Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA-molekyler på 20 til 22 nukleotider som regulerer genuttrykk ved å binde seg til sin 3 «ikke-translatert område (3’UTR). Økende data implisere endret miRNA deltakelse i utviklingen av kreft. Vi har tidligere rapportert at CYP2J2 epoxygenase fremmer humane kreft fenotyper. Men hvorvidt og hvordan CYP2J2 er regulert av miRNA ikke blir forstått.
Metoder og resultater
Ved hjelp av bioinformatikk analyse, fant vi potensielle måls for miRNA la-7b i 3’UTR av menneskelig CYP2J2. Luciferase og vestlige blot analyser viste at CYP2J2 ble regulert av skuffelse 7b. I tillegg vil redusert la-7b den enzymatiske aktiviteten til endogent CYP2J2. Videre kan la-7b redusere celleproliferasjon og fremmer celle apoptose av tumorceller via posttranskripsjonelt undertrykkelse av CYP2J2. Tumorxenotransplantater ble indusert i nakne mus ved subkutan injeksjon av MDA-MB-435 celler. Den la-7b ekspresjonsvektor, pSilencer-la-7b, ble injisert gjennom halevenen hver 3. uke. La-7b betydelig hemmet svulst fenotype ved å målrette CYP2J2. Dessuten var kvantitativ real-time PCR og western blotting benyttes til å bestemme uttrykket nivåer av la-7b og
CYP2J2
protein fra 18 avstemt lunge-skvamøs celle kreft og tilstøtende normalt lungevev; ekspresjonsnivået av CYP2J2 var omvendt proporsjonal med den i la-7b.
Konklusjoner
Våre resultater viste at den reduserte ekspresjon av la-7b kan føre til høy ekspresjon av CYP2J2 protein i kreft vev. Disse funnene tyder på at miRNA la-7b reduserer CYP2J2 uttrykk, som kan bidra til å hemme tumor fenotyper
Citation. Chen F, Chen C, Yang S, Gong W, Wang Y, Cianflone K, et al. (2012) La-7b Hemmer Menneskelig Cancer Phenotype av Targeting cytokrom P450 Epoxygenase 2J2. PLoS ONE 7 (6): e39197. doi: 10,1371 /journal.pone.0039197
Redaktør: Gangjian Qin, Northwestern University, USA
mottatt: 19 desember 2011; Godkjent: 16 mai 2012; Publisert: 25 juni 2012
Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra National Basic Research Program = «973 =» (nr 2012CB517801) og NSFC (nr 30930039 og 81070236). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneske cytokrom P450 (CYP) epoxygenase, CYP2J2 katalyserer epoksydering av arakidonsyre i fire regioisomerer av cis-epoxyeicosatrienoic syre (5,6-EET, 8,9-EET; 11,12-EET, og 14,15-EET) [1]. Dette enzymet ser ut til å være primært uttrykkes i hjerte og fartøyet endotelceller [2], og det har også blitt funnet i forskjellige vev, inkludert lever, lunge, nyre, og gastrointestinale vev [3]. Fordi forskjellene i den katalytiske effektivitet av individuelle isoformer P450 resultater i de forskjellige EET profiler for hver [4], 11,12- og 14,15-Eets er de først og fremst arachidonsyremetabolitter fremstilt i forskjellige celler og vev, [5], [6] .
Flere studier har rapportert at Eets har forskjellige biologiske effekter i det kardiovaskulære systemet. De Eets frigjøres fra endotelet aktivert kalsium-sensitive kaliumkanaler og resulterte i hyperpolarisering av glatte muskelceller og vaskulær avslapning [7]. Videre fysiologiske konsentrasjoner av Eets eller overekspresjon av
CYP2J2
redusert vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1) ekspresjon og hindret leukocyttadhesjon til karveggen [8]. De inhiberende virkninger av Eets viser at de har anti-inflammatorisk virkning i vaskulære system uavhengig av deres membran Hyperpolarizing effekter [8]. I tillegg Eets også fremmes endotelcelle proliferasjon, migrering og angiogenese ved å aktivere både mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og fosfatidylinositol-3 (PI3) -kinase /akt trasé [9].
På den annen hånd, andre bevis tyder på at epoxygenase overekspresjon eller Eets behandling har potensielt skadelige effekter. I nyere publikasjoner, ble CYP2J2-avledet Eets funnet å spille viktige roller i en rekke prosesser knyttet til kreft celle atferd og tumor patogenesen. Vi fant høy ekspresjon av CYP2J2 i humane tumorer, så vel som i åtte human-deriverte karsinom-cellelinjer, men ikke i tilstøtende normale vev og nontumoral humane cellelinjer [10]. Overekspresjon av CYP2J2 eller tilsetning av eksogene Eets markert akselerert proliferasjon og metastase av kreftceller in vitro og in vivo [10], [11]. CYP2J2 overekspresjon eller tilsetning av eksogent Eets beskyttet humane karsinomceller fra apoptose ved oppregulering av antiapoptotic proteiner, Bcl-2 og Bcl-xL, og ved downregulating apoptosiske protein, Bax [10]. I motsetning til dette selektive inhibitorer av CYP2J2 hatt betydelige antitumor-effekter in vitro og in vivo og ble assosiert med redusert EET-biosyntese [12]. Kollektivt, alle funnene viste de viktige og tidligere ikke roller CYP2J2 og dets EET produkter i kreftutvikling.
Økende bevis tyder på at mirnas spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, slik som spredning, differensiering og apoptose under utvikling [13], [14], [15]. Flere studier har faktisk beskrevet avvikende ekspresjon i humane svulster i mirnas og deres funksjon å styre ekspresjonen av visse onkogener og tumorsuppressorgener [16], [17], [18]. For eksempel er MIR-15a og MIR-16 ofte slettet eller nedregulert i plateepitelkreft karsinomer og adenokarsinomer i lungene [19]. MikroRNA-101 er nedregulert i blæren overgangsordning celle carcinoma (TCC) vev og hemmer celledeling og kolonidannelse i TCC cellelinjer ved direkte undertrykke onkogen EZH2 [20]. En fersk studie viste at miRNA-la-7a hemmer uttrykk for MYC og reverserer MYC-indusert vekst i Burkitt lymfom celler [21]. Tidligere rapporter tyder på at La-7 er dårlig uttrykt i en rekke humane tumorer og redusert la-7 nivå resulterer i overekspresjon (cyklinD, RAS, MYC) av la-7-responsive gener i tumorer [22], [23] , [24], [25]. Men den eksakte rolle la-7 i kreft er ennå ikke fullt ut forstått. Våre foreløpige data viser at la-7b er nedregulert i humane lunge squamous svulster, mens nivåene av CYP2J2 protein er oppregulert, noe som tyder på at menneskelig CYP2J2 kan være post-transcriptionally regulert av la-7b. Derfor hensikten med denne studien var å undersøke denne hypotesen som la-7b kan fungere som en tumor suppressor gjennom målretting CYP2J2.
Resultater
La-7b Mål den 3’UTR av
CYP2J2
for å undersøke om CYP2J2 er regulert direkte av la-7b, bygget vi en luciferase reporter plasmid som inneholder 3’UTR av CYP2J2 klonet nedstrøms luciferasereportergenet (figur 1A). Vi transfektert luciferase bygge inn HepG2 cellene sammen med la-7b eller tilfeldig la-7b. Vi fant at transfeksjon av pMIR /CYP2J2-3’UTR sammen med la-7b resulterte i en betydelig reduksjon i reporter aktivitet enn gjorde de av kontroll og tilfeldig transfeksjoner. På den annen side, kunne ingen signifikant nedregulering av den pMIR rapportøraktivitet bestemmes når vi transfektert den pMIR reporter (tom vektor) samt la-7b eller tilfeldig la-7b inn i HepG2-celler (figur 1B). For ytterligere å bekrefte at CYP2J2 er et mål på la-7b, bygget vi syv mutanter (pMIR /CYP2J2-3? UTR mutant, mutant-en, mutant-to … og mutant-6, henholdsvis) basert på pMIR /CYP2J2-3? UTR. Deretter transfekteres disse konstruerer vi inn i celler (MDA-MB-435 og SK-MES-1) og analysert luciferase reporter-aktivitet. Analysene viste at luciferaseaktivitet av pMIR /CYP2J2-3? UTR-mutanten ikke ble undertrykt av la-7b, sammenlignet med villtype pMIR /CYP2J2-3? UTR (figur 1C og D). Blant de resterende seks mutanter (mutant-1, mutant-2 … mutant-6), luciferase-aktivitet av mutant-3 ble undertrykt av la-7b, sammenligning med tilfeldig og kontroll (
P
0,05) ( Figur 1E). Videre bindingssetet III helt matchet frø sekvens av la-7b hvis slingbaseparring var tillatt. Disse dataene indikerer at CYP2J2 er ett av målene for la-7b.
En skjematisk fremstilling av de antatte målse av la-7b i 3’UTR av CYP2J2. Den 3’UTR av CYP2J2 ble klonet inn i et luciferase reporter plasmid, betegnet pMIR /CYP2J2-3’UTR. En rekke mutanter gjennomført muterte nukleotider i seks potensielle bindingssteder for la-7b frø regionen ble generert basert på villtype pMIR /CYP2J2-3’UTR. Mutanter av pMIR /CYP2J2-3’UTR er konstruert av mutere utfyllende nettstedet (merket med understreking) i la-7b frø regionen til sine komplementære baser. B, luciferase-aktivitet ble analysert i HepG2-celler 24 timer etter transfeksjon med reporter plasmid pMIR /CYP2J2-3’UTR eller pMIR (tom vektor). C-D, full-lengde sekvens CYP2J2-3’UTR inneholder muterte bindingssteder for la-7b frø regionen ble generert basert på villtype pMIR /CYP2J2-3’UTR. Vi transfektert disse konstruksjonene inn i celler (MDA-MB-435 og SK-MES-1) og analysert luciferase reporter-aktivitet. Som vi forventet, la-7b påvirket ikke luciferaseaktivitet av mutanter sammenlignet med vill-type. E, de seks mutanter ble transfektert inn i SK-MES-1-celler, i tillegg til la-7b eller tilfeldig la-7b. Luciferase-aktivitet av de seks mutanter ble ikke undertrykt av la-7b. Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble brukt til å normalisere ildflue luciferase aktivitet. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
. 0,05
La-7b Hemmer uttrykk nivåer av endogen CYP2J2 og dens enzymatisk aktivitet in vitro
For å undersøke effekten av eksogent utleid -7b på proteinnivået og enzymatiske aktiviteten til endogene CYP2J2 proteiner, vi undersøkt proteinnivåer CYP2J2 i HeLa, Tca-8113, SK-MES-1, og MDA-MB-435-celler etter behandling med la-7b i 48 timer (100 nM). Western blot analyse viste at overekspresjon av la-7b signifikant nedregulert ekspresjonen av CYP2J2 i fire kreftcellelinjer (figur 2A). Relativ CYP2J2 ekspresjon ble kvantifisert ved densitometri (figur 2B). Som i figur S1 A og B, vestlige blotter viste doseavhengig effekt av la-7b og la-7b inhibitor på CYP2J2 protein uttrykk. På grunn av ustabilitet i Eets, bestemt vi konsentrasjonen av den stabile metabolitten 14,15-DHET i cellekulturmedier for å bekrefte inhibering av la-7b på den enzymatiske aktiviteten til CYP2J2. Resultatene viste at 14,15-DHET nivåer ble betydelig redusert ved transfeksjon av la-7b (figur 2C). Disse dataene viste at menneskelig CYP2J2 er direkte nedregulert av la-7b.
A, protein nivå av CYP2J2. HeLa, Tca-8113, MDA-MB-435 og SK-MES-1-cellene ble behandlet med la-7b eller tilfeldig la-7b (100 nM) i 48 timer. Proteininnholdet av CYP2J2 ble undersøkt ved western blot-analyse. B, proteinnivået av CYP2J2 ble kvantifisert ved densitometri. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
0,05. C, stabil metabolitt-14, 15-DHET i HeLa, Tca-8113, og MDA-MB-435-celler ble bestemt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Celler behandlet med eksogen HSA-la-7b produsert færre Eets enn de som ble behandlet med tilfeldig la-7b. Points, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
. 0,05
La-7b Reduserer kreftcellevekst og induserer apoptose ved Direkte Downregulating CYP2J2
Vi har tidligere rapportert at CYP2J2 stimulerer spredning av carcinoma celler og beskytter humane karsinomceller fra apoptose [10]; så var det av interesse å evaluere effekten av overekspresjon av la-7b på celleproliferasjon og apoptose når endogene CYP2J2 ble hemmet av la-7b. Vi behandlet HeLa, Tca-8113, SK-MES-en, og MDA-MB-435 celler med eksogent la-7b eller tilfeldig la-7b i 48 timer. Formeringshastigheten ble bestemt via Cell-Light ™ EDU DNA Cell Proliferation Kit (Ribobio, Kina). Resultatene viste en signifikant inhibering av celleproliferasjon ved la-7b. For eksempel, i MDA-MB-435 og SK-MES-1-celler, la-7b redusert celleproliferasjon med 50% sammenlignet med negativ kontroll og tilfeldig la-7b (figur 3A). Apoptose, målt ved hjelp av Annexin V og propidiumjodidfarging, betydelig øket i celler transfektert med la-7b (figur 3B). I tillegg vil redusert eksogen la-7b prosentandelen av EDU-positive celler og øket de apoptotiske celler i HeLa og Tca-8113-celler (figur 3C og D). For å gi ytterligere bevis på at effekten av la-7b uttrykk på celleproliferasjon og apoptose var knyttet til CYP2J2, celler transfektert med let-7b ble behandlet med C26 (10 mm) (spesifikk CYP2J2 hemmer [12]) og 14,15-EET (250 nM) i 48 timer. For å minimere reduksjon i nivåene av 14,15-EET på grunn av autooksidasjon, ble celler stimulert med 14,15-EET eller et tilsvarende volum av bærer (DMSO) hver 6. time. Som forventet, effekter av la-7b uttrykk på celleproliferasjon og apoptose ble forsterket av C26 og avskaffet ved 14,15-EET (Figur 3E og F). I tillegg, for å bestemme hvorvidt la-7b behandling påvirke cellevekst av H9c2 (H9c2-celler har
CYP2J2
) brukte vi Cell-Lys ™ EDU DNA Cell Proliferation Kit og Annexin V og propidiumjodidfarging å måle den celleproliferasjon og apoptose av H9c2-celler. Som vist i fig S2A og B, ikke bare celleproliferasjon, men også celle apoptose av H9c2-celler ble ikke påvirket av la-7b eller 7b la-inhibitor behandling. Disse data antydet at overekspresjon av la-7b resulterte i redusert spredning og aktivert apoptose av carcinoma cellelinjer.
A, spredning analysen via Cell-Light ™ Edu DNA Cell Proliferation Kit viste nedsatt formeringshastigheten av MDA-MB- 435 og SK-MES-1-celler behandlet med la-7b sammenlignet med celler behandlet med tilfeldig la-7b eller kontroll. De blå-farget celler ble farget av Hoechst, og den røde ble Edu-tillegget celler. EDU-positive celler ble beregnet som (Edu-tillegget celler /Hoechst-fargede celler) × 100%. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
0,05. B, prosentandel av apoptotiske celler ble økt i MDA-MB-435 og SK-MES-1 celler behandlet med la-7b. Apoptose målt ved hjelp av annexin V-FITC (x-aksen) og propidiumjodidfarging (y-aksen). Prosenter av apoptotiske celler (prosentandel av celler i øvre høyre kvadrant (annexin V-positive, PI-negative) pluss celler i lav-høyre kvadrant (annexin V-positive, PI-positive) totalt celle nummer) er gitt i henhold den aktuelle grafen. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
0,05. C-D, prosenter av Edu-positive celler og apoptotiske celler ble analysert i HeLa og Tca-8113 celler transfektert med la-7b eller tilfeldig la-7b. E-F, MDA-MB-435 og SK-MES-1-celler transfektert med la-7b ble behandlet med C26 (spesifikk CYP2J2 inhibitor, 10 uM) eller 14,15-EET (250 nM). 48 timer senere ble prosenter av Edu-positive celler og apoptotiske celler analysert. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
0,05. G, la-7b overekspresjon påvirket ekspresjon av tumor-relaterte gener i MDA-MB-35-celler. La-7b overekspresjon i MDA-MB-435 celler betydelig nedregulert PI3K, Pakt, og perk men økte Bax og nm-23 uttrykk. Dataene som vises ble gjentatt tre ganger.
Vi har også undersøkt påvirkning av la-7b på uttrykk for proapoptotiske protein Bax og antimetastatic protein nm-23 og aktivering av PI3K /Akt og MAPK signal trasé, som spiller viktige roller i P450 epoxygenase- og EET-mediert tumorigenesis og metastasering [10], [11], [12]. Vi fant ut at la-7b overekspresjon i MDA-MB-435 celler signifikant nedregulert den PI3K, Pakt, perk trasé men økt Bax og nm-23 uttrykk (figur 3G). Lignende resultater ble også observert i MDA-MB-435-celle som ble behandlet med la-7b agomir (figur S1C og D). Men la-7b påvirket ikke PI3K, Pakt, og Bax av H9c2 celler (figur S2C). Vi spekulert i at dette er fordi H9c2 cellene ikke har
CYP2J2
. Resultatene indikerte at forsterke effekten av CYP2J2 på tumordannelse kan dempes ved å la-7b.
Expression Nivå CYP2J2 Protein og la-7b i Human lungekreft og i tilstøtende normalt vev er omvendt korrelert
for å undersøke en sammenheng mellom la-7b nivå og uttrykk for CYP2J2 i menneskelige karsinomer, uttrykk for CYP2J2 protein og la-7b i 18 paret menneskelige lunge plateepitel kreft vev og tilstøtende nontumor vev ble undersøkt ved western blot analyse og real -Tid RT-PCR, henholdsvis. Resultatene viste at CYP2J2 ble sterkt uttrykt i de fleste kreft vevsprøver sammenlignet med tilstøtende normale vev (Figur 4A). Sanntids RT-PCR ble benyttet for å bestemme de modne la-7b nivåer i 18 sammenkoblede human lunge squamous cancervev og tilstøtende nontumor vev. Selv om endringer i -ΔΔCT verdier [- (ΔCT
ikke-svulstvev-ΔCT
kreftvev)] var relativt milde (fra -1,85 til 5,4, 2,6 ± 1,27), fold endring (2
– ΔΔCT) av la-7b uttrykk mellom 18 parede human lunge plateepitel kreft vev og tilstøtende nontumor vev var signifikant (0,277 til 42,22, 6,06 ± 2,43). Følgelig, viste resultatene at nivåene av modne la-7b ble betydelig redusert i 14 lungesvulster sammenlignet med sine matchede kontroller blant 18 analyserte prøvene (figur 4B). Vi neste undersøkt en sammenheng mellom la-7b uttrykk nivå og CYP2J2 protein nivået i menneskelig lunge plateepitelkreft kreft vev. Og det er statistisk signifikant invers korrelasjon mellom la-7b uttrykk nivå og CYP2J2 protein nivå i 18 sett med lunge squamous svulster kreft og sammenkoblede tilstøtende nontumor vev (Figur 4C). Videre fant vi at CYP2J2 hadde inverse uttrykk nivåer å la 7b i fire sammenkoblede menneskelig brystkreft og tilstøtende nontumor vev (Figur 4D og E). Og la-7b ekspresjon i SK-MES-1, og MDA-MB-435-celler ble vist i figur S3.
A, uttrykk nivåer av CYP2J2 i lungecancer (C) og tilstøtende vev nontumor (N) var målt ved Western blot-analyse. B, sammenligning mellom uttrykket nivåer av la-7b i lunge kreft og tilstøtende nontumor vev (n = 18). Selv om endringer i -ΔΔCT verdier [- (ΔCT
ikke-svulstvev-ΔCT
kreftvev)] er relativt mild (fra -1,85 til 5,4, 2,6 ± 1,27), brette endringer la-7b uttrykk mellom 18 sammenkoblede human lunge plateepitel kreft og tilstøtende nontumor vev er signifikant (0,277 til 42,22, 6,06 ± 2,43). C, forholdet mellom CYP2J2 protein og la-7b uttrykk i lungekreft og sammenkoblede tilstøtende nontumor vev. Expression nivå av CYP2J2 protein ble økt i 13 av 18 sett med lungekreft sammenlignet med de tilstøtende normalt vev (fold endrings 1). Som forventet, ble la-7b nivåer som vanligvis redusert i disse tumorene sammenlignet med de tilstøtende normale vev (folden endring mindre enn 1). D-E, uttrykk nivåer av CYP2J2 og la-7b i bryst kreft og tilstøtende nontumor vev (n = 4). Sanntids RT-PCR ble benyttet for å bestemme modne la-7B nivåer. U6 snRNA Ekspresjonsnivået ble anvendt for å normalisere de relative la-7b nivå. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
. 0,05
La-7b-mediert knockdown av CYP2J2 hemmer tumorvekst og metastase
Videre har vi undersøkt påvirkning av brev 7b på tumorvekst i en in vivo modell. For å generere en tumor xenograft modell, 2 x 10
6 MDA-MB-435-celler ble injisert subkutant i høyre flanke i nakne mus. To uker etter injeksjon, når tumorene hadde vokst til omtrent 40 mm
3, la-7b ekspresjonsvektor pSilencer-la-7b ble injisert i mus i en dose på 4 mg /kg kroppsvekt via halevenen hver 3. uke. Som forventet, mus injisert med pSilencer-la-7b via halevenen viste en signifikant reduksjon i tumorvolum sammenlignet med kontroller (figur 5A). I løpet av behandlingsperioden, bestemt vi 14,15-DHET nivå i urinen hos nakne mus og funnet en signifikant reduksjon i 14,15-DHET i la-7b behandlingsgruppe sammenlignet med kontrollene (figur 5B). Ved slutten av behandlingsperioden, la-7b resulterte i betydelig redusert tumorvekt, men kroppsvekt hadde ikke endret (figur 5C). Vi behandlet også MDA-MB-435 celle med la-7b agomir (150 nM) eller agomir kontroll i 48 timer, og deretter injisert disse cellene inn i den høyre flanken til nakne mus. Etter 4 uker ble obduksjon, og alle tumorer pr mus ble veid. La-7b agomir resulterte i betydelig redusert tumorvekt (figur S4). Videre ble nivået av modne la-7b validert av real-time RT-PCR; Resultatene viste at pSilencer-la-7b behandling resulterte i en betydelig økning i både tumor og organer (figur 5D og E). Western blot analyse viste en markant redusert uttrykk nivå av CYP2J2 protein og en betydelig økt uttrykk nivå av proapoptotiske protein Bax og antimetastatic protein nm-23 i la-7b-behandlede mus sammenlignet med kontroller (Figur 5F). Disse resultater antyder at la-7b kan hemme ekspresjonen og tumor-fremmende funksjoner av CYP2J2.
MDA-MB-435-celler ble injisert subkutant i høyre flanke på nakne mus for å generere musemodell for brystkreft. To uker senere mottok musene utleid-7b behandling tilfeldig. Den la-7b ekspresjonsvektor (pSilencer-la-7b plasmid) ble injisert i mus via en halevene i en dose på 4 mg /kg kroppsvekt hver 3. uke. A, x-aksen ble merket som dagene av pSilencer-la-7b behandling. Tumor volum ble målt ukentlig og beregnes som TV (mm
3) = lengde × bredde
2 × 0,5236. B, måling av 14,15-DHET nivå i nakne mus urin ble utført ved hjelp av ELISA i henhold til produsentens instruksjoner. Points, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
0,05. C, gjennomsnittlig tumorvekt og kroppsvekt av kontroll og la-7b behandlingsgruppene etter vekst i 8 uker. Kolonner, mener; barer, SD. *,
P
0,05 versus kontroll. D-E, et uttrykk for den modne la-7b i svulstene og primære organer ble validert ved real-time RT-PCR. Kolonner, mener tre eksperimenter; barer, SD. *,
P
0,05. F, Western blot analyse viste endring av uttrykket nivået av CYP2J2 protein og kreftrelaterte gener av tumorprøver.
Videre har vi vurdert om overekspresjon av la-7b påvirket metastasering. Ved slutten av eksperimentet ble miltene tatt ut og skåret opp vertikalt for å telle metastatiske tumorkolonier. Metastaser i lengdesnitt av milten var synlige for det blotte øye som knuter. Vi har observert en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig antall miltmetastaser i mus injisert med pSilencer-la-7b sammenlignet med kontroller (figur 6A). Vi har også bestemt av omfanget av lymfeknutemetastase ved å måle vekten av lymfeknuter. Vi har funnet at injeksjon av pSilencer-la-7b gjennom halevenen reduseres den gjennomsnittlige vekten av aksillær lymfeknuter (figur 6B). Videre histologisk analyse etter hematoxylin og eosin farging av parafinsnitt viste en markert forskjell mellom atymiske mus behandlet med la-7b og kontroller (figur 6C og D): la-7b behandling forårsaket en signifikant økning i forekomsten av nekrotiske områder i tumor og milt. Sammenlignet med kontrollgruppen, metastasene focis var mindre og færre i deler av milt av la-7b behandlingsgruppe. Videre TUNEL-farging av seksjoner viste at la-7b behandling resulterte i en signifikant økning i TUNEL-positive celler i tumorer og i mus milten (figur 6E og F). Disse data indikerer at la-7b behandling kan hemme tumormetastase.
A, gjennomsnittlig antall miltmetastaser for hver gruppe (n = 6). Kolonner, mener; barer, SD. *,
P
0,05 versus kontroll. B, snittvekt på axillaris lymfeknuter for hver gruppe. Kolonner, mener; barer, SD. *,
P
0,05 versus kontroll. C-D, hematoxylin og eosin farging av deler av tumor (C1, C2) og milt (D1, D2). E-F, TUNEL farging av tumor (E1, E2) og milt (F1, F2) seksjoner.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist en ny mekanisme for kontrollere tumor-promotion funksjon av CYP2J2. Bioinformatikk analyse spådd at la-7b er en potensiell regulator av
CYP2J2
genet. Bruke CYP2J2-uttrykk kreft cellelinjer og en svulst xenografs modell, har vi vist at menneskelig
CYP2J2
er posttranscriptionally regulert av la-7b og at posttranskripsjonelt reguleringen er ansvarlig for tumor-promotion funksjon av CYP2J2. Videre er det i human lunge-skvamøs kreft og tilstøtende nontumor vev, observerte vi en omvendt forhold mellom la-7B og CYP2J2 ekspresjonsnivåene.
Det har vist seg at microRNAs regulere ekspresjonen av målgener ved å bindes til de komplementære regioner av den 3’UTR av deres målgener [26], men om hSA-la-7b regulerer human CYP2J2 uttrykk er ikke kjent. Tidligere studie har vist at la-7 regulerer RAS gjennom sin 3’UTR [27]. I den foreliggende undersøkelse, luciferase analyser viste at la-7b trykt aktiviteten av reporter konstruksjon inneholdende 3’UTR-regionen i CYP2J2 mRNA. Transfeksjon av karsinom cellelinjer med la-7b og injeksjon av pSilencer-la-7b produsere modne la-7b in vivo redusert CYP2J2 protein uttrykk og enzymatisk aktivitet, noe som tyder på at
CYP2J2
er posttranscriptionally negativt regulert av la-7b.
Nyere studier har vist at la-7 kan fungere som en tumor suppressor og at redusert la-7 nivå resultater i skuffelse 7-responsive genet (cyklinD, RAS, mYC, etc.) overekspresjon i tumorer [22 ], [23], [24], [25]. Med western blot analyse og sanntids RT-PCR, viste vi høyere ekspresjon av CYP2J2 protein og lavere ekspresjon av la-7b i 18 sammenkoblede human lunge squamous cancervev i forhold til de tilstøtende nontumor vev. Således kan høy ekspresjon av CYP2J2 protein i kreftvevet et resultat av redusert ekspresjon av la-7b, i det minste delvis. Selvfølgelig, er det sannsynlig at en annen mekanisme (r) er involvert i regulering CYP2J2 uttrykk. Vår tidligere studie viste at overekspresjon av CYP2J2 eller additing eksogene Eets redusert apoptose og øket celleproliferasjon i kreftcellelinjer og økt tumorvekst og lungemetastase i en murin xenograft modell [10]. Videre har vi nylig funnet ut at Forbindelse 26, selektiv hemmer av CYP2J2, betydelig undertrykt svulsten-promotion funksjon CYP2J2 [12].
I denne studien har vi beskrevet en ny mekanisme for undertrykkelse av CYP2J2. Vi behandlet carcinoma cellelinjer med la-7b og funnet at overekspresjon av la-7b resulterte i redusert proliferasjon og aktivert apoptose av kreftceller. Vi fant også at pSilencer-la-7b behandling betydelig hemmet tumorvekst i en svulst xenograft modell. Selv om nedregulering av CYP2J2 ved pSilencer-la-7b resulterte ikke i utrydding av tumorer, omvendt korrelasjon mellom ekspresjonsnivået av CYP2J2 og la-7b i humant kreftvev og effektiviteten av å hemme tumorfremmende funksjon av CYP2J2 avslørte potensiell terapeutisk nytte av la-7b i humane kreftformer.
i vår forrige undersøkelse, rapporterte vi at Eets beskytte endotelceller fra apoptose ved å aktivere phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og MAPK signalveier [25] . I denne studien, overekspresjon av utleid-7b trykkes uttrykk for CYP2J2 protein og dets EET produkter in vitro og in vivo. Vi har også funnet at la-7b kunne hemme proliferasjon og øke apoptose av humane tumorceller ved å hemme PI3K /akt og MAPK signalveier og ved å aktivere proapoptotiske protein Bax og antimetastatic protein nm-23, begge av hvilke er involvert i P450 epoxygenase- og EET-mediert tumorigenesis og metastasering [10]. Våre data tyder på at effekten av CYP2J2-avledet Eets på tumordannelse ble formidlet av skuffelse 7b. De 11 medlemmer av la-7 familien har lignende målgener og funksjoner på celleproliferasjon grunn av den høye likhetstrekk mellom deres sekvenser [23], [28]. I denne studien har vi fokusert på effekten av utleid-7b på uttrykk for CYP2J2. Effekter av de andre medlemmene av la-7 familie på CYP2J2 uttrykk og kreftcelle spredning trenger videre studier.
I konklusjonen, bekreftet våre data som la-7b uttrykk er ofte redusert i lunge plateepitelkreft kreft. Arbeidet viste også at human CYP2J2 er posttranscriptionally regulert av la-7b, noe som resulterer i høy ekspresjon av CYP2J2 protein i humane karsinomer. Vår studie viste en ny mekanisme der CYP2J2- og EET-mediert tumorigenesis og metastasering er assosiert med skuffelse 7b. Foruten MYC og RAS, la-7b kan fungere som en tumor suppressor ved å blokkere CYP2J2.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av Review Board of Tongji Hospital og Tongji Medical College. De rekrutterte fagene som tilbys skriftlig informert samtykke. Undersøkelsen er i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Alle dyr eksperimentelle protokoller holdt med «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr» utgitt av USAs National Institutes of Health.
Cellelinjer
Den menneskelige cervix adenokarsinom cellelinje HeLa, human hepatoma levercellelinje HepG2, human tunge karsinomer Tca-8113, og human lunge-skvamøs kreftcellelinje SK-MES-1 ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, California) med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2 ved konstant fuktighet. MDA-MB-435 human brystcarcinoma cellelinje ble også erholdt fra American Type Culture Collection og ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og holdt ved 37 ° C i 95% luft /5% CO
2 .
mikroRNA Target Tippe
RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/rnahybrid_submit) ble brukt for miRNA mål prediksjon. Vi fant fire potensielle målse (site jeg, site III, site IV, og stedet VI) i 3’UTR av menneskelig CYP2J2 for la-7b. I tillegg har vi også sammenlignet utleid-7b sekvens til full lengde sekvens av CYP2J2-3’UTR med DNAMAN programvare (LynnonBiosoft, Quebec, Canada). Vi fant også en annen to potensielle bingding nettsteder (språk II og nettstedet V), i tillegg til de fire potensielle målse tidligere beskrevet (figur 1A).
Plasmid Construction
Den fulle lengde sekvens av menneskelig CYP2J2 -3? UTR ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerne 5′-GCGACTAGTGTATCACCATTTCCCCAGTCAGTCA-3 «(CYP2J2-3’UTR danner primer) og 5′-GCGAAGCTTCATGGGAATAAGTGTCTGATGGAGG-3» (CYP2J2-3’UTR-revers primer). barer, SD. barer, SD. Kolonner, mener; barer, SD.
