Abstract
Bakgrunn
Vi rapporterer her isolering og karakterisering av en ny forbindelse Ailanthus excelsa kloroform ekstrakt-en (AECHL-1) (C
29H
36o
10; molekylvekt 543,8) fra roten bark av
Ailanthus excelsa
Roxb. Forbindelsen besitter anti-kreft-aktivitet mot en rekke kreftcellelinjer av forskjellig opprinnelse.
Hoveddeler
AECHL-en behandling i 12 til 48 timer hemmet celleproliferasjon og indusert død i B16F10, MDA-MB-231, MCF-7, og PC3-celler med minimal veksthemming i normal HEK 293. Anti-tumoreffekten av AECHL-1 var sammenlignbar med den til konvensjonelle antitumormedikamenter paclitaxel og cisplatin. AECHL-1-indusert veksthemming ble forbundet med S /G
2-M arrestasjoner i MDA-MB-231, MCF-7, og PC3 celler og en G
1 arrest i B16F10 celler. Vi observerte mikrotubuli avbrudd i MCF-7-celler behandlet med AECHL-1 in vitro. Sammenlignet med kontroll, subkutan injeksjon av AECHL-1 til områder av svulst i mus melanoma B16F10 implantert i C57BL /6-mus og humane brystcancer MCF-7-celler i atymiske nakne mus resulterte i signifikant reduksjon i tumorvolum. I B16F10 tumorer, AECHL-1 ved 50 ug /mus /dag dose i 15 dager resulterte i økt ekspresjon av tumor p53 /p21, reduksjon i ekspresjonen av oncogenet c-Myc, og nedregulering av cyklin D1 og cdk4. I tillegg AECHL-en behandling resulterte i fosforylering av p53 på serin 15 i B16F10 svulster, som synes å vise p53 avhengig veksthemmende tiltak.
Konklusjoner
Den nåværende data viser aktiviteten til en triterpenoid AECHL-1, som har et bredt spektrum av aktivitet mot kreftceller. Vi foreslår her at AECHL-en er et futuristisk anti-kreft narkotika som terapeutisk potensial må bli mye utforskes for kjemoterapi mot kreft
Citation. Lavhale MS, Kumar S, Mishra SH, Sitasawad SL (2009) A Novel triterpenoid Isolert fra roten bark
Ailanthus excelsa
Roxb (Tree of Heaven), AECHL-en som en potensiell middel mot kreft. PLoS ONE 4 (4): e5365. doi: 10,1371 /journal.pone.0005365
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Cleveland Clinic, USA
mottatt: 03.02.2009; Godkjent: 11 mars 2009; Publisert: 28 april 2009
Copyright: © 2009 Lavhale et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen var støtte ved Institutt for bioteknologi, Ministry of Science and Technology, Government of India, New Delhi. Santosh Kumar fikk en stipendiatstilling fra det indiske rådet for medisinsk forskning og Manish Lavhale fra Universitetet Grants Commission. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ifølge Verdens helseorganisasjon basert på sykelighet, dødelighet, økonomisk byrde, og følelsesmessig motgang, kreft kan betraktes som den mest tapsbringende helseproblem som rammer mennesker over hele verden [1]. Foreløpig er mer enn 22,4 millioner mennesker i verden lider av kreft. Omtrent 10,1 millioner nye tilfeller diagnostisert med kreft hvert år, og mer enn 6,2 millioner dør av sykdommen i 2000 [2]. Dette representerer en økning på rundt 19% i insidens og 18% i dødelighet siden 1990. Et viktig mål med kreftforskning er å finne terapeutiske forbindelser som har høy spesifisitet for kreftceller /svulst og færre bivirkninger enn de i dag brukes cytostatisk /cytostatika.
Tallrike plante-avledet forbindelsene anvendt i kreftkjemoterapi er vinblastin, vinkristin, camptothecinderivater, etoposid avledet fra epipodofyllotoksin, og paclitaxel (Taxol®) [3]. Men de fleste av disse forbindelsene utstillings celle toksisitet og kan indusere gentoksiske, kreftfremkallende og teratogene effekter i ikke-kreftceller, og noen av dem mislyktes i tidligere kliniske studier [4], [5]. En annen mest brukte metallbasert medikament ved fore mot utvalgte typer kreft er cisplatin [6], men bruk av cisplatin i kurativ behandling var forbundet med noen alvorlige kliniske problemer, slik som sterk normalt vev toksisitet og resistens mot behandlingen [7] . Disse bivirkningene begrense bruken som kjemoterapeutika tross sin høye effekt i behandling av målet ondartede celler. Følgelig nye terapier og behandlingsstrategier for denne sykdommen er nødvendige for behandling av pasienter med denne sykdommen. Derfor er letingen etter alternative legemidler som er både effektive i behandling av kreft, så vel som ikke-toksiske for normale vev er et viktig forskningslinje [8].
terpenoids er i utstrakt bruk for sine aromatiske egenskaper. De spiller en rolle i tradisjonelle urtemedisiner og er under etterforskning for antibakteriell, antineoplastiske, og andre farmasøytiske funksjoner. Naturlige triterpenoids, slik som oleanolsyre og ursolic syre, er forbindelser med anti-tumorigen og anti-inflammatoriske egenskaper [9]. Syntetiske triterpenoid derivater så som 2-cyano-3, 13 dioxooleana-1,9 (11) -dien-28-onsyre (CDDO) [10] og dets derivat 1- [2-cyano-3, 12-dioxooleana- 1,9 (11) -dien-28-oyl] imidazol (CDDO-Im) [11] har også anti-tumor-aktivitet. Root bark av
Ailanthus excelsa
Roxb (Tree of Heaven), et tre som tilhører familien
bittervedfamilien
er mye brukt i Ayurveda som gjenspeiles av Plantevern [12]. Andre arter fra denne familien er kjent for deres anti-kreft aktivitet [13]. Kjemiske bestanddeler av
A. excelsa
inkluderer noen triterpenes og alkaloider [14]. I denne studien har vi evaluert
in vitro Hotell og
in vivo
anti-kreft aktivitet av en roman triterpenoid, AECHL-en isolert fra roten bark av anlegget og funnet å være svært effektiv i kreftceller med ulik avstamning.
Materialer og metoder
Isolering og karakterisering av AECHL-en
roten bark av
A. excelsa
ble botanisk bekreftet av professor Shrihari Mishra (en av forfatterne i dagens manuskript) og utvinning og fraksjonering av lufttørket pulverisert rot bark ble gjort ved hjelp av kloroform. Isolering av AECHL-1 ble utført ved anvendelse av silikagel-kolonnekromatografi, og karakteriseres ved ultrafiolett (Shimadzu 1700), infra rød (Perkin Eimer Spectrum RX1), kjernemagnetisk resonans (Bruker Avance I NMR Spectrometer) og massespektroskopi (ved Jeol SX 102 masse spektrometer). Renheten av AECHL-1 ble bestemt ved HPLC på en RP C-18 Phenomenex kolonne under anvendelse av metanol-vann (90:10, volum til volum) som den mobile fase. Den rensede forbindelse, AECHL-1 ble oppløst i DMSO som stamløsninger.
Cellelinjer
Normale humane embryonale nyrecellelinje (HEK 293), mus melanoma B16F10-celler (B16F10), human bryst karsinom (MDA-MB-231), human bryst-adeno-karsinom (MCF-7) og human prostata (PC3-celler) ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). HEK 293, MCF-7 og B16F10-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium og PC3 i Hams F-12 media (Gibco) ved 37 ° C under 5% CO
2. MDA-MB-231-celler ble dyrket i Leibovitz L-15 (Gibco) supplementert med 10% FCS (Gibco), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fuktig atmosfære ved 37 ° C.
celleviabilitet assay
direkte interferens mellom forskjellige konsentrasjoner av AECHL-1 (0-200 pM) og MTT i et cellefritt system ikke ble observert, og derfor ble MTT-test som benyttes for å teste cellelevedyktighet i den aktuelle system. HEK 293, B16F10, PC3, MCF 7 og MDA-MB-231-celler (4 x 10
3 /brønn) ble dyrket i 96-brønners plater, og etter 24 timer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-1 (0-200 uM), cisplatin (0-100 uM) eller paclitaxel (0-50 uM) for 12, 24 og 48 timer ved 37 ° C. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT (0,5 mg /ml) omdannelse som tidligere beskrevet [15].
celle proliferasjonsanalyse
spredning av MCF-7-celler ble bestemt ved å måle (
3 H ) tymidin inkorporering. I korthet ble alikvoter av komplett medium inneholdende 4 x 10
3-celler ble fordelt i 96-brønns vevskulturplater. Etter 24 timer ble mediet erstattet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-1 (0-100 uM), cisplatin (0-100 uM) eller paclitaxel (0-50 uM). Seks timer etter behandlingen en uCi /brønn (
3H) tymidin (Board of Radiation og Isotope Technology, Mumbai, India) ble tilsatt og kulturene ble inkubert videre for 42 timer ved 37 ° C. Celler ble vasket og samlet i scintillasjons-blanding, og radioaktivitet inkorporert i DNA ble bestemt med en væskescintillasjonsteller (Canberra Packard).
Annexin V-FITC bindingsanalysen
B16F10, MDA-MB -231 og MCF-7-celler (3 x 10
5 /ml) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-1 (0-40 uM) i 24 timer ved 37 ° C. Cellene ble høstet etter 24 timer, apoptose ble påvist ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose deteksjonssett (Calbiochem, USA) med strømningscytometri (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av Cell quest software for å bestemme prosent av apoptotiske celler.
Cell syklus analyse
B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7 celler (3 x 10
5 /ml) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-1 (0-100 uM), eller paclitaxel (0-10 uM) i 24 timer. Cellesyklusanalyse ble utført som beskrevet tidligere [16], med strømningscytometri (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av Cell quest software
Immunocytochemistry
MCF-7 celler ble fiksert med 3,7% paraformaldehyde, og deretter inkubert med anti-a-tubulin antistoffer (1:10000;. Sigma, St. Louis, MO). Etter at antistoffene var vasket av, ble cellene inkubert med Alexa-konjugerte sekundære antistoffer (1:200; Sigma, St. Louis, MO). Bilder ble tatt med et konfokal laser scanning mikroskop (Zeiss LSM510).
Animal tumormodeller
Mann C57BL /6 (6-8 uker gamle) og kvinnelige atymiske nakne mus, NIH, nu /nu sveitsiske (10 uker) ble opprettholdt i samsvar med Central Animal Etisk Komité prosedyrer og retningslinjer. B16F10 melanom-celler ble høstet, suspendert i PBS og injisert subkutant inn i høyre flanke (2 x 10
6 celler /flanke) av C57BL /6 mus og MCF-7-celler (5 x 10
6 celler /flanke ) inn i hunn atymiske nakne mus. Hver atymisk mus ble implantert subkutant med en 0,72 mg av 17-β-østradiol pellets, 2 uker før inokulering av MCF-7-celler [17], [18]. Tumorstørrelse ble målt hver 3-4 dager ved en tykkelse og svulstvolum bestemmes av lengden (
L
) og bredden (
W
):
V
= (
LW
2) /2 [19]. Etter to uker, AECHL-1 (50 ug), AECHL-en (100 ug), cisplatin (100 ug) og PBS som bærerkontrollen ble injisert subkutant til setet for tumor i 15 dager i C57BL /6-mus (n = 6 ) og AECHL-1 (5 mikrogram), AECHL-en (10 mikrogram), paclitaxel (20 mikrogram) og PBS som kjøretøykontroll ble injisert subkutant til området av svulst per dag i 10 dager i kvinnelig atymiske nakne mus (n = 6 ). Tumorvolumet ble målt med jevne mellomrom i løpet av studien. Ved slutten av eksperimentet tumor og andre organer ble dissekert ut for histologiske analyser og Western blot.
Immunhistokjemi
vev og organer i C57BL /6 og nakne mus ble fiksert i formalin for alkohol 24 time og innstøpt i parafin som tidligere beskrevet [20]. Vevssnitt (5 mikrometer) ble farget med hematoxylin og eosin (H E), visualisert og fotografert med en omvendt mikroskop (Nikon, ECLIPSE, TE2000-U, Japan)
Immunoblotting
Tumorvevet vevet~~POS=HEADCOMP ble homogenisert i RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 1,0% Triton x 100, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksycholat, 10% glyserol, 1 mM EDTA og 1 x protease inhibitor cocktail, Roche) proteiner ble isolert i oppløst form og konsentrasjonen ble målt ved Bradford-analyse (Bio-Rad proteinanalyse kit). Solubiliserte protein (60 ug) ble denaturert i 2 x SDS-PAGE-prøvebuffer (sigma), løst i 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembran etterfulgt av blokkering av membranen med 5% fettfri tørrmelk (w /v) i TBST (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Membranene ble inkubert med kanin polyklonale anti-p21 og anti-pp53 antistoffer (1:1000, Santa Cruz, CA), mus monoklonalt anti-CDK4, anti-Cyclin D1 antistoffer (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) , mus monoklonalt anti-c-myc-antistoff og monoklonalt anti-p53-antistoff (1:1000; Abcam, USA), etterfulgt av HRP-konjugerte sekundære antistoffer hensiktsmessige og visualisert ved en forsterket kjemiluminescens (Pierce) deteksjonssystem. Membraner ble strippet og re-analysert med β-aktin primær antistoff (1:10000, MP Biomedicals, Ohio, USA). Som et protein lasting kontroll
statistikker
De innrapporterte data for tumorvolum er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Statistiske forskjeller ble bestemt av ANOVA og post test brukt var Tukey-Kramer multippel sammenligning Test
Resultater
kjemi. Ultrafiolette, infra rød, kjernemagnetisk resonans, og masse karakterisering av AECHL-en
IR (KBr): 3425, 3419 (hydroksylgruppe), 2972, 2966, 2923, 2873 (alkyl CH strekk), 1733 (δ lakton), 1718 (Bi acetyl), 1680 (C = O konjugering alken), 1652 (C = C strekk), 1600 (aromatisk), 1492, 1454, 1394 (metyl strekk), 1222 (δ lakton), 1184, 1110, 1051, 1031 (acetaler), 1018 nm (alkaner).
1H-NMR (DMSO, 400 Hz) δ: 0,95 (3 H,
t
, 4′-CH
3), δ: 1,15 (3 H, d, H-24), δ : 1,235 (3H, d, 5′-CH
3), δ: 1,5 (2H, ddd, 5′-CH
2), δ: 1,73 (3H, ddd, H-21), δ: 1,83 (1H, s, H-9), δ: 1,87 (1H, s, H-14), δ: 1,9 (2 H, s, H-18), δ: 2,16 (3H, s, H-18), δ: 2,3 (3 H, d, H-19) δ: 2,71 (2H, s, H-20), δ: 3,45 (2H, dd, H-23), δ: 3,65 (2H, d, H-22) , δ: 3,95 (1H, t, H-12), δ: 4,05 (2H, s, H-22), δ: 5,30 (1H, s, H-15), δ: 5,46 (1H, s, OH -2), δ: 5,73 (1H, d, OH-2 «), δ: 6,89 (1H, s, H-3), δ:. 8,82 (1H, s, OH-11)
Fast atom bombardement massespektroskopi:
m /z:
1068 på grunn av dimmer formasjon. Selve (M
+) ble ansett for å være 543,8, 463,3 (MC
4H
1o
2), 461,4 (MC
4H
2o
2), 459,4 (MC
4H
4O
2), 361,2 (MC
9H
11o
4) (figur 1B) og Mass Spectra (figur S1). AECHL-en er et fast stoff, smp. 248-250 ° C besatt en molekylformel på C
29 H
36o
10 som indikert ved EI og ES massespektra. IR-spektret viste tilstedeværelse av hydroksyl (e) (3425 nm, 3419 nm), δ lakton (1733 nm), og aromatiske gruppen (1600 nm). UV-spekteret ga en karakteristisk absorpsjonsmaksimum ved 235 nm, noe som indikerer nærværet av auxochromic grupper som hydroksyl og keton. Den
1H-NMR-spektrum av AECHL-1 avslørte tilstedeværelsen av et aromatisk proton δ 6,89 og en singlett ved 5,30 δ som er karakteristisk for esterfunksjonen ved C-15. H-22 fremstått som en AB-systemet som en singlett ved δ 4.05 og dublett ved δ 3,65 og H-12 fremstått som en lett på δ 3,95. Metylgruppen H-19 på den aromatiske ring vist som singlett ved δ 2,3. En dublett ved δ 1,235 til seks protoner er tildelt ved H-5 «. H-4 «dukket opp som en lett på δ 0,95. . Den metylgruppe, H-18 fremstått som en singlett ved δ 2,16 (figur 2)
Enkelt peak indikerte at preparatet var . 99% ren
inhibering av celle-levedyktighet, proliferasjon og apoptose ved AECHL-1
Effekt av AECHL-1 på levedyktigheten av B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7 celler ble vurdert. AECHL-1 inhiberte cellevekst av MCF-7-celler i en treringstrinnet og tidsavhengig måte ved MTT-analysen (figur 3A). AECHL-1 hemmet cellevekst i forskjellige kreftcellelinjer med et minimum veksthemming i HEK 293 ved 48 timer (figur 3B). HEK 293 ble behandlet med 200 uM AECHL-1 oppviste høy overlevelsesgrad (mer enn 90%) sammenlignet med kreftceller. AECHL-1 ble funnet å være mer effektive på MCF-7 i sammenligning med B16F10, PC3 og MDA-MB-231 i inhibering celleproliferasjon som observert ved den (
3H) tymidin etter 48 timer (figur 3C). Videre AECHL-1 ble funnet å være mer potent enn paclitaxel eller cisplatin i inhibering celleproliferasjon i MCF-7-celler etter 48 timer (figur 3D).
(A) Cellevekst ved MTT-analyse i MCF-7 cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-en (10, 20, 40 og 100 uM) for 12, 24 og 48 timer og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay; (B) Cellevekst av MTT-analyse i B16F10, PC3, MDA-MB-231 MCF-7 og HEK-293 celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-en (10, 20, 40 100 og 200 uM) i 48 timer, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay; (C) celleformering ved (
3H) tymidin inkorporering i B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7 celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-en (10, 20, 40 og 100 uM) i 48 timer, og celleformering ble bestemt ved (
3H) tymidin inkorporering; (D) Sammenligning av AECHL-en med andre kjemoterapeutiske legemidler. MCF-7-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (5, 10, 20, og 50 uM) av paclitaxel, cisplatin og AECHL-1 i 48 timer, og celleformering ble bestemt ved (
3H) tymidin inkorporering. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Annexin V-FITC konjugert og propidiumjodid (PI) flekk ble brukt til å analysere den totale andelen av apoptotiske celler indusert av AECHL-1. Etterforskeren å identifisere tidlig apoptotiske celler (Annexin V-FITC positive, PI negative), celler som er i slutten av apoptose (Annexin V-FITC og PI positive), den nekrotiske celler (PI positive bare) og celler som er levedyktige (Annexin V -FITC og PI negativ). Total prosentandel av apoptotiske celler økes opp til 36,25% og 37,18% ved 20 uM i B16F10, MDA-MB-231 celler henholdsvis og 60,66% ved 5 uM i MCF-7-celler (figur 4).
Påvisning av apoptose ble gjort av Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit ifølge produsentens instruksjoner og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri: UR viser prosentandelen av sen apoptotiske celler (Annexin V og PI positive celler), og LR viser prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (Annexin V positive celler) dataene presenteres i dot blot viser annexin /fluoresceinisotiocyanat (
x
aksen) vs. PI farging (
y
akse). Prosentandelen av celler i hver kvadrant er vist. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
AECHL-en indusert cellesyklus arrest i kreftceller
For å bestemme den fasen av cellesyklus hvor AECHL-en utøver sin vekst inhibitorisk effekt, eksponentielt voksende B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AECHL-1 i 24 timer og analysert ved flowcytometri (tabell 1). Vi har observert at B16F10-celler behandlet med AECHL-1 viste en økning i befolkningen i G
en fase (52,18 til 72,08%) med en samtidig reduksjon i prosentandelen av celler i S-G2 /M fase (47,98 til 26,16% ), noe som tyder på en G
1 arrest. I motsetning til dette antall PC3, MDA-MB-231 og MCF-7-celler i S-G2 /M fase økes fra 42,91% til 57,62%, 49,40% til 77,16% og 45,13% til 70,97% henholdsvis i respons til behandling med AECHL-en og et redusert i G1 fasen fra 55,65% til 39,02%, 49,54% til 22,82%, 53,67% til 27,85% henholdsvis antyder en vekst arrest i S-G2 /M fase i PC3, MDA-MB-231 og MCF- 7 celler. Paclitaxel behandling viste en økning i populasjonen av MCF-7-celler i G2 /M fase (29,30% til 72,55%) med en reduksjon i prosentandelen av celler i G1 fase (48,30% til 4,62%), og antyder en vekst arrest i G2 /M fase (tabell 1). Disse resultatene foreslår at inhibering av cellesyklusprogresjon kan være en av de molekylære hendelser assosiert med selektivt anti-kreft effekt av AECHL-1 i kreftceller.
Effekt av AECHL-1 på cellulære mikrotubuli
mikrotubuli farging i kontroll og celler behandlet med AECHL-1 og paclitaxel, viste at både AECHL-1 og paclitaxel resulterte i mikrotubulus avbrudd med en økning i tettheten av cellulære mikrotubuler og dannelsen av tykke mikrotubul bunter som omgir kjernen i sammenligning til de ubehandlede kontrollcellene (figur 5).
MCF-7-celler ble behandlet med kjøretøyet som en kontroll, AECHL-1 (5 uM) og paclitaxel (5 uM) som en positiv kontroll i 24 timer, og mikrotubuli (rød) ble visualisert ved indirekte immunfluorescens. DAPI ble anvendt for å flekke cellekjerner (blå). Representant for 25-30 celler hver på 3 separate eksperimenter.
Effekt av AECHL-en på primærtumorvolumet i allograft og xenograft
Vi undersøkte også effekten av AECHL-en på in vivo veksten av primære svulster. Våre innledende undersøkelser viste at av de forskjellige doser av AECHL-en (0,5 til 5 mg /kg) injisert intraperitonealt i C57BL /6 mus, er den maksimale tolererte dose var en enkelt dose på 0,5 mg /kg som viste ingen åpenbare tegn på toksisitet når observert i en måned. På bakgrunn av dette, den dose som ble valgt var 50 og 100 ug /kg /døgn (en dose som var 10-20% av den maksimale tolererte dose). På dag 18 signifikant økning i tumorvolumet i kontrollgruppen (p 0,001) og en regresjon i tumorvolum var tydelig i mus behandlet med 50 ug AECHL-1 (44,303 ± 5,20% (p 0,001)) og med 100 ug AECHL- 1 (51,014 ± 1,27% (p 0,001)). Tumorer som ble behandlet med 100 ug cisplatin viste en reduksjon i tumorvolum (93,13 ± 0,539% (p 0,001)). Imidlertid ble AECHL-1 (50 ug) vs. AECHL-en (100 ug) funnet å være ikke-signifikant (P 0,05). På dag 24 kontroll, AECHL-1 (50 ug) og AECHL-1 (100 ug) behandlede mus viste ytterligere økning i tumorvolum (p 0,001), men mus behandlet med cisplatin viste reduksjon i tumorvolum (p 0,001). Imidlertid, selv om cisplatin viste ytterligere reduksjon i tumorvolum, skader forårsaket på andre organer var mer enn det i den AECHL-1 (50 100 ug) behandlet gruppe i C57BL /6 mus (figur 6A og 6B)
.
(A) Fotografier av C57BL /6-mus som viser fire uker gamle allograft tumorvekst av B16F10-celler;
under,
utskårne svulster med respektive mus; (B) Tumor volum ble bestemt ved tidsintervaller som er beskrevet i «Materialer og metoder». Tumorvolum hos forsøksdyr etter behandling med 50, 100 ug AECHL-1 og 100 ug cisplatin ble sammenlignet med tumorvolumet av kontrolldyrene; (C) Fotografier av atymiske nakne mus som viser fire uker gamle xenograft tumorvekst med MCF-7-celler;
under,
utskårne svulster med respektive mus; (D) Tumor volum av forsøksdyr etter behandling med 5, 10 ug AECHL-1 og 20 ug paclitaxel ble sammenlignet med tumorvolumet av kontrolldyrene. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SE av seks utgangs dyr i hver gruppe. Signifikante forskjeller mellom
* Intra-gruppen ved hvert tidspunkt er representert som:
ns p 0,05,
* p 0,05,
** P 0,01,
*** P 0,001 og
#INTER gruppe i forskjellige doser er representert som
ns P 0,05,
# 0,05,
## P 0,01,
### P. 0,001
Siden de cytotoksiske doser av AECHL-1 for MCF-7-celler in vitro var meget lave, de doser som er valgt for tumorxenotransplantater i hunn atymiske nakne mus injisert med MCF-7 celler ble 5 og 10 ug. Disse dosene viste tilbakegang i tumorvolum som: 35,72 ± 0,05% i 5 mikrogram (p 0,001) og 28,55 ± 0,06% for 10 mikrogram (p 0,001), mens svulster behandlet med 20 mg paclitaxel viste en tilbakegang i tumorvolum (14,19 ± 0,32% (p 0,05).), som var mindre enn den AECHL-1-behandlede gruppen (figur 6C og 6D)
Effekter av AECHL-1-behandling på tumorsupres og cellesyklusregulerende proteiner i tumor allograft av C57BL /6 mus
Vi evaluerte effekten av AECHL-1-behandling på ekspresjon av tumor suppressor protein p53, cellesyklusregulerende protein syklin D og cdk4 og oncogenet c-Myc. Som vist i figur 4E, AECHL-1 ved 50 ug /mus /dag administrert til B16F10-implanterte tumorer i C57BL /6 mus resulterte i en økning i ekspresjonen av villtype p53-protein, og deretter redusert ved en høyere konsentrasjon (100 ug /mus /dag). Nivået av p53 var større i AECHL-1-behandlede gruppe enn i den cisplatin-behandlede gruppen, noe som indikerer at anti-tumor virkning av AECHL-1 var forskjellig fra cisplatin. Siden fosforylering på Ser-15 rester av p53 er avgjørende for p53-avhengig aktivering av cellesyklusregulerende proteiner for G1 arrest, vi bestemt fosforylering status av p53 og cyclin D1 og cdk4. AECHL-1-behandling resulterte i en økning i fosforylering av p53 ved serin 15 residuet i tumorer ved 50 ug /mus /dag med en samtidig økning i nivået av p21 og redusert ved 100 ug /mus /dag. Western blot analyse viste at behandling med 50 og 100 ug /mus /dag AECHL-1 forårsaket en signifikant reduksjon i syklusregulerende proteiner cyclin D1 og cdk4. Behandling med 50 og 100 ug /mus /dag AECHL-1 også forårsaket en signifikant reduksjon i oncogenet c-Myc således indikerer at inhibering av cellesyklusen kan være ansvarlig for antitumor-virkningene av AECHL-1 (figur 7).
tumorvev lysater ble underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western immunblotting. Membranene ble probet med anti-p53, pp53, p21, c-myc, cyclin D1, CDK4, og p-aktin-antistoffer etterfulgt av peroksidase-konjugert egnede sekundære antistoffer, og visualisert ved forsterket kjemiluminescens påvisningssystem. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater og en representativ blot er vist for hvert protein.
Histologisk analyse av tumorvev og andre organer i C57BL /6 mus
Histologisk undersøkelse av tumor i C57BL /6 kontroll mus viste godt utviklet blodkar, økt neovascularization, celletetthet og forekomst av blødnings områder med sannsynlige tegn på angiogenese med økt mulighet for metastasering (figur 8.1a). Behandling av tumorer med 50 ug AECHL-1 viser ikke stor innflytelse på tumor vaskularisering, men viste mindre forekomst av blødningsområder, reduksjon i tumorcelletetthet og forekomst av picnotic /nekrotiske celler i midten av tumoren (figur 8.1b). Behandling med 100 pg AECHL-1 viste økning i nekrotiske celler, forsvinning av neovaskularisering, hemoragisk områder og lav celletetthet sammenlignet med kontroll (figur 8.1c), og således indikerer at AECHL-1 hindret utviklingen av angiogenese og risiko for metastase ved å blokkere neovaskularisering . Cisplatin behandlede gruppen viste signifikant økning i nekrotiske celler, redusert tumorcelletetthet og volum (figur 8.1D)
(1) Representant H . E-fargede seksjoner fra B16F10 allograft svulster og egenskapene til disse svulstene var analysert (1A-1D). Morfologiske karakteristika for hjerte (1E-1 H), nyre (1I-1L), lever (1M-1P) og milt (1Q-1T), ble seks mus anvendt i hvert sett av eksperimenter. (2) Representant H E-fargede seksjoner fra MCF-7 xenografttumorer og egenskapene til disse svulstene ble analysert (2A-2D). Morfologiske karakteristika for hjerte (2E-2H), nyre (2I-2L) og lever (2M-2P), milt (2Q-2T), tre mus ble benyttet i hvert sett av eksperimenter.
Sammenlignet med kontroll, hjertet vev av musene behandlet med 50 mikrogram AECHL-en viste normal struktur, mens 100 mikrogram viste omfattende hjerteinfarkt fiber nekrose og sammentrekning band. Fragmentering og flekker av muskelfibre karakteristisk for koagulative nekrose ble sett (Figur 8.1E-8,1 g). Cisplatin behandlede mus viste også nekrose av myokardial fiber, svak lymfocyttinfiltrasjon og også fragmentering og tilsmussing av muskelfibre (figur 8.1H).
Sammenlignet med kontroll, nyrene hos mus behandlet med 50 ug AECHL-1 viste svak rørformet vacuolization og rørformet dilatasjon med hemoragisk områder med normale glomeruli som opptrer ved den nedre del. Behandling med 100 mikrogram AECHL-en viste rørformet vacuolization, rørformet utvidelse, hemoragisk tilstand og spredte kroniske betennelsesceller infiltrater (Figur 8.1I-8.1K). Cisplatin behandlede mus viste spredte lymfocytter i og rundt fartøyet. Mange nøytrofile ble også sett i tubuli og interstitium dvs. pyelonefritt (figur 8.1L).
I forhold til kontroll, leveren av mus behandlet med 50 mikrogram AECHL-en ikke påvirke den normale arkitekt. Mus behandlet med 100 ug AECHL-1 beholdt den normale arkitekt av leveren (figur 8.1m-8.1O). I cisplatin behandlede mus, ble imidlertid utstrakt nekrose av hepatocytter sett. Pilen til høyre viser døde hepatocytter og dette mønsteret kan sees med en rekke hepatotoxins, hvor fokus hepatocytter nekrose med lymfatisk infiltrasjon oppstår. I disse vev, lesjoner se lik som Tyzzer sykdom karakterisert ved nekrose med varierende grader av betennelse i respons til nekrose. Akutte lever lesjoner består av nekrotisk foci omgitt av minimal, primært nøytrofil, betennelse (figur 8.1P).
Representative miltsnitt fra Kontroll og mus behandlet med 50 mikrogram AECHL-en viste normal milt arkitekt og mus behandlet med 50 ug AECHL-en. Kontroll og mus behandlet med 100 ug AECHL-1 og cisplatin viste hyperplasi av den hvite masse, spesielt i den marginale sone (Ψ). Histologi viste økt antall granulocytter i randsonene (Figur 8.1Q-8.1T).
Histologisk undersøkelse av svulstvev og andre organer i nakne mus
Svulster fra kontroll mus viste uttalt neovascularization hele seksjonen omgitt av svært tette celler og fravær av nekrotiske celler (figur 8.2A). AECHL-1 ved 5 ug dose viste redusert tumorcelletetthet og lakunene hele tumorområdet. Den viste også tap av neovasulization og fravær av hemoragisk områder (figur 8.2B). AECHL-en på 10 mikrogram viste mange tomme plasser, forekomst av hemoragisk områder ble sett, men reduksjon i vasculization ble ikke sett (figur 8.2C). Behandling med paclitaxel reduserte tumorcelletetthet med forekomst av mange tomme mellomrom og nekrotiske områder i seksjonen (figur 8.2D).
Behandling med 5 ug AECHL-1 ikke viste noen endring i normal hjertemuskelen, mens 10 mikrogram AECHL-en og Paclitaxel viste nekrose av hjerteinfarkt fiber. Paclitaxel viste omfattende myokardial nekrose fiber med fragmentering og flekker av myokard (figur 8.2E-H). Ingen vesentlig endring ble observert i nyre struktur fra AECHL-1 behandlede grupper, mens paclitaxel behandling viste tegn til rørformet vacuolization utvidelse med hemoragisk områder (Figur 8.2I-8.1L). Både AECHL-en og Paclitaxel viste ingen endring i den normale arkitekturen av leveren (figur 8.2m-8.2P) og miltsnitt (figur 8.2Q-8.2T).
Diskusjoner
