Abstract
Bakgrunn
En guanin-rik strand innenfor arrangøren av
KRAS
genet kan kaste inn en intra-molekylær G-quadruplex struktur (G4), som har en viktig rolle i reguleringen av
KRAS
transkripsjon. Vi har tidligere identifisert indol [3,2
b
] liner med en 7-karboksylatgruppe og tre alkylaminbaserte sidekjeder (IQ3A) som effektive G4 stabilisatorer og lovende selektive kreft fører. Heri vi undersøkt kreft virkningsmekanismen til disse forbindelsene, som vi hypoteser skyldes stabilisering av G4 sekvens i
KRAS
promoter og påfølgende nedregulering av genekspresjon.
Metodikk /Principal funn
IQ3A forbindelser viste større stabilisering av G4 forhold for dobbeltsidig DNA strukturer og redusert
KRAS
promoter aktivitet i en dual luciferase reporter analysen. Videre IQ3A forbindelser viste høy anti-proliferativ aktivitet i HCT116 og SW620 tykktarmskreftceller (IC
50 2,69 mm), uten å fremkalle celledød i ikke-ondartet HEK293T humane embryonale nyre, og menneskelige kolon fibroblaster CCD18co. IQ3A forbindelser betydelig redusert
KRAS
mRNA og protein steady-state nivåer på IC
50 konsentrasjoner, og økt p53 protein steady-state nivåer og celledød ved apoptose i HCT116-celler (Mut
KRAS
, vekt
p53
). Videre KRAS tie i HCT116 p53 villtype (p53 (+ /+)) og null (p53 (- /-)) isogene cellelinjer induserte en høyere grad av celledød, og en høyere IQ3A-indusert celledød i HCT116 p53 (+ /+) sammenlignet med HCT116 p53 (- /-).
Konklusjoner
Heri vi dokumentere at G4 ligander som IQ3A forbindelser kan målrette G4 motiver presentere i
KRAS
promoter, ned-regulere uttrykk for mutant
KRAS
gen gjennom hemming av transkripsjon og oversettelse, og indusere celledød ved apoptose i tykktarmskreft cellelinjer. Dermed rettet mot KRAS på genomisk nivå med G4-ligander kan være en ny kreftbehandling strategi for tykktarmskreft
Citation. Brito H, Martins AC, Lavrado J, Mendes E, Francisco AP, Santos SA, et al . (2015) Targeting
KRAS
Oncogene i tykktarm kreft celler med 7-karboksylat indol [3,2
b
] kinolin Tri-alkylamin Derivater. PLoS ONE 10 (5): e0126891. doi: 10,1371 /journal.pone.0126891
Academic Redaktør: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 06.01.2015; Godkjent: 08.04.2015; Publisert: 29. mai 2015
Copyright: © 2015 Brito et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forfattere fra iMed-ULisboa erkjenner Fundação para en Ciencia e Tecnologia (FCT), Portugal, for økonomisk støtte gjennom prosjekttilskudd EXPL /QEQ-MED /0502 /2012, HMSP-IKT /0018/2011, og Pest-OE /SAU /UI4013 /2014. HB, CMPR og PMB takker også Sociedade Portuguesa de Gastroenterologia og Korea menneskelige genbank (KHGB), Medisinsk Genomics Research Center, KRIBB, Republikken Korea. JL erkjenner FCT for postdoktor gi SFRH /BPD /72903/2010 og SAS for PhD stipend SFRH /BD /80162/2011. Den Neidle laboratorium erkjenner støtte fra bukspyttkjertelen Cancer Research Fund og Medical Research Council. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
KRAS
-genet koder for en G-protein som tjener som en molekylær bryter mellom endotelial vekstfaktor reseptor og kjernen, og styring av flere signalveier som er viktige for cellevekst og overlevelse. KRAS GTPase eksisterer i to stater, en GTP-bundet aktiv tilstand og en BNP-bundet inaktivt. Videre,
KRAS
mutasjoner øke KRAS affinitet for GTP fører til konstitutiv aktivering av proteinet. Viktigere, sletting av mutant
KRAS
allel i tykktarm kreft cellelinjer reduserer dramatisk celleproliferasjon [1], fremhever det faktum at mange svulster huse mutant
KRAS
er KRAS-avhengige.
KRAS
mutasjoner er mest utbredt i bukspyttkjertelen (90-60%), tykktarms (30-50%) og lunge (20-30%) karsinomer [2]. På grunn av den høye forekomsten av disse kreftformene i verden [3] og økt motstand mot konvensjonell kjemoterapi [4], søken etter nye mål har blitt intensivert i siste siste årene.
Betydningen av terapeutisk modulering av KRAS signale har blitt anerkjent og flere tilnærminger har blitt rapportert i det siste, men ingen har gitt en godkjent ny kreft narkotika hittil [5]. En innovativ terapeutisk tilnærming som studeres er bruken av mirnas, fordi de spiller en viktig rolle i chemo-sensibilisering [6]. Vi har tidligere vist at miRNA-143, noe som også reduserer
KRAS
uttrykk, chemosensitizes tykktarmskreftceller til 5-fluorouracil [7], og reduserer tumorvekst
in vivo
, med økt apoptose og redusert spredning [8].
Fortsetter våre studier som tar sikte på å oppdage nye og selektiv kreft narkotika, forfulgt gjennom utvikling av flere kjemiske systemer som skal brukes i ulike terapeutiske strategier [9], [10], [11 ] rapporterer vi her på en tilnærming til målretting KRAS signalering i kreftceller ved direkte moduler
KRAS
uttrykk på gennivå. Det er nylig blitt demonstrert at et guanin-rik tråd innenfor promotoren av
KRAS
kan foldes sammen til en intra-molekylær G-quadruplex struktur (G4), som har en viktig rolle i reguleringen av
KRAS
transkripsjon [12], [13]. G4 ordninger er nukleinsyre høyere orden strukturer, dannet av sekvenser som inneholder repeterende guanin (G) -RICH traktater [14]. Flere studier har gitt bevis som støtter eksistensen av G4 i eukaryote telomerer og onkogene arrangører, inkludert de av
KRAS
,
HRAS
,
HSP90
,
c-MYC
,
c-KIT
,
BCL-2 Hotell og
VEGF
gener, og at små molekyler stabiliserende G4 strukturer er i stand til å ned-regulere onkogen transkripsjon i tumor cellelinjer, inhiberer telomerase-aktivitet og induserer kreft cellevekstarrest [15], [16], [17]. G4 strukturer har også blitt funnet i RNA-sekvenser, blant annet i den 5 «ikke-translatert region (UTR) av
KRAS
mRNA, og vist å ha regulatoriske funksjoner oversettings [18], [19], [20].
Indoloquinolines er naturlige alkaloider i stand til å målrette DNA strukturer, hvorav noen har potensial for utvikling i kreft narkotika [21], [22]. Indolo [3,2-
b
] kinolin-derivater har vist seg å være kraftige ligander G4, og for å inhibere celleformering og onkogen (
c-MYC
) transkripsjon [21], [23 ], [24]. Videre har vi nylig oppdaget at indol [3,2
b
] liner med en 7-karboksylatgruppe og tre alkylaminbaserte sidekjeder (1a og 2a i figur 1) er lovende selektive kreft fører [25]. Disse forbindelsene selektivt hemmet (100 ganger) vekst av
KRAS
mutante HCT116 tykktarm kreft celler i forhold til primære rotte hepatocytter, og samtidig redusere KRAS protein nivåer. For å utnytte dette stillaset mot oppdagelsen av nye og forbedrede kreft narkotika, har vi utvidet den kjemiske mangfold av disse indoloquinolines og studert deres potensielle anticancer virkningsmekanisme. Tidligere struktur-aktivitetsstudier med mono-alkylamin indolo [3,2
b
] liner har vist at optimal G4 stabilisering ble indusert av forbindelser med propyl sidekjeder og grunnleggende amingrupper (p
Ka
≥ 8) [25]. Således kan forbindelser 1a-d og 2a-d (figur 1) ble designet, syntetisert og evaluert for selektiv G4 termisk stabilisering sammenlignet med duplex-DNA, sammen med inhibering av kreftcellevekst, induksjon av apoptose og nedregulering av
KRAS Hotell og
HSP90
transkripsjon og protein uttrykk. For å forbedre den anticancer aktivitet profil og
KRAS
onkogen nedregule kapasitet på våre mål indoloquinolines, vi har brukt fire cellelinjer med ulik
KRAS Hotell og
TP53
genotyper , samt to positive kontroller, anticancer medikament 5-fluorouracil (5-FU) og G4 ligand TMPyP4 (figur 1).
7-karboksylat-indolo [3,2-
b
] kinolin tri-alkylamin-derivater (IQ3A) 1a-d og 2a-d; G4 ligand porfyrin derivat TMPyP4 og 5-fluorouracil (5-FU) kreft narkotika.
Diskusjon
Forbindelser 1a-d og 2a-d ble syntetisert i fire trinn etter den
Resultater og fremgangsmåten som tidligere er beskrevet [25] med noen modifikasjoner (S1 tekst). Strukturer av 1a-d og 2a-d ble fullstendig belyst av todimensjonale
1 H (COSY og NOESY) og
13C heterocorrelation NMR eksperimenter (HMQC og HMBC) og renhet ( 95%) bekreftet ved HPLC-ELSD- MS (S1 figur).
kapasiteten forbindelser 1a-d, 2a-d og standard G4 ligand TMPyP4 (fig 1) [16] for å binde og stabil
KRAS product: [26] og
HSP90A product: [27] G4 DNA-strukturer samt duplex DNA (T-loop) ble evaluert av en fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) smelte analysen. Økningen i smeltetemperaturer indusert av forskjellige konsentrasjoner av forbindelser som er presentert i tabell 1 og S2 fig. Våre resultater viser at tri-alkylamin indolo [3,2
b
] kinoliner (IQ3A) er potente og selektive ligander for
KRAS Hotell og
HSP90A
G4 strukturer. Som tidligere observert for mono- og di-alkylamin analoger [25] og andre polyaromatiske-kondensert G4 ligander [28], [29], forbindelser med propylamin sidekjeder (1d og 2d) er overlegne G4-stabilisatorer (Δ
T
m mellom 18 og 23 ° C ved 2 uM av ligand) enn forbindelsene med kortere alkylamin sidekjeder (1a-b og 2a-b; Δ
T
m verdier mellom 7 og 17 ° C ved 2 uM ligandkonsentrasjon). Det ble observert at basisiteten av sidekjeder korrelerer positivt med termisk G4 stabilisering av alle DNA-sekvenser opp til en optimal pKa 8,0 til 9,0 (figur 2). Heterosykliske aminer ved slutten av alkyl-sidekjede (1b og 2b) synes å forbedre bindingen til G4 og komplekse stabilisering i forhold til di-etylamin gruppe (1a og 2a), som ikke kan forklares ved forskjeller i basisitet mellom terminale grupper. I tillegg, og i samsvar med det som tidligere er observert for di-alkylamin indoloquinolines [25], tyder dette studie som N5, N10, COO tri-substitusjon med heterocykliske amingrupper ved alkylsidekjede termini økning ligandaffinitet til G4, som 2b, d -G4 DNA kompleksene har høyere smeltetemperatur enn komplekser av korrespondent isomerene 1b, d. Dette ble imidlertid ikke observert for den isomere par 1 a /2a. Til tross for den økte G4 stabilisering kapasitet, ligander 2b og 2d var ikke i stand til å betydelig skille mellom de to DNA G4 strukturer (tabell 1).
A. Beregnet p
K, En verdier av sidekjedeamingrupper av SPARC (v. 4.6). B. Tomter variasjon av G4 termisk stabilisering av forbindelser (Δ
T
m) med basisitet (p
K
a) av sidekjeder grupper.
for å studere effekten av IQ3A forbindelser på kreft og ikke-kreftceller, valgte vi sammensatte 2d viser det beste G4 stabilisering kapasitet
in vitro Hotell og paret 1a og 2a, som til tross viser lavere Δ
T
m verdier for de respektive komplekser med G4 DNA, er i stand til å redusere
KRAS
uttrykk når inkuberes i HCT116 kolorektal kreftceller, som vi tidligere har vist [25].
Den kortsiktige effekten av forbindelser på 72 timer på cellevekst ble undersøkt ved hjelp av tykktarmskreft cellelinjer med ulik
KRAS Hotell og
TP53
genotyper: human kolorektal kreft HCT116 (mut
Kras
, villtype (wt)
p53
), og menneskelige metastatisk kolorektal adenokarsinom SW620 (mut
Kras
, mut
p53
). Parallelt vi brukte også foreviget humane embryonale nyrecellelinje HEK293T (vekt
Kras
, vekt
p53
) og normale menneskelige kolon fibroblast celler CCD18co (vekt
Kras
, vekt
p53
). IC
50 og IC
65 verdiene i tabell 2 viser at forbindelser 2a og 2d skjerm overlegen anti-proliferativ aktivitet sammenlignet med 1a og 5-FU, spesielt i metastatiske SW620 celler, hvor 2d ga en IC
50 verdi (0,28 uM), nesten 20 ganger lavere enn den for standard anticancer medikament 5-FU (IC
50 = 5,39 uM). Interessant, tykktarmskreftceller HCT116 og SW620, som uttrykker mutante KRAS, var spesielt ufølsom for porfyrin-derivatet TMPyP4, i motsetning til ikke-maligne HEK293T celler som uttrykker villtype KRAS. I tillegg IQ3A forbindelsene og 5-FU, var ikke selektiv for kreftceller som uttrykker mutante KRAS, ettersom de var like aktive mot HCT116, SW620 og HEK293T celler. Likevel, vi har observert noe selektivitet (SI 2,4; Tabell 2). Mot tykktarmskreft cellelinje HCT116 forhold til vanlig kolon fibroblaster (CCD18co)
Deretter ble Guava ViaCount analysen brukes til å evaluere virkningene av IQ3A forbindelsene på celledød induksjon i kreft (HCT116 og SW620) og ikke-maligne (HEK293T og CCD18co) celler, sammenlignet med 5-FU og TMPyP4 ved equitoxic konsentrasjoner (IC
50 og IC
65) . Nedregulering av mutant
KRAS
ekspresjon av antisens oligonukleotider i kolorektal kreftceller [7], [8], [30] og ved en MAZ-bindende oligonukleotid attrappen i kreft i bukspyttkjertelen celler [31] er forbundet med økt apoptose og cellevekst arrest. Også, antikreftmidler, slik som 5-FU og G4 stabilisatorer av telomeric og onkogen promotersekvenser som TMPyP4, er kjent for å indusere en generalisert-cellerespons som fører til cellevekstarrest og celledød ved apoptose (DNA-skade respons) [15], [32], som innebærer aktivering av pro-apoptotiske transkripsjonsfaktor p53 blant andre veier i tilfelle av 5-FU [34]. Figur 3 viser at våre testforbindelsene har forskjellige effekter på celler, avhengig av sammensatte struktur og sannsynligvis også på den genetiske bakgrunn av en enkelt cellelinje. I HCT116-celler, alle forbindelser indusert celledød ved apoptose, men IQ3A forbindelsene viste den mest signifikante apoptotiske effekt, med en trend av 1a 2a 2d, og forårsaker 30-70% celledød ved konsentrasjoner i området 0,58 til 3,42 mikrometer (IC
65) (figur 3B, øvre venstre panel). Omvendt, alle forbindelser var ikke i stand til å indusere betydelig celledød i HEK293T og CCD18co celler (figur 3A og 3B, nedre paneler), mens det i SW620-celler bare 5-FU var i stand til å indusere apoptose i en doseavhengig måte (figur 3A og 3B , øvre høyre panel). Effekten av TMPyP4 på SW620 ble ikke undersøkt, da denne cellelinjen var ikke følsom for denne forbindelsen opp til et 20 uM konsentrasjon.
cellepopulasjoner ble oppnådd ved Guava ViaCount strømningscytometri etter 72 timers inkubering av HCT116 tykktarmskreft , SW620 metastatisk tykktarmskreft, CCD18co menneskelige kolon fibroblaster og HEK293T embryonale nyrecellelinjer med 5-FU, TMPyP4 og IQ3A på equitoxic (IC
50 og IC
65) konsentrasjoner, eller DMSO (kjøretøykontroll). Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig prosent (%) av levedyktige, apoptotiske og mellom døde celler ± SEM, av minst tre forskjellige forsøk, for A. IC
50, og for B. IC
65 Konsentrasjonene av forbindelsene. a, p 0,05; b, p 0.01 fra DMSO (kjøretøy kontroll); c, p 0,05; og d, p 0,01 fra 5-FU.
For ytterligere å bekrefte effekten av IQ3A forbindelsene på induksjon av apoptose i HCT116-celler, ble apoptose fastslått ved å evaluere forandringer i atom morfologi av Hoechst flekker, og også av nexin assay, etter 72 timers inkubering med IQ3A forbindelser ved IC
50 konsentrasjoner. CCD18co celler ble anvendt i parallell for å bekrefte at IQ3A ikke utløse celledød i normale celler. Disse resultatene viste at IQ3A vesentlig indusere apoptose i HCT116-celler, med forbindelse 1a fremstilling av en markert økning i apoptose i forhold til kjøretøyet (fig 4A og 4B). I tillegg også bekreftet vi at IQ3A forbindelser ikke induserer apoptose i normale kolon fibroblaster CCD18co. P53 proteinet spiller en sentral og viktig rolle i kreft hos mennesker [33], med en kraftig svulst undertrykkende aktivitet via pleiotrope mekanismer. Derfor ble steady-state nivå av p53-protein undersøkt ved immunblotting, etter 72 timers inkubering med IQ3A forbindelser ved IC
50 konsentrasjoner for å fastslå deres engasjement på mekanismen av apoptose fremkalt av IQ3A. Våre data (figur 5A) viser klart at IQ3A økt p53 protein steady-state nivå i HCT116 4-7 ganger (
p
0,01) (figur 5A, venstre panel), som kan bli korrelert med høyere celledød verifisert av Guava ViaCount analysen. I SW620-celler, ble ingen signifikant økning i p53 steady-state ekspresjon detektert, muligens på grunn av den mutante status av p53 (figur 5A, midtre panel). Til slutt, i HEK293T celler, IQ3A viste ingen effekt på p53-protein ekspresjon, i samsvar med fravær av celledød i levedyktigheten analysen (figur 5A, høyre panel). I tillegg har vi videre undersøkt relevansen av p53 i mekanismen for apoptose fremkalt ved IQ3A, ved å stanse KRAS i HCT116 p53 villtype (p53 (+ /+)) og null (p53 (- /-)) isogene cellelinjer og evaluering av dens virkning på celledød, og på IQ3A-indusert celledød (figur 5B). Våre resultater viser klart at KRAS lyddemping induserte en høyere grad av celledød i forhold til siRNA kontroll (
p
0,05), og et høyere nivå av IQ3A-indusert celledød i HCT116 p53 (+ /+) sammen å HCT116 p53 (- /-) (
p
0,05 for 2a og 1a). Videre, i siRNA kontroll transfekterte celler, alt IQ3A signifikant induserte en høyere grad av celledød i HCT116 p53 (+ /+) sammenlignet med HCT116 p53 (- /-) (
p
0,05). Men i p53-mutant SW620 celler, IQ3A forbindelser ikke signifikant lokke fram celledød (Fig 3), og heller ikke de øker p53 protein steady-state uttrykk (fig 5). I overensstemmelse, KRAS og /eller HSP90 lyddemping ikke var i stand til å indusere celledød i denne cellelinje, mens KRAS lyddemping induserte en doseavhengig effekt på reduksjon av SW620-celleproliferasjon (S3 Fig). Sammen er disse dataene ytterligere bekrefter viktigheten av p53 for IQ3A induksjon av apoptose.
A. Nuclear morfologi og representative bilder av HCT116 humane tykktarmskreftceller og CCD18co menneskelige kolon fibroblaster etter Hoechst farging, evalueres av fluorescens mikroskopi etter 72 timers eksponering for equitoxic (IC
50) konsentrasjoner av 5-FU, TMPyP4 og IQ3A eller DMSO (kjøretøy kontroll) på 400x forstørrelse. Hvite Piler indikerer atom fragmentering og kromatin kondens, og B. apoptotisk celle populasjoner innhentet av Guava nexin flowcytometri følgende 72 timers inkubasjon av HCT116 og CCD18co celler med 5-FU, TMPyP4 og IQ3A på equitoxic (IC
50) konsentrasjoner, eller DMSO (kjøretøykontroll). Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig prosent (%) av tidlig (LR kvadrant) og sen (UR kvadrant) apoptotiske celler. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter; * P 0,05 og §p 0.01 fra DMSO (kjøretøy kontroll); og † p 0,05 og ‡ p 0.01 fra 5-FU.
A. p53 protein steady-state uttrykk evaluert av immunoblot forhold til DMSO (kjøretøykontroll), etter 72 timers eksponering for equitoxic (IC
50) konsentrasjoner av 5-FU, TMPyP4 og IQ3A. B. Cell populasjoner innhentet av Guava ViaCount flowcytometri følgende 72 timers inkubasjon av 5-FU, TMPyP4 og IQ3A på equitoxic (IC
50) konsentrasjoner, eller DMSO (kjøretøykontroll), i HCT116 p53 (+ /+) og p53 (- /-) isogene cellelinjer transfektert med 40 nM siRNA KRAS eller siRNA kontroll. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. A. §p 0.01 fra DMSO (kjøretøy kontroll); og ‡ p 0.01 fra 5-FU. B. * p 0,05 siRNA fra kontroll i P53 (+ /+) celler; §p 0,05 siRNA fra kontroll i p53 (- /-) celler; og † p 0,05 fra siRNA KRAS i p53 (- /-) celler
Til slutt, til kapasiteten på IQ3A forbindelser undertrykke
KRAS
uttrykk ble evaluert ved å tallfeste KRAS protein. i cancercellelinjer. Siden IQ3As har også vist seg å være effektive stabilisatorer av G4-sekvenser i HSP90 onkogen promoter region (tabell 1), ble ekspresjon av dette protein også evaluert. Fig 6A viser at G4 ligander 1a, 2a, 2d og TMPyP4 nedregulert ekspresjon av muterte KRAS med 35-60% i HCT116 og SW620 celler, med unntak av 2a (
p
0,01). I tillegg IQ3A også redusert HSP90 protein stabile nivåer, men i mindre grad i forhold til KRAS. Derfor vi neste undersøkt muligheten for IQ3A forbindelser til ned-regulere
KRAS
transkripsjon i tykktarm kreft celler.
KRAS
mRNA likevektsnivåer ble evaluert ved hjelp av RT-PCR etter 72 timers inkubering av celler med forbindelsene ved deres IC
50 konsentrasjoner, og sammenlignet med effekten av TMPyP4 ved equitoxic konsentrasjoner. G4 ligander som TMPyP4 har vist seg å binde seg til G4-strukturer fra
KRAS
promoter-regionen og fra 5′-UTR av
KRAS
mRNA, og også undertrykke både gentranskripsjon og oversettelse [ ,,,0],13,19]. Figur 6B viser at 1a, 2a og 2d var i stand til å ned-regulere KRAS transkripsjon ved ca 40% i HCT116-celler, men ikke vesentlig så i SW620 celler. En mulig forklaring er tidspunktet hvor vi evaluerte
KRAS
mRNA og protein steady-state nivåer. Etter 72 timer med IQ3A påvirkning kan det ikke lenger være signifikant undertrykkelse av
KRAS
promoter-aktivitet i cellelinje SW620, mens proteinnivåer forblir redusert som et resultat av oppsamlede IQ3A effekter. Også TMPyP4 var ikke i stand til å redusere
KRAS
mRNA likevektsnivåer i HCT116 cellelinje, i motsetning til en nedgang på ca 80% av proteinlikevektsnivåer (Fig 6A og 6B). Disse resultatene er i samsvar med den rapporterte evne TMPyP4 til fortrinnsvis akkumuleres i cytoplasma av celler [19], hvor det kan hemme
KRAS
mRNA oversettelse.
A. KRAS og HSP90 protein steady-state uttrykk evaluert av immunoblot forhold til DMSO (kjøretøykontroll), etter 72 timers eksponering for equitoxic (IC
50) konsentrasjoner av 5-FU, TMPyP4 og IQ3A behandling; B.
KRAS
mRNA steady-state uttrykk ble evaluert av Taqman Real-time RT-PCR med bestemte TAQMAN Analyser for KRAS og β-Actin for normalisering.
KRAS
mRNA steady-state uttrykk nivåer ble beregnet ved ΔΔCt metode, ved hjelp av DMSO (kjøretøykontroll) for kalibrering; og C. HEK293T celler ble ko-transfektert med pGL3-basisvektoren (tom vektor kontroll), eller med
KRAS
promoter luciferase reporter konstruere PGL-Ras0.5, eller PGL-Ras2.0, sammen med pRL- TK. Tjuefire timer senere ble celler utsådd i 96-brønners plater, ved 5000 celler per brønn. Deretter, 24 timer etter replating, ble cellene eksponert for IC
50 equitoxic konsentrasjon av testforbindelsene IQ3A, TMPyP4 og bærer (DMSO); D. HCT116, SW620 og HEK293T celler ble ko-transfektert med pGL3-basisvektoren (tom vektor kontroll), eller med KRAS promoter luciferase reporter konstruere PGL-Ras0.5, sammen med PRL-TK. Tjuefire timer senere ble celler utsådd i 96-brønners plater ved 5000 celler per brønn og utsatt for IC
50 equitoxic konsentrasjon av testforbindelser IQ3A, TMPyP4 og bærer (DMSO).
KRAS
promoter aktivitet ble evaluert av Dual-luciferase assay 72 h (C) eller 24 timer (D.) etter sammensatte eksponering. Resultatene er uttrykt som den luciferase-signal forholdet mellom PGL-Ras2.0 eller PGL-Ras0.5 til pGL3-basisvektor transfekterte celler, etter normalisering med Renilla Luciferase. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter; * P 0,05 og §p 0.01 fra DMSO (kjøretøy kontroll); og † p 0,05 og ‡ p 0.01 fra 5-FU.
For å validere at mekanismen for anti-proliferativ aktivitet og apoptotisk induksjon av IQ3A forbindelser innebærer undertrykkelse av
KRAS
genuttrykk som et resultat av stabilisering av G4 dannende sekvenser tilstede i promoteren, effekter av forbindelser på
KRAS
genpromoteren direkte ble evaluert av et luciferase reporter-analyse. For dette formålet, brukte vi to forskjellige størrelser promoter konstruksjoner som inneholder G4 regionen i
KRAS
genet promoter, klonet inn i pGL3 Basic ryggraden: PGL-Ras0.5, PGL-Ras2.0, og pGL3 Basic tom (ildflueluciferase negativ kontroll /uten promoter), ko-transfektert sammen med PRL-TK (transfeksjonseffektivitet normalisering) inn i HEK293T celler, som en G4 negativ kontroll. Denne konstruksjonen ikke havnen G4 sekvenser og er ufølsom for G4 relaterte effekter /regulering. Våre data viser tydelig at IQ3A forbindelser, på samme måte som TMPyP4, var i stand til å redusere betraktelig
KRAS
transkripsjon, foreslår vi ved å samhandle med G4-regionen i
KRAS
genet promoter, undertrykke nedstrøms coding- region uttrykk fra 40 til 60% i forhold til DMSO kontroll (
p
0,01) (figur 6C). Ved hjelp av begge plasmider, med 500 og 2000 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet, vi viser også at målregionen av IQ3A forbindelsene er innenfor dette område, således som sammenfaller med den polypurine G-rike tråd ansvarlig for G-quadruplex struktur sammenstilling [12 ]. Viktigere, vi var også i stand til å vise at IQ3A forbindelser, på samme måte som TMPyP4, var i stand til å redusere
KRAS
promoter aktivitet i HCT116 og SW620 celler (Fig 6D).
Konklusjoner
Vi har undersøkt i dette studiet muligheten for en gruppe på syv-karboksylat-indolo [3,2-
b
] kinolin-tri-alkylamin-derivater (IQ3A), som er potente stabilisatorer av DNA-G4-strukturer er tilstede i
KRAS
promoter, til ned-regulere
KRAS
uttrykk og indusere celledød ved apoptose, særlig i KRAS-avhengige tykktarmskreft cellelinjer. De IQ3A forbindelser viste markert anti-proliferativ aktivitet i en IC
50 utvalg lavere enn 2,69 mikrometer i HCT116 og SW620 celler. Spesielt i HCT116 cellene, IQ3A forbindelser på IC
65 konsentrasjonen økt celledød opptil 4,7 ganger (
p
0,01) og 2,4 ganger (
p
0,01) i forhold til DMSO eller 5-FU, respektivt. I tillegg, i ikke-maligne cellelinjer de IQ3A forbindelsene ikke forårsake signifikant celledød. Videre, de kraftig redusert
KRAS
mRNA uttrykk og proteinnivåer i tykktarm kreft celler muligens gjennom direkte transkripsjonen undertrykkelse av
KRAS
promoter. Våre data så langt er en samsvarende relasjon mellom transkripsjonen undertrykkelse og binding til G4 regionen innenfor denne arrangøren, men videre studier er nødvendig for å demonstrere en direkte kobling mellom de to. Undertrykkelsen effekten var forbundet med øket p53 protein steady-state nivået i HCT116, og bare en liten reduksjon av HSP90-nivå i de tre cellelinjene som ble testet, noe som indikerer at disse forbindelser ikke er også å ha en virkning på noen andre mulige G4 mål som i den HSP90-promoteren [27]. Snarere de IQ3A forbindelser selektivt rettet mot de
KRAS
driver gener i tykktarm kreft cellelinjer. Samlet viser disse resultatene at G4-bindende ligander, slik som disse indoloquinoline derivater, skjermpotensial som skal anvendes som nye anticancer terapeutiske midler, spesielt for behandlingen av kreft hos mennesker drevet av KRAS mutasjoner, som fremdeles er i stor grad kreft i høy udekket klinisk trenger.
Materialer og Metoder
Kjemi
7-karboksylat indolo [3,2
b
] kinolin tri-alkylamin derivater 1a-d og 2a-d (IQ3A) ble syntetisert som beskrevet i S1 tekst. 5-fluorouracil (5-FU) og TMPyP4 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA.
oligonukleotider sekvenser
Alle oligonukleotider ble kjøpt fra Eurofins MWG Synthesis GmbH, Tyskland. De merkede oligonukleotider benyttes i FRET analyser hadde festet donor fluoroforen FAM (6-karboksyfluorescein) og akseptor fluorofor TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine): KRAS21R (5′-FAM-AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGA-TAMRA-3 «); HSP90A (5′[FAM] -GGGCCAAAGGGAAGGGGTGGG- [TAMRA] -3 «); T-Loop (5»-FAM-TATAGCTATATTTTTTTATAGCTATA-TAMRA-3 «). Hvert oligonukleotid ble først fortynnet til en lagringsløsning på 100 mikrometer i nuklease fritt vann (ikke DEPC-behandlet), kjøpt fra Ambion Applied Biosystems Storbritannia.
FRET smelter analysen
Evnen IQ3A og TMPyP4 å stabilisere G-quadruplex og duplex DNA-sekvenser ble undersøkt ved hjelp av en Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) analyse. Stamløsning av oligonukleotidene sekvensene ved 20 uM og etterfølgende fortynninger ble oppnådd fra lagerløsninger fortynning med K-kakodylat-buffer pH = 7,4, inneholdende 60 mM K
+ (10 mM kaliumkakodylat, 50 mM KCl). Gnage probesekvenser ble fortynnet fra lager til riktig konsentrasjon (0,4 uM), og deretter glødet ved oppvarming til 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av avkjøling til romtemperatur. Testforbindelser ble fremstilt som 1 mM i 10% DMSO og 10% 1 mM HCI i HPLC-kvalitet vann. Resten av fortynninger ble utført ved anvendelse av FRET buffer. Hybridiserte DNA (50 ul) og forbindelse løsning (50 ul) ble fordelt på 96-brønners RT-PCR-plater (Bio-Rad; MJ Research, Waltham, MA, USA). Relevante kontrollene ble også utført for å kontrollere for interferens med analysen. Fluorescens-avlesninger ble gjort på en DNA-motor Opticon (MJ Research) med eksitasjon ved 450-495 nm og påvisning ved 515-545 nm, tatt ved intervaller på 0,5 ° C i området 30-100 ° C, med en konstant temperatur opprettholdes 30 s før hver avlesning for å sikre en stabil verdi. Forsøk ble utført in triplo. Endelige analysen av dataene ble utført med GraphPad Prism 5.0-programvaren (GraphPad Software, Inc). Den avanserte kurvetilpasningsfunksjon GraphPad Prism ble brukt for beregning av Δ
T
m
verdier og tilhørende standardavvik.
Cell kultur
SW620 menneskelige kolorektal adenokarcinomceller (European Collection of Cell Cultures, ECACC, Porton Down, Wiltshire, UK), HEK293T humane embryonale nyreceller (ATCC, LGC Standards, UK) HCT116 human colon carcinoma celler (ECACC), HCT116 p53 (+ /+) og p53 (- /-) isogene menneskelige tykktarmskreftceller (GRCF Cell Center og Biorepository, Johns Hopkins University, School of Medicine, Baltimore, MD, USA), ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotisk /antimykotisk (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), CCD18co human kolon fibroblaster (ATCC, CRL-1459) ble dyrket i Minimum Essential Medium (MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum , 1% antibiotisk /antimykotisk, 2 mM Glutamax, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) (Invitrogen) og 0,57 mM Rekombinant humant TNF-α (Peprotech, USA) og holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av
