektomi pasienter var 2 til 3 ganger lavere. Andre biomarkører viste ingen signifikant (P 0,05) endring
Konklusjon
Vi rapporterer et piezoelektrisk perle basert sensor for å måle serumproteiner med potensial til å diskriminere mellom BPH og Cap.. Denne studien bekreftet bruk av PSA til å diskriminere mellom BPH og lue, men AUC-verdiene var sub-optimale for befolkningen omfattende screening. Vi viste også at bruk SPON2 i tandem med PSA via en ELLER-operasjon kan øke AUC 0,80 til 0,84. Denne tilnærmingen har verktøy for en rekke av sirkulerende biomarkører og det videre arbeidet vil vurdere mer lovende biomarkører samt urinbaserte biomarkører som TMPRSS2. ERG fusjon
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Optimalisering av Bead og d.Ab konsentrasjon.
Variasjoner i d.Ab konsentrasjon to ganger over og under den anbefalte 200 ng /mL verdi ble anvendt i tillegg til økende konsentrasjoner av kuler (innfelt). Kalibreringskurver på hvert av disse punktene illustrerer at responsen er stabil ± 15% til tross for disse variasjonene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0139484.s001 product: (PDF)
S1 Table. . Biomarkør Konsentrasjoner som en funksjon av Gleason Score
PSA viste de mest signifikante forskjeller mellom pasienter med Gleason score til 6 og 7.
doi: 10,1371 /journal.pone.0139484.s002 product: (PDF)
S1 Video.
