Abstract
Histone modifisering spiller en sentral rolle på genregulering, som regnes som verdens epigenetiske markører, særlig i kreftrelaterte gener. Derfor har kjemiske metoder rettet mot histone modifiserende enzymer dukket opp på hovedscenen av kreft narkotika oppdagelse. Her undersøkte vi de terapeutiske potensialer og mekanistiske roller nylig utviklet histondeacetylase inhibitor, CG200745, i ikke-småcellet lungekreft celler. Behandling med CG200745 økte nivå på histon acetylering, noe som resulterer i hemming av celleproliferasjon. analyse ChIP-on-chip med en H4K16ac antistoff viste endret H4K16 acetylering på gener kritiske for hemming av cellevekst, selv om redusert ved transkripsjon start stedet av en undergruppe av gener. Altered H4K16ac var assosiert med endringer i mRNA-ekspresjon av de tilsvarende gener, som ble ytterligere validert i kvantitativ RT-PCR og Western blotting analyser. Våre resultater viser at CG200745 forårsaker NSCLC hemming av cellevekst gjennom epigenetisk modifikasjon av kritiske gener i kreftcelle overlevelse, og gir sentrale ledetråder som en lovende kjemoterapeutika mot lungekreft
Citation. Chun SM, Lee JY, Choi J, Lee JH, Hwang JJ, Kim CS, et al. (2015) epigenetiske Modulation med HDAC hemmer CG200745 induserer Anti-spredning i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0119379. doi: 10,1371 /journal.pone.0119379
Academic Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, KINA
mottatt: 22 august 2014; Godkjent: 30 januar 2015; Publisert: 17 mars 2015
Copyright: © 2015 Chun et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støttede tilskudd til studien var den koreanske Health Technology R D Project, Ministry of Health Velferd, Republikken Korea (HI06C0868, HI10C2014), Ledende Foreign Research Institute rekrutteringsprogram, Basic Forskning Promotion Fund, og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetiske modifikasjoner som CpG DNA metylering eller histon acetylering regnes som et viktig skritt i utviklingen av kreft, og derfor har blitt studert for å oppdage kreft biomarkører og terapeutisk stratege [1-3]. Når cytosin metylering oppstår på CpG-dinukleotider via virkningen av DNA-metyl-transferase (DNMT), er methyl cytosin opprettholdes til den neste generasjon på grunn av mangel av en DNA-de-metyl-transferase i pattedyr. Den irreversible histone modifikasjon er også blitt brukt som en biomarkør for tidlig diagnose eller prognose av kreft, så vel som et effektivt mål på legemiddel [4,5]. Acetylering eller metylering på lysinrester av H3 og H4 aminoterminale haler er dominerende histonmodifikasjonene, og hver er ansvarlig for ekspresjonen av bundne gener. For eksempel er metyleringer for lysin 4 av H3 og lysin 27 av H3 kjent som transkripsjons- aktiverende og undertrykke arrangementer for histon bundet gener, respektivt. Histon acetylering på lysin 16 av H4 er relatert til transkripsjonen aktivering og /eller replikasjon initiering av korresponderende gener. I normale celler, er histon acetylering nøyaktig kontrollert av histon acetyl transferase (HAT) og histondeacetylase (HDAC). Hyper-acetylering av onkogener eller hypo-acetylering av tumorsuppressorgener, er imidlertid ofte observert i ulike kreftformer. HDAC-inhibitorer (HDACi) er de mest utviklede anti-kreft medikamenter som målretter epigenetisk modulasjon og blir brukt for behandling av forskjellige kreftformer, særlig i faste tumorer, så som bryst-, tykktarm-, lunge- og eggstokk-kreft, så vel som i hematologiske tumorer , slik som lymfom, leukemi, og myelom [6-9]. I tillegg er epigenetisk feilregulering i lungekreft ofte forbundet med overekspresjon av HDAC1 og avvikende metylering av visse gener, noe som resulterer i terapeutisk effekt av kombinasjonsterapi epigenetisk målsøkende DNA metylering og histon deacetylering. HDACs består av tre klasser: Klasse I, HDAC 1, 2, 3 og 8; Klasse II, HDAC 4, 5, 6, 7, 9 og 10; og klasse III, HDAC 11 (sirtuins 1-7) [10,11]. HDACi, trichostatin A (TSA) [12,13] eller vorinostat (Saha) [14-16] inhibere klasse I- og II-HDAC-enzymer, noe som resulterer i vekstarrest, apoptose, differensiering og anti-angiogenese av kreftceller, når den brukes uavhengig eller i kombinasjon med andre anti-cancermidler. Mekanistisk spiller restaurering av dempede tumorsuppressorgener eller undertrykkelse av aktiverte onkogener i kreftceller en kritisk rolle i de anti-kreft-effekter av medikamenter. Dette blir etterfulgt av induksjon av cellesyklus-stans i G1 trinnet gjennom ekspresjon av p21 og P27-proteiner, eller et G2 /M overgang forsinkelse gjennom den transkripsjonelle nedregulering av cyklin B1, plk1, og Survivin.
HDAC inhibitor CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimetylamino) propyl) -N (8) -hydroksy-2 – ((naftalen-1-Loxy) metyl) okt-2-enediamide, har nylig blitt utviklet og for tiden gjennomgår en fase I klinisk studie. Sin hemmende virkning på cellevekst har blitt demonstrert i flere typer kreftceller, inkludert prostatacancer, nyrecellekarsinom, og RKO celler (colon carcinoma-celler) i mono- og kombinasjonsterapi med andre anticancer legemidler [17-19]. Mekanismen som ligger til grunn cellevekst inhibering av CG200745 i RKO celler har vist seg å forekomme i en p53-avhengig måte [19]. Viktigere, økt CG200745 acetylering av p53 på lysinresidier K320, K373, og K382. CG200745 også induserte akkumulering av p53, fremmet p53-avhengig trans og forbedret uttrykket av proteiner kodet av p53 målgener,
MDM2 Hotell og
p21 plakater (Waf1 /Cip1) i human prostatakreft celler. I denne studien, vurderte vi antitumoreffekter og utforsket de direkte målene for en CG200745 på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler for å verifisere ekstra indikasjonen kreft. Vi analyserte celleproliferasjon og endret genuttrykk mønster på histon deacetylering gjennom ChIP-on-chip analyse, real-time PCR kvantifisering og western blotting. Våre resultater tyder på at HDAC hemmer CG200745 fører epigenetisk reaktivering av kritiske gener som er transcriptionally undertrykte i kreft, og derfor kan være en lovende NSCLC kreft terapeutisk.
Materialer og metoder
Kjemi og cellelinjer
HDAC hemmere (HDACi), suberoylanilide hydroamic (vorinostat, Saha) og CG200745, ble gitt av Crystal Genomics Co (Seoul, Rep. Korea). Disse forbindelsene ble oppløst i DMSO og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Humane ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer og en immortalisert normal bronkiale epitel cellelinje (Beas-2B) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin med 5% CO
2 ved 37 ° C.
Western blotting
50 ug av hele celleekstrakter ble kjørt på SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert og inkubert med spesifikke primære antistoffer mot H4K16ac, CCND1, p21, og caspase 3 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac fra Santa Cruz (Santa Cruz, California) og β- Actin fra Sigma (St. Louis, MO). Etter inkubasjon med passende pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer ble bånd oppdaget ved hjelp av ECL-reagens (Amersham-GE Healthcare og biovitenskap, Pittsburgh, PA).
Real-time kvantitativ PCR
Total RNA forberedelse og cDNA syntese ble utført ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California), og Super III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Grand Island, NY) på IQ5 Multicolor Real-Time deteksjon system (Bio-Rad) med hver av forover og bakover primer for
CCNA2
,
CCNB1
,
CCND1
,
CCNE2
,
CDK2
,
Bax-en
,
bcl- 2
,
p16
,
p21
,
p27
, og
Mxi1 plakater (Bionics, Seoul, Korea) (S1 tabell).
Cvtotoksisitetsmålinq
IC
50 av hver HDACi på lungekreft celler ble bestemt gjennom celleproliferasjonsanalyse hjelp CellTiter 96 AQ
ueous One Solution Reagens (Promega, Madison, WI) henhold til produsentens protokoll. Etter annen tidsperiode inkubasjon med HDACis ble absorbans deretter målt ved 490 nm på Wallac 1420 Victor3 med trening to programvare.
FACS analysen
Effekten av CG200745 på NSCLC cellesyklus ble analysert på Flowcytometri hjelp propidiumjodid (PI) farging. Etter inkubasjon med CG200745 eller DMSO, ble cellene fiksert med iskald 70% etanol ved 4 ° C over natten. Genomisk DNA ble farget med 30μg /ml PI og fluorescens ble målt med en FACS Calibur maskin (Becton Dickinson, Mountain View, California). Den røde fluorescens på grunn av PI-farget DNA ble samlet på 560 nm dichroic speil og en 600 nm pass filter (båndbredde, 35 mikrometer). En total på 10.000 celler ble samlet ved FACS og analysert ved hjelp av Cell quest 3.1-programvare (Becton Dickinson).
Chromatin immunoprecipitation (chip)
chip analysene ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Kort sagt ble celler behandlet med 3 um CG200745 eller DMSO i 24 timer utfelt med et anti-acetyl-H4K16 antistoff (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Etter kryssbinding med 1% formaldehyd, ble kromatin fragmentert i 300 ~ 800 bp størrelse ved ultralydbehandling i Bioruptor, UCD-200 (Diagenode, Denville. NJ). Kromatin /proteinkomplekser ble utfelt med en modifisert histon spesifikt antistoff og protein A /G pluss immobilisert agarose perler. Etter eluering fra perlene, utfelt DNA-proteiner var omvendt-kryssbundet, og DNA ble renset med en PCR rensing kit (Qiagen, Valencia, CA)
microarray eksperimenter på chip produkter:. ChIP-on-chip eksperimenter
chIP-on-chip-analysen ble utført på en Agilent 244k × 2 oligonukleotid microarray som produsentens instruksjoner (Agilent pattedyr chIP-on-chip Protocol v.10). Kort sagt ble inngangsstyre for fullcelle-ekstrakter og de rensede Chip produktene amplifisert ved ligering-mediert PCR ved anvendelse av en kunstig oligonukleotidlinker, etter blunting DNA-ender ved anvendelse av T4 DNA-polymerase. Deretter ble forsterket inn- og chip-produkter merket med fluorescerende BioPrime Total Genomisk Merking System (Invitrogen). Den samme mengde av inngangs DNA og chip produkt med forskjellige fluorescerende fargestoffer ble blandet med humane Cot-1-DNA (1 mg /ml), og hybridisert til en Agilent 488k promoter-matrise (to 244k arrays), inneholdende ~ 17 000 av de definerte humane transkriptene dekker fra -5.5 kb til +2,5 kb av transkripsjon start stedet (TSS). Hybridiserte bildene ble visualisert med microarray scanner (Revolution 4200;. Vidar Systems Cor, Herndon, Virginia)
Data Analysis og ontologi analyse
Histon acetylering av chip-produkter og innspill ble analysert ved hjelp av. chip-komponent av DNA Analytics (Agilent, versjon 4.0.81) med Tukey biweight normalisering, Whitehead feil modell, og Whitehead Per-Array Neighborhood modell. Kort fortalt ble log2 ratio for hvert gen av CHIP produkter og innspill beregnet på gjennomsnittet av sonder i 1,000bp, vurderer gener med en p-verdi lavere enn 0,1 som verdifullt. For å skildre H4K16ac status fra transkripsjonsstartsetet (TSS), ble avstanden for hver sonde forenkles som følger: region mellom-1000 ~ -500 fra TSS ble nummerert som-2, -500 ~ TSS som-en, og TSS ~ + 500 som en, som TSS posisjon definert fra-11-10.
Funksjonell merknader gjennom kvantitativ RT-PCR og Western blotting ble etterfulgt av analyse ved hjelp av DAVID (Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery) bioinformatikk ressurs og Gene Ontologier (Molecular Funksjon, biologisk prosess, Cell komponenter) for signalveier. Alle kategorier som representerer mindre enn 4% av det totale antall av anvendt gener ble ekskludert.
Resultater
CG200745 hemmer spredning av NSCLC celler
For å bestemme den hemmende effekten av CG200745 på celleproliferasjon, målte vi IC
50 av CG200745 av de følgende lungecancercellelinjer: Calu6, H358, H596, A549, HOP62, HOP92, H226, H460 og H522, samt Beas2B celler. IC
50 verdier av CG200745 i de testede lungekreftceller var på mikromolare nivåer, og var sammenlignbare med dem som oppnås fra referanse stoffet, Saha (tabell 1), noe som indikerer en betydelig vekst undertrykkelse effekt av CG200745 på ulike NSCLC-cellelinjer. Blant dem, A549, Calu6, HOP92, og H522 celler var den mest følsomme med IC
50 av 3 mikrometer. Effekten av CG200745 på Calu6 celleproliferasjon ble bekreftet som det cellenummer og morfologi på optisk mikroskopi etter eksponering til 3 uM CG200745 i forskjellige tidsperioder (fig. 1). Calu6 celler viste regulær celle vekstmønster på en tidsavhengig måte inntil 8 timer etter medikamentbehandling. Men etter 8 timers CG200745 behandling, ble veksten i Calu6 cellene reduseres, og celledød med morfologiske endringer ble registrert. Den negative effekten av CG200745 på Calu6 cellevekst ble analysert ved å utføre MTT analysen med ulike forhold, noe som bekrefter at medikamentet redusert celleproliferasjon til 40% av ubehandlede celler (fig. 1A).
Calu6 cells dyrket på 6-brønners plater ble behandlet med 3 uM CG200745 for de angitte tidsperiodene for å analysere den anti-spredning effekt av CG200745, og ble observert i henhold til mikroskop. (B) Veksten av Calu6-celler i 96-brønners plater ble analysert via MTS assay ved behandling med forskjellige konsentrasjoner av CG200745 (0 til 10 uM) i tidsforløpet (0 til 48 timer). Statistisk signifikans av endringer i celle levedyktighet ble beregnet ved hjelp av t-test (*** indikerer p 0,001)
CG200745 behandling induserer G2 /M cellesyklus og apoptose i Calu6 celler
HDACi forbindelser er kjent for å indusere cellesyklusstans, et viktig mål kreft mekanisme, i forskjellige kreftceller. For å undersøke hvorvidt CG200745 indusert syklus-stans i Calu6 cellelinje, disse cellene ble behandlet med denne HDACi molekylet for forskjellige tidspunkter fra 0 til 24 timer, etterfulgt av strømningscytometrisk analyse (FACS). Som vist på fig. 2A, en økning i G2 /M populasjon ble observert i en tidsavhengig måte. CG200745-behandlede Calu6 celler viste en signifikant øket celleandelen i G2 /M-fase (69%) sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (26%) (fig. 2B og 2C). Disse resultatene indikerer at CG200745 fører til hemming av cellevekst gjennom G2 /M-fase cellesyklus-stans.
Calu6 celler behandlet med 3 uM av CG200745 ble analysert cellesyklus på strømningscytometer. Hvert histogram består av to sorte topper og en riper region som indikerer G0 /G1 fase, G2 /M fase, og S-fasen, respektivt. Effekten av CG200745 på cellesyklusfordelingen ble analysert ved forskjellige tidspunkter for (A), eller sammenlignet med ubehandlede celler (B) som viser som en grafisk visning (C).
CG200745 forårsaker øket histon acetylering
for å undersøke HDAC hemmende effekter av CG200745 på ikke-småcellet lungekreft celler, behandlet vi Calu6 celler med ulike konsentrasjoner av CG200745 og analysert histone acetylering av western blotting, samt lue og HDAC aktivitet på ulike tidspunkter. Som vist på fig. 3A, lav konsentrasjon av CG200745 behandling øket acetylering av histon H3 og H4 på forskjellige steder, inkludert K9 på H3, og K16 samt S1 /5 r /K8 /K12 på H4, på en tidsavhengig måte i opptil 24 timer etter betraktelig behandling i western blotting analyse. For å bekrefte de hemmende effekter av CG200745 på histon deacetylering, målte vi HAT og HDAC aktivitet i kjernefysiske ekstrakter av Calu6 celler før og etter CG200745 behandling. I motsetning til den uforandret HAT aktivitet etter CG200745 behandling (Fig. 3B), HDAC aktivitet i CG200745-behandlede Calu6 cellene var betydelig lavere enn den i ubehandlede kontrollceller (Fig. 3C), noe som indikerer at CG200745 øket histon acetylering nivå på grunn av hemming av HDAC aktivitet.
(A) Acetylering status av histoner ble analysert ved Western blotting av Calu6 celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CG200745 (0 til 10 uM) med anti-H3K9ac, anti-H4K16Ac, anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac og /eller anti-acetyl H4 antistoffer. (B, C) lue og HDAC aktiviteter i kontroll og CG200745-behandlede celler ble bestemt ved å bruke 50 ug av kjerneekstrakt på angitte tidspunkt.
CG200745 induserer histone modifikasjons endringer i Calu6 celler
H4K16ac er en velkjent aktivator av global gentranskripsjon. For å undersøke om gener som regulerer celle overlevelse ble påvirket av histone acetylering følge CG200745 behandling, utførte vi ChIP-on-chip analyse ved hjelp av en H4K16ac spesifikt antistoff. Gener bundet til H4K16ac ble immunopresipitert og analysert på oligonukleotid microarray fokusert på promoter regionen. Hovedformålet med dette forsøket var å finne ut hvor mange og hvilke gener relatert til H4K16ac status påvirkes av CG200745 behandling. Som vist i tabell 2, ble mer enn 10.000 gener bundet til H4K16ac påvist i både kontroll- og CG200745-behandlede celler, med ekspresjonsnivåer av tusener av gener som viser endringene i den H4K16ac chip on-chip-analyse etter CG200745 behandling.
Vi undersøkte mønsteret av H4K16ac endres i henhold til avstanden fra TSS ved å avsette en midlere log verdi på chip /inngang for alle prober (fig. 4), hvor X-aksen betegnet avstanden fra TSS området som beskrevet i forrige avsnitt. Den H4K16ac var overraskende, redusert på det tilstøtende området av TSS, spesielt ved-500 nt fra den TSS, etter CG200745 behandling, mens H4K16ac ved fjernt område fra TSS var ingen forskjell med den i ubehandlede kontrollcellene, noe som er vanlig på grunn den transkripsjonelle aktivering funksjon av H4K16 (fig. 4A). Den gjennomsnittlige tømmerandel på chip /inndata tydelig demonstrert at færre gener med H4K16ac 500 nt fra TSS ble sett i behandlede celler sammenlignet med kontrollceller, selv om en større modifikasjons stedet for H4K16ac var fortsatt tydelig rundt TSS (Fig. 4B) . Disse resultatene ble bekreftet i gjentatte forsøk, noe som indikerer at CG200745 behandling undertrykker H4K16 acetylering ved 500 nt fra TSS på mange gener.
H4K16 acetylering tilstøtende til TSS ble vurdert ved å beregne gjennomsnittet chip /inngangs log-forholdet i samme avstand fra TSS. Tallene i X-aksen viser avstanden fra TSS. Y-aksen representerer den gjennomsnittlige chip /innspill log-forhold. (A) H4K16 acetylering status av gener rundt TSS ble individuelt avbildet i CG200745-behandlede eller ubehandlede Calu6 celler. (B) Nivået av H4K16 acetylering ble sammenlignet mellom CG200745-behandlede og ubehandlede celler i henhold til avstanden fra TSS. To separate forsøk ble utført for å beregne feilfelt for hver posisjon.
Sammenheng mellom endringer i H4K16ac og genekspresjon følgende CG200745 behandling
H4K16ac-indusert genekspresjon er drevet av løsning av kromosomalt DNA bundet til histonproteinene, noe som resulterer i åpning av DNA-områder for forskjellige transkripsjonsfaktorer. I henhold til en hypo-acetylert status, men den positive ladningen av lysinrestene i aminoenden av histon halen virker som en kilde for høy affinitetsbinding til den negative ladningen av fosfat-hovedkjeden i kromosomalt DNA. Denne tette binding gjør det mulig kromatin til å danne mer kompakte strukturer, noe som resulterer i inhibering av transkripsjon av relaterte gener. Som vist i tabell 2, ble H4K16ac nivåene av tusener av gener endret etter CG200745 behandling. For å bekrefte sammenhengen mellom H4K16ac status og tilsvarende genuttrykk, ble mRNA nivåer undersøkt for gener som gjennomgikk betydelige H4K16ac endringer rundt TSS området. Som vist i tabell 3, er mRNA-ekspresjonsnivåene av
p
21,
GSN-b
, og
Mxi1
, noe som viste økt H4K16ac, ble alle øket etter behandling CG200745 , mens andre gener med redusert H4K16ac, slik som
HOXD11
,
HOXD9
, og
PIM1
, viste redusert mRNA uttrykk. I tillegg mRNA uttrykk for
HAT1
, som viste lignende H4K16ac nivåer med og uten CG200745 behandling, ble ikke endret.
For å bekrefte sammenhengen av mRNA uttrykk og endringer i den videre H4K16ac etter CG200745 behandling, mRNA uttrykk for
CCND1 Hotell og
p21
gener ble vurdert. De H4K16ac nivåer av
CCND1 Hotell og
p21
-promoter regionen ble analysert i ubehandlet (kontroll) og CG200745 behandlet (CG5) Calu6 celler ved hjelp av en hel gen probe microarray. Som vist på fig. 5, den H4K16ac nivå i
CCND1 Hotell og
p21
gener etter CG200745 behandling, spesielt i nærheten av TSS posisjon, ble funnet å være vesentlig endret (Fig. 5A) og å være korrelert med uttrykket av mRNA når kvantitativt målt (fig. 5B). Uttrykk for
Mxi1
ble økt etter 24 timer behandling av CG200745 på Semi kvantitativ analyse med to forskjellige sett med primere (Fig. 5C). De protein uttrykk nivåer av
cyclin D1 Hotell og
p21
gener ble dramatisk redusert og økt henholdsvis ikke bare i Calu6 celler, men også i flere andre NSCLC celler, inkludert A549, H358 og H596 celler (fig. 6). I tillegg CG200745 behandlingen resulterte i aktivering av den indre apoptotiske caspase 3, i Calu6 celler så vel som i flere NSCLC-celler, inkludert A549, H358 og H596-celler (fig. 6A og 6B). Samlet utgjør disse dataene viste at uttrykket nivåer av visse gener ble påvirket av CG200745 behandling gjennom H4K16ac nivået ved TSS regionen.
(A) Nivåene av H4K16 acetylering på CCND1 og
p
21 gener ble betegnet i henhold til avstanden fra den TSS på ubehandlede (kontroll) og CG200745-behandlede celler (CG5). (B) mRNA nivåer av CCND1 og
p
21 gener ble kvantifisert ved real-time RT-PCR. (C) Et uttrykk for den Mxi1-genet ble bestemt ved RT-PCR i A549 og Calu6 celler.
Cellene ble analysert på Western blotting med cyklin D1, p21, caspase-3, c-myc, acetyl-H4, H3, og p-aktin antistoffer. Cellelysater av narkotikabehandlet A549, Calu6 (A), H358 og H596 (B) celler ble sammenlignet med tilsvarende ubehandlede celler.
Diskusjoner
HDACi molekyler har blitt rapportert til indusere en rekke kreft effekter, inkludert tumor celle apoptose, cellesyklus arrest, differensiering, senescence, modulering av immunresponser, og endret angiogenese [20]. Videre har bruken av HDACi vist seg å øke følsomheten av NSCLC-cellelinjer til gefitinib eller erlotinib [21,22]. CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimetylamino) propyl) -N (8) -hydroksy-2 – ((naftalen-1-Loxy) metyl) okt-2-enediamide, er et nylig utviklet HDACi , for tiden gjennomgår en fase I klinisk studie. Sin hemmende virkning på cellevekst har blitt demonstrert i flere typer kreftceller, inkludert prostatacancer, nyrecellekarsinom, og RKO celler (colon carcinoma-celler) i mono- og kombinasjonsterapi med andre anticancer legemidler [17-19]. Dette stoffet i kombinasjon med docetaxel indusert tumorregresjon i DU145 prostatakreft celle xenograft via aktivering av apoptose. Dessuten forårsaket celledød i tykktarm carcinoma-celler som uttrykker villtype p53 ved acetylering av p53. I vår nåværende studie undersøkte vi de antitumor effekter av HDACi på NSCLC celler til potensielt utvide sin kliniske programmet med brede kreftindikasjoner. Vi videre ment å belyse den underliggende mekanismen av romanen HDAC hemmer som nå er i kliniske studier for leukemi og solid svulst, der riktig klinisk anvendelse ville bli oppnådd, for eksempel co-behandling og /eller adjuvant behandling med målrettede kjemoterapeutika. HDACi behandling induserte hemming av lungekreft cellevekst, cellevekstarrest i G2 /M fase, og apoptose dokumentert av caspase 3 spaltning ved sammenlignbare IC
50 konsentrasjoner til det i Saha (også kjent som Vorinostat), den eneste HDACi øyeblikket godkjent for klinisk behandling av kutan T-cellelymfom [23-25]. Selv H4K16 acetylering fortsatt skjedde lag promoter regioner, interessant, CG200745 spesielt redusert histone H4K16 acetylering at-500 nukleotider fra TSS som vist ved gjentakelse CHIP-on chip analyse. Disse resultatene indikerer at HDAC-inhibitor-formidlet hemming av cellevekst innebærer den transkripsjonelle regulering av multiple gener. Dyptgående analyse av gener som er involvert i cellesyklusregulering, for eksempel
CCND1
,
p21
, og
Mxi1
, viste at CG200745 behandlingsresultater i transkripsjons endringer i disse genene .
Mxi1
, en antagonist av
c-myc
onkogen, koder for et protein betegnet Mad2, som er en transkripsjonsfaktor i Myc-Max-Mad nettverk. The Mad /MXI heterodimer er spådd å motvirke Myc funksjon ved å avskaffe tilgjengelig Max for myc transkripsjonen aktivitet. Transkripsjonsfaktoren c-myc er overuttrykt i mange humane svulster, og dens aktivering krever heterodimerisering med partneren Max. C-myc er regulert gjennom ubiquitinering og proteasome degradering [26,27]. Faktisk har inhibering av Myc /Max binding av små molekyler blitt identifisert som et lovende mål for cancerterapi [28]. Mxi1 messige spredning er mediert gjennom IGFBP-3-signalisering [18], og økt ekspresjon FoxO3a oppregulerer ekspresjonen av medlemmer av Mad /MXI sti [29]. Oppregulert ekspresjon av Mxi1 ved CG200745 behandling kan derfor spille en rolle i reguleringen av celleproliferasjon via Myc-Max-Mad-nettverk.
Saha HDACi, har vist seg å redusere ekspresjonsnivåene av ERK1 /2 og MMP-9, øke ekspresjonsnivåene av p53, som i sin tur endrer celleproliferasjon og apoptose, og fremme acetylering av histoner H3 og H4 in ovarian carcinoma celler [30]. Videre har en tidligere studie rapporterte at Saha aktiverer p53, men krever ikke p53 for sin kreft effekter. Den samme studien viste at entinostat-indusert cytotoksiske effekter er delvis avhengig av p53, noe som indikerer at ulike HDACi forbindelser har ulike krav til p53 [31]. Mekanismen som ligger til grunn cellevekst inhibering av CG200745 i RKO celler har vist seg å forekomme i en p53-avhengig måte [19]. I den studien, økt CG200745 acetylering av p53 på lysinresidier K320, K373, og K382. CG200745 også induserte akkumulering av p53, fremmet p53-avhengig trans og forbedret uttrykket av proteiner kodet av p53 målgener,
MDM2 Hotell og
p21 plakater (Waf1 /Cip1) i human prostatakreft celler. Den antitumor-effekter av CG200745 for NSCLC-celler, ble det imidlertid funnet i vårt nåværende analyser å være uavhengig av mutasjon status for de gener som koder for p53. NSCLC-celler vi benyttet, inkludert p53 villtype og null /mutante celler, viste cellevekstinhibering ved behandling med en HDACi, noe som indikerer at CG200745 regulerer cellevekst ved forskjellige mekanismer i henhold til celle sammenheng.
Som konklusjon, funn av vår foreliggende undersøkelse utvide den generelle anvendelighet av CG200745 til behandling av NSCLC, for hvilken det er en lovende ny HDACi. I tillegg viser våre resultater viser at effekten av denne HDACi kan skje via en p53-uavhengig mekanisme. Videre viser dataene at HDACi kan undertrykke c-myc signalveien gjennom induksjon av
Mxi1
, men dette funnet krever videre undersøkelse. Til slutt, til potensialet i CG200745 forbedre styrken av kreft narkotika som del av en kombinasjonsbehandling bør videre utforsket
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Primer sekvenser for kvantitativ RT-PCR reaksjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0119379.s001 plakater (docx)
bekreftelser
Støttede tilskudd til studien var den koreanske Health Technology R D Project, Ministry of Health Velferd, Republikken Korea (HI06C0868, HI10C2014), Ledende Foreign Research Institute rekrutteringsprogram, Basic Forskning Promotion Fund, og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192).
