Abstract
Økt ekspresjon av Bcl-xL i kreft har vist seg å gi resistens mot et bredt spekter av apoptotiske stimuli og for å modulere en rekke andre aspekter av cellulær fysiologi, inkludert energimetabolisme, cellesyklus, autofagi, mitokondrie fisjon /fusjon og cellulær vedheft. Men bare noen få av disse aktivitetene har en mekanistisk forklaring. Her har vi brukt Tandem Affinity rensing for å identifisere nye BCL-XL samspill proteiner som kan forklare de pleiotrope effekter av BCL-XL overekspresjon. Blant de flere proteiner co-rensing med BCL-XL, vi fokusert på Praf2, et protein med en anslått rolle i menneskehandel. Interaksjonen mellom Praf2 med Bcl-xL ble funnet å være avhengig av det transmembrane domenet av Bcl-xL. Vi fant ut at BCL-2 samhandler også med Praf2 og at BCL-XL og BCL-2 kan samhandle også med Arl6IP5, en homolog av Praf2. Interessant, overekspresjon av Praf2 resulterer i translokasjon av Bax til mitokondrier og induksjonen av apoptotisk celledød. Praf2 avhengig celledød hindres av ko-transfeksjon av Bcl-xL, men ikke ved dens transmembrandomenet er slettet mutant. Følgelig knock-down av Praf2 øker clonogenicity av U2OS celler etter etoposid behandling ved å redusere celledød. I konklusjonen en skjerm for BCL-XL-samspill membran proteiner la oss identifisere en roman proapoptotiske protein hvis virksomhet er sterkt motvirket utelukkende av membran målrettet BCL-xL
Citation. Vento MT, Zazzu V, Loffreda A, Cross JR, nedover J, Stoppelli MP, et al. (2010) Praf2 er en roman BCL-XL /BCL-2 samspill Protein med evnen til å modulere overlevelse av kreftceller. PLoS ONE 5 (12): e15636. doi: 10,1371 /journal.pone.0015636
Redaktør: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil
mottatt: 9. september 2010. Godkjent: 18 november 2010; Publisert: 20.12.2010
Copyright: © 2010 Vento et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Foreningen for internasjonale kreftforskning, Grant Ref .: 05-0416 (https://www.aicr.org.uk/index.stm) og European Science Foundation (ESF), Eurocore Network on Membrane Architecture og Dynamics, Contract n.LSHC-CT-2003-503297, til MPS Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ervervet evne til å unnslippe apoptose kreves ved flere trinn under kreftutvikling. Over-ekspresjon av Bcl-xL-protein er kjent for å gi resistens mot et bredt spekter av potensielt apoptotiske stimuli som oppstår i løpet av utviklingen av kreft, slik som onkogen aktivering, hypoksi og matrise løsgjøring [1] – [3]. Nedsatt apoptose på grunn av over-uttrykk for BCL-XL-genet er derfor viktig ved kreft progresjon. Nedsatt apoptose er også en stor barriere for effektiv kreftbehandling, fordi cytotoksiske behandlingsformer for kreft sterkt avhengige av induksjon av apoptose. Interessant nok har Bcl-xL blitt foreslått å spille en unik rolle i generell resistens overfor cytotoksiske midler, på grunn av en slående sammenheng mellom økt Bcl-xL ekspresjonsnivået og motstand mot et stort panel av standard kjemoterapimidler. BCL-xL sin virkningsmekanisme er derfor en viktig komponent i chemoresistance i kreftceller [4]. BCL-XL tilhører BCL-2 familie av proteiner hvis medlemmer kan ha enten anti-apoptotisk eller pro-apoptotiske funksjoner. Apoptosiske medlemmer av Bcl-2-familien kan deles i to undergrupper. De såkalte multidomain faktorer (Bax og Bak) er proteiner som deler mer enn en Bcl-2 Homologi (BH) domene. Den andre underfamilien består av proteiner som deler bare BH3 domene. Et bilde har dukket opp noe som tyder på at «BH3 bare» proteiner har forskjellige mekanismer for regulering og er målrettet sensorer av ulike kilder til stress i cellene. Deres primære funksjon synes å være den binding og nøytralisering av anti-apoptotiske Bcl-2-familie Members [5], selv om noen av dem har også blitt rapportert å være i stand til å direkte aktivere multidomain proapoptotiske familiemedlemmer [6], [7]. Det er derfor allment akseptert at forhøyede Bcl-xL proteinnivået blir lavere følsomhet overfor apoptose, fordi det øker den cellulære potensial for å inaktivere pro-apoptotiske «BH3 bare» proteiner [8].
I tillegg til sin evne til å hemme kjernen apoptotiske maskineri, Bcl-xL er blitt vist å modulere en rekke andre aspekter av cellulær fysiologi. Dets overekspresjon, for eksempel, er blitt korrelert med høy grad av tumor og økt evne til å invadere og metastasere, uavhengig av dens evne til å opprettholde overlevelse i fravær av matrisen feste [9] – [11]. BCL-XL har blitt funnet å utfylle
S.cerevisiae
gener som letter overgangen fra glycolytic til oksideringsmetabolisme [12]. BCL-XL er også i stand til å modulere kalsiumhomøostase [13], stimulere synapse formasjon [14], langsom cellecyklusprogresjonen [15], modulere autofagi [16], [17], øke mitokondrie fisjon /fusjon [18] og modulere metabolitt veksling gjennom den ytre mitokondriemembranen [19]. Noen av disse «ukonvensjonelle» BCL-XL aktiviteter kan forklares med sin evne til å samhandle med andre enn de pro-apoptotiske «bare BH3» faktorer proteiner. Bcl-xL har faktisk blitt vist å interagere med VDAC1 [20], med IP3 Receptor [21], med Beclin1 [22] og en rekke andre proteiner.
Bcl-xL er både en cytosoliske og en membrantilknyttet protein [23]. Selv om cytosolisk Bcl-xL synes å være en homodimer [24], den kvaternære struktur av membran-bundet Bcl-xL er ikke undersøkt i detalj, selv om det har blitt rapportert at det kan være engasjert i vektkompleksene med høy molekyl [25] ( Borner personlig kommunikasjon). I den foreliggende undersøkelse viser vi bevis for at Bcl-xL er faktisk del av høymolekylære komplekser og vi forsøker å gjennomføre en omfattende analyse av proteiner i stand til å binde bcl-xL ved hjelp Tandem Affinitetsrensing. Interessant, fant vi at BCL-xL samhandler med proteiner som er involvert i flere cellulære prosesser. Blant dem, den sekretoriske vei var en av de mest representerte veier. Med sikte på å validere listen over proteiner som finnes til å samhandle med BCL-XL, bestemte vi oss for å fokusere vår analyse på samspillet mellom BCL-XL og Praf2, et lite protein som tilhører prenylated Rab Akseptant familie, med en anslått rolle i ER til Golgi transport [26]. Vi viser at Praf2 induserer celledød ved apoptose ved ekspresjon og at BCL-xL motvirker Praf2 er apoptotisk aktivitet. Til slutt viser vi at Praf2 stanse i U2OS celler gjør dem mer motstandsdyktige mot apoptose indusert av cellegiften etoposid.
Resultater
For å undersøke muligheten for at BCL-XL er assosiert med membran proteiner i høy vekt komplekser molekylære, har vi brukt sukrose gradient fraksjoner av CHAPS-oppløste hele celler ekstrakter. Analysen ble utført ved hjelp av U2OS cellelinje fordi det uttrykker høye nivåer av BCL-XL og ser ut til å bli «avhengige» til BCL-xL uttrykk for overlevelse (ikke vist). Pre-klarerte celleekstrakter ble lastet på sukrosegradienter og underkastet ultrasentrifugering som beskrevet i Materialer og Metoder. Fraksjoner ble oppsamlet, løst ved hjelp av SDS-PAGE og analysert ved immunblot. Figur 1 viser at lavmolekylære proteiner som cytokrom c (12 kDa), Rab 4 (25 kDa) eller Bax (20 kDa) er til stede i fraksjoner av gradienten hvor lav-molekylvekt-proteiner antas å sedimentere. Bcl-xL, i stedet blir spredt i fraksjoner som strekker seg fra lave til høye molekylvekter. Dette resultatet tyder på at under disse forsøksbetingelsene Bcl-xL kan være engasjert i en rekke forskjellige molekylkomplekser.
sukrosegradient fraksjonering av U2OS totale celleekstrakter. U2OS (60 × 10
6 celler) ble lysert i CHAPS utvinning buffer og klarert av sentrifugering. Ekstraktene ble fraksjonert ved anvendelse av en 10-40% sukrosegradient og like volumer av fraksjonene ble analysert ved immunblot for tilstedeværelse av Bcl-xL, Bax, Rab4 og cytokrom c.
Etablering av HeLa-celler som uttrykker en TAP-BCL-xL chimera protein
for å identifisere et sett av proteiner i samspill med BCL-xL i forhold analysert, har vi gjort bruk av Tandem Affinity Rensing [27], [28]. Bcl-xL er en hale-forankret protein som overtar membranen lokalisering setter sin C-terminal hydrofob hale inn i det ytre lipid bilaget av flere membran kammere. For å unngå interferens med BCL-xL membraninnføyelse, genererte vi et uttrykk for vektor plassere en TAP tag på N-terminalen av BCL-XL. Vi har også oppnådd en kontrollvektor hvor et stoppkodon ble tilsatt nedstrøms av TAP-sekvensen. Begge konstruksjonene ble transfektert i HeLa-celler for å få kloner stabilt uttrykker enten TAP-BCL-xL eller bare TAP-stop. Vi valgte HeLa-celler, fordi de lett kan tilpasses til vekst i suspensjonskulturer, for å fremstille startmaterialet som passer for biokjemiske rensinger. I motsetning til U2OS, HeLa-celler, dessuten har et relativt lavt ekspresjonsnivå av endogent Bcl-xL (figur S1), som kan konkurrere med TAP-Bcl-xL for binding partnere. For å teste om tilsetting av TAP tag til BCL-xL kunne svekke dens evne til å beskytte mot apoptose, utfordret vi celler som uttrykker TAP-BCL-XL (HeLa /TAP-BCL-XL) eller TAP-stop (HeLa /TAP) med UV-bestråling og analysert spaltingen status av PARP, som et mål på celle kaspase 3 aktivitet. Som vist i figur 2A, sammenlignet med TAP-stopp, HeLa uttrykker TAP-Bcl-xL vises et redusert nivå av PARP spaltningsprodukt. Derfor ikke tilsetning av TAP-koden til den N-terminale ende av Bcl-xL ikke hindrer evnen til Bcl-xL for å beskytte cellene mot UV-indusert apoptose. Vi neste testet om tilsetting av TAP tag til BCL-xL kunne endre sin subcellulære fordeling. HeLa /TAP-BCL-XL celler ble fraksjonert i cytosol (S100), kjernekraft (Nuclei), tunge membraner (HMM) og lette membraner (LMM) fraksjoner av differensialsentrifugering. Subcellulære lokalisering av TAP-BCL-xL forhold til endogen BCL-xL ble analysert ved immunblot. Analysen ble utført ved å bruke ekvivalente mengder av proteiner for hver gitt fraksjon, og det er ikke informativt på relative fordelingen av proteinene analyseres i de forskjellige cellulære rom. Kvaliteten av fraksjonerings ble definert ved bruk av antistoffer mot kjente markører for subcellulære kamrene: PARP for atomfraksjonen, Sec23 for LMM fraksjonen (mikrosomer) og cytokrom c for HMM fraksjon (mitokondrier). Vi har også analysert for lokalisering av Bax, et annet medlem av Bcl-xL proteinfamilie, som er kjent for å lokalisere både på mitokondrier en i cytosol. Figur 2B viser at på samme måte som endogen BCL-XL, TAP-BCL-xL Lokaliserer til HMM brøk, til LMM og til S100 fraksjoner. Derfor ikke tilsetning av TAP merkingen ikke interferere med evnen til Bcl-xL å skaffe membran lokalisering.
(A) HeLa-celler som stabilt uttrykker TAP-merket Bcl-xL er mer motstandsdyktig enn kontroll mot UV-indusert apoptose. Analyse av PARP spalting i HeLa celler som uttrykker TAP alene eller TAP-BCL-xL og bestrålt eller ikke med UV (200 J /m
2). Celler ble oppsamlet 2 og 4 timer etter bestråling og analysert ved immunblot for utseendet av det spaltede produkt av PARP. (B) TAP-merket BCL-xL Lokaliserer til samme intracellulære rommet av endogen BCL-XL. HeLa-celler som uttrykker TAP-BCL-xL ble fraksjonert ved differensialsentrifugering for å oppnå: lane 1, cytosoliske proteiner (S100); lane 2, nukleære proteiner (kjerner); spor 3, den tunge membranfraksjonen (HMM); felt 4, lyset membranfraksjonen (LMM). 20 ug av hver fraksjon ble analysert ved immunblot for tilstedeværelse av TAP-BclxL (ved hjelp av sekundære antistoff bare) og endogene Bcl-xL. Kvaliteten av fraksjonerings ble bestemt ved anvendelse av antistoffene mot Sec23 (LMM), Cytokrom c (HMM), Bax (S100 og HMM) og PARP (kjernene). (C) HeLa celler stabilt transfektert med TAP alene eller TAP-BCL-xL ble utsatt for Tandem Affinity Rensing. Figuren viser en representativ Coomassie-farget SDS-PAGE utført under reduserende betingelser som anvendes for å løse eluatene fra rensinger. Rensinger ble utført ved hjelp av membran CHAPS utdrag fra HeLa uttrykker TAP alene (spor 1) eller HeLa uttrykker TAP-BCL-XL (kolonne 2).
Identifisering av nye BCL-XL-samspill proteiner ved hjelp Tandem Affinity rensing
for å kunne fremstille et passende utgangsmateriale for TAP-rensinger, HeLa /TAP-Bcl-xL og HeLa /TAP-celler ble tilpasset til vekst i suspensjonskultur ved hjelp av spinnglassflasker. Gitt vår interesse i membranbaserte interaksjoner vi valgte å fokusere på renselser utført ved hjelp av membran ekstrakter. Cellepelletene ble mekanisk lysert ved anvendelse av en Dounce-homogenisator i en detergent-fri hypoton buffer. Sentrifugering av den sistnevnte cellelysat mulig for oss å separere de totale membraner fra cytosoliske proteiner. Total membraner ble ekstrahert ved anvendelse av en CHAPS inneholdende buffer og underkastet tandem affinitetsrensing. Eluatene fra det siste rensetrinnet ble konsentrert og løst på SDS-PAGE. Fig. 2C viser representative bilder av TAP renselser analysert på Coomassie beiset geleer fra TAP-bare uttrykke celler (spor 1) eller TAP-BCL-xL uttrykker celler (spor 2). Lite materiale oppsto fra rensinger laget av TAP bare uttrykkende celler, noe som viser at bakgrunnen er gitt av uspesifikk adsorpsjon til det kromatografiske media som brukes er ubetydelig. Bånd tilsvarende de mest tallrike proteinarter ble skåret ut fra gelene og deres identitet ble bestemt ved LC-MS /MS. En liste over protein som finnes til co-eluer med TAP-BCL-XL er vist i tabell 1.
BCL-XL er i stand til å samhandle med proteiner som er involvert i flere cellulære prosesser
selv om listen med Bcl-xL samspill proteiner presentert i tabell 1 ikke kan tas som uttømmende, kan det betraktes som et høyt sikkerhetsnivå liste. Vi har delt alle identifiserte proteiner i ulike funksjonelle kategorier, og for hvert protein vi har spesifisert kjente eller antatte sub-cellulær lokalisering. Vi har også uttalt hvis proteinet hadde allerede tidligere blitt funnet å samhandle med BCL-XL. Det er interessant å merke seg at de fleste av anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-protein familien som tidligere er blitt beskrevet for å interagere med Bcl-xL er til stede i den endelige eluat. VDAC1 ble også allerede beskrevet for å interagere med Bcl-xL [20], mens VDAC2, en mindre rikelig isoform, har blitt vist å interagere med multidomain Bcl-2-familiemedlem Bak [29]. ATP2A2 /Serca2 stedet, har blitt rapportert til å samhandle med Bcl-2 [30]. Samlet tilstedeværelsen av disse proteinene i den endelige eluat av vår rensing som er en god indikasjon på spesifisitet av interaksjoner er funnet. Foruten de BCL-2 familiemedlemmer, satt vi sammen en gruppe proteiner som alle er mitokondrie og er funksjonelt involvert i energiomsetningen og mitokondrie fysiologi. Denne gruppen omfatter 10 av de 17 subenheter av ATP syntase multiprotein komplekse, subenheter II og IV av cytokrom c oksidase og cytokrom b5 type B, alle en del av den biokjemiske kjeden ansvarlig for oksidativ fosforylering og ATP produksjon. Det inkluderer også mitokondrisk karbamoyl-phosphate synthetase 1, som spiller en viktig rolle i å fjerne overskudd av ammoniakk fra cellen, og VDAC1 og 2, hoved regulatorer av mitokondrienes permeabilitet. I denne gruppen har vi inkludert to mer mitokondrielle proteiner identifisert som BCL-XL forbundet: Stomatin-lignende protein 2 (StomL2) og Prohibitin 2. StomL2 har nylig vist seg å være en del av et kompleks med Mitofusin 2 [31] mens Prohibitin 2 er ment for å spille en rolle i reguleringen av mitokondriell respirasjon.
et annet sett av proteiner kan bli gruppert i den funksjonelle kategorien av transportører. De er plassert på forskjellige membran avdelinger, og er: aminosyre transporter SLC3A2; cellemembranen Na + /K + ATPase-transportør ATP1A1; ER bosatt kalsium transporter ATPase ATP2A2 /Serca2; transferrin reseptor, som kan bli sett på som en atypisk transporter. En fjerde funksjonell gruppe proteiner direkte eller indirekte forbundet med Bcl-xL er sammensatt av proteiner med en antatt eller etablert rolle i den sekretoriske gren av intracellulær handel. De er komponenter av trans komplekset (Sec61 beta, Sec11A), anstand som er involvert i proteinfolding assistanse i ER (calnexin), proteiner som er involvert i ER- spesifikke proteinmodifiseringer (Ribophorin I, OST48, MPDU1) og proteiner med en antatt rolle i ER til Golgi trasport (Sec22b, erge-32, TMP21, TMED5, Praf2) samt ER oppbevaring (SSR4, KDEL reseptor 1). Andre trafficking proteiner assosiert med BCL-xL var Rab7, en liten GTPase med en rolle i slutten endosomet modning og VAMP3, et protein med en antatt rolle i endosomer resirkulering. Til slutt vi identifisert som roman Bc-XL samspill proteiner en gruppe av faktorer enten med ukjent eller svært dårlig beskrevet funksjon (tabell 1).
Validering av samspillet mellom Praf2 og BCL-xL
forholdet mellom sekretorisk grenen av intracellulær trafficking og apoptotisk celledød er langt fra å bli forstått. Blant de nylig identifiserte proteiner, har Praf2 blitt foreslått å spille en rolle i ER til Golgi transport [26]. Praf2 tilhører prenylated Rab akseptor (PRA) familie av proteiner, hvis grunnlegger, Pra1 /Rabac1, er vist å interagere med det virale Bcl-2 homolog BHRF1, og modulerer dens aktivitet [32]. For å få innsikt i forholdet mellom vesikulært transport og apoptose, bestemte vi oss for å fokusere på Praf2. Den cDNA som koder for human Praf2 ble oppnådd fra IMAGE konsortiet og klonet inn i pcDNA3 med en trippel HA kode fusjonert ved sin C-terminale ende. For å validere samspillet mellom Praf2 og BCL-XL, ble 293T celler transfektert med enten Praf2
HA og
FLAGBcl-XL ekspresjonsplasmider alene eller co-transfektert med begge plasmider. 24 timer etter transfeksjonene ble cellene lysert og Praf2 ble immunopresipitert ved anvendelse av monoklonalt anti-HA konjugert agarose. Som vist på fig. 3A,
FLAGBcl-XL var påvises i bunnfallet når co-uttrykkes med Praf2. Vi var derfor i stand til å bekrefte samspillet av BCL-xL og Praf2 også i et to-komponent system, hvor BCL-xL og Praf2 er samtidig overexpressed.
(A) HEK 293T celler ble enten transfektert med HA tagget Praf2 eller FLAG-merket BclxL eller co-transfektert med begge ekspresjonsvektorer. Prøvene ble underkastet immunoutfelling ved å bruke anti HA-konjugert agarose og begge totale lysater (input) og agarosekuler eluater (IP) ble analysert ved immunblot hjelp av anti HA og anti-FLAG monoklonale antistoffer. (B) U2OS-celler ble transfektert med HA-merket Praf2 eller tom vektor (Vec) og cellelysatene ble underkastet immunoutfelling ved å bruke HA-konjugert agarose. Begge lysatene og agarose perler ble analysert ved immunoblot hjelp av anti HA og anti BCL-XL antistoffer.
Oppdagelsen av at Praf2 co-renset med BCL-XL av Tandem Affinity Rensing viser klart at BCL-XL er stand til å samhandle med endogent Praf2 i HeLa celler. Vi har nå undersøkt om endogen BCL-XL er i stand til å samhandle med Praf2 i U2OS celler. U2OS-celler ble transfektert med enten tom vektor eller med Praf2
HA uttrykke vektoren, og lysater ble immunoprecipitaed ved anvendelse av anti HA-konjugert agarose. Som vist på fig. 3B, anti HA-konjugert agarose kan spesifikt utløse endogen BCL-XL i U2OS celler transfektert med Praf2
HA, men ikke med den tomme vektoren.
Flere medlemmer av BCL-2-familien er i stand til å samhandle med flere medlemmer av PRA familien
grunnleggeren medlem av PRA familie av proteiner, Pra1 /Rabac1, har vist seg å samhandle med viral BCL-2-homolog BHRF1, men ikke med BCL-2 selv [32] . Vi spurte derfor om bindende evne Praf2 var begrenset til BCL-xL eller kan bli utvidet til BCL-2 også. Vi spurte også om det nære homolog av Praf2, Arl6IP5, er også i stand til å samhandle med BCL-xL og /eller BCL-2. Fig. 4 viser at Praf2
HA kan samhandle også med
FLAGBcl-2 (spor 4), og også at Arl6IP5
HA kan samhandle med både
FLAGBcl-XL og
FLAGBcl-2 ( spor 5 og 6). Arl6IP5
HA uttrykk resultater i band med forskjellig elektromobilitet. Gitt at de alle immunopresipitert med anti-HA-antistoff, og gitt at det har blitt beskrevet som både Praf2 og Arl6IP5 kan gi opphav til SDS-uløselige arter [33], tror vi båndene observert tilsvarer monomerer, dimerer og multimerer av Arl6IP5 .
HEK 293 celler ble enten transfektert med FLAG-merket BclxL eller BCL-2 alene (spor 1 og 2), eller co-transfektert med HA-merket Praf2 eller HA-merket Arl6IP5 (spor 3-6) . Prøvene ble underkastet immunoutfelling ved å bruke HA-konjugert agarose og både lysater og agarosekuler ble analysert ved immunblot hjelp av anti HA og anti-FLAG-antistoffer. Arl6IP5 monomer: *; Arl6IP5 dimer: **; Arl6IP5 multimer. ***
Den transmembrane domene av BCL-XL er avgjørende for dets interaksjon med Praf2
Evnen til BCL-xL å samhandle med pro-apoptotiske medlemmer av familien Bcl-2 er kjent for å være formidlet av en hydrofob kløft dannet på overflaten av de BH1, BH2 og BH3-domener [34]. Omvendt, bindingen av Bcl-2 /xL til Raf og Ras er blitt vist å være avhengig av BH4 domenet [35], [36]. For å definere domener av Bcl-xL ansvarlig for dets interaksjon med Praf2, genererte vi en Bcl-xL mutant slettet av de første 24 aminosyrer svarende til BH4 domene (BCL-xLΔBH4). Vi har også generert en Bcl-xL mutant hvori tyrosin-101 ble erstattet med et lysin (BCL-xLY101K) (Fig. 5A), en mutasjon som har blitt beskrevet avskaffe Bcl-xL evne til å interagere med Bax [37]. Til slutt, fordi Praf2 er et membranprotein, [33], genererte vi en Bcl-xL mutant slettet av sine C-terminale 22 aminosyrer svarende til dens transmembrandomene (BCL-xLΔTM). Som vist på fig. 5B, verken sletting av BH4 domenet eller det Y101K mutasjon påvirket BCL-xL evne til å samhandle med Praf2. Imidlertid delesjon av C-terminale transmembrane domene, fullstendig opphevet Praf2 /Bcl-xL interaksjon, noe som indikerer at TM-området er avgjørende for denne interaksjonen.
(A) Skjematisk representasjon av Bcl-xL ekspresjonskonstruksjoner brukt I denne studien. BCL-XL: full lengde BCL-xL; BCL-xLΔBH4: BCL-xL mangler de første 24 aminosyrene; BCL-xLΔTM: BCL-xL mangler de siste 22 aminosyrene; BCL-xLY101K: BCL-XL med et bytte av Tyrosin 101 med lysin. (B) HEK 293 celler ble ko-transfektert med HA-merket Praf2 og BclxL konstruerer beskrevet i (A) som bærer et FLAG-tag ved N-terminalen. Prøvene ble utsatt for immunoutfelling, ved hjelp av HA-konjugert agarose og både lysatene og agarose perler ble analysert ved immunoblot bruke anti HA og Anti-Flag antistoffer.
Praf2 overekspresjon induserer celledød ved apoptose
det er allment akseptert at forhøyede BCL-XL protein nivåer redusere mottakelighet for apoptose ved å binde og inaktivere pro-apoptotiske proteiner [8]. Videre har det blitt rapportert at overekspresjon av Yip3p (gjær Pra1 /Rabac1 homolog) alvorlig hemmet cellevekst [38]. Vi har derfor testet om Praf2 overekspresjon kan indusere celledød, og om dette kan bli blokkert av samtidig uttrykk for BCL-XL eller BCL-xLΔTM mutant som viste seg å være i stand til å binde seg til Praf2. Jakten celler ble transfektert med vektor alene, med Praf2 eller co-transfektert med Praf2 og BCL-xL eller Praf2 og BCL-xLΔTM. Fig. 6A viser at Praf2 transfeksjon førte til en sterk induksjon av celledød, med nesten 65% av cellene blir PI positiv. Interessant Praf2 indusert celledød ble fullstendig hemmet av samtidig transfeksjon av full lengde BCL-XL, men ingen hemming ble observert når Praf2 ble transfektert med BCL-xLΔTM mutant. Videre er celledød indusert ved Praf2 ledsaget av kaspase-aktivering, som bedømt ved opptreden av det spaltede form av PARP. Igjen, dette fenomenet ble fullstendig blokkert av Bcl-xL men ikke av Bcl-xLΔTM mutant (fig. 6B). Inhibering av Praf2-indusert PARP-spaltning ble også forhindret ved samtidig ekspresjon av Bcl-2 (data ikke vist).
(A) FACS-analyse av HeLa-celler transfektert med de indikerte ekspresjonsvektorer og farget med propidium jodid ( PI). Prosenter av PI positive celler er vist på øverste venstre for hver graf. (B) Aliquoter av HeLa-celler transfektert som i (A) ble analysert ved immunblot for utseendet av det spaltede form av PARP. Expression nivåer av Praf2, BCL-xL og BCL-xLΔTM er også indikert. (C) Analyse av GFP-Bax lokalisering i U2OS celler transfektert med tom vektor (vec) eller HA-merket Praf2. Fotografiene er representative for de to viktigste GFP-Bax lokaliseringer observert i prøvene: diffuse cytosoliske og aggregert. Over fotografiene er indikert% av GFP positive celler med et samlet lokalisering etter trans celler med tom vektor eller HA-merket Praf2 i to uavhengige forsøk.
Deretter ønsket vi å vurdere om Praf2 utløst apoptose involverte translokasjon av Bax til mitokondriene, en tidlig begivenhet i den indre apoptotiske reaksjonsvei. Vi kotransfektert derfor en GFP-Bax konstruere med Praf2 eller vektor kontroll i U2OS. Fig. 6C viser at GFP-Bax uttrykk i U2OS celler kan ha enten en diffus cytosoliske flekker, eller kan aggregeres i klynger. Vi har tidligere vist at GFP-Bax aggregering, i den samme cellelinje, var sammenfallende med mitokondriell dysfunksjon, som målt ved tap av ΔΨm [39]. Vi har anvendt et overskudd av Praf2-uttrykkende eller tomme (VEC) plasmider for å oppnå at alle celler som får GFP-Bax fikk også Praf2 og telles% av transfekterte celler med diffust eller aggregert GFP-Bax signal. Resultatet presenteres i fig. 6C viser at Praf2 kotransfeksjonen var assosiert med mer enn 30% av cellene viser en GFP-Bax aggregert farging, gjelder bare 2% observert i tom-vektor co-tansfected celler.
Knock-down av Praf2 øker celleoverlevelses
Vi ønsket ved å definere om reduksjon av Praf2 uttrykk av RNA-interferens kan også påvirke cellular levedyktighet. Den osteosarcom cellelinjen U2OS uttrykker relativt høye nivåer av Praf2. Vi banket ned Praf2 uttrykk i U2OS celler ved hjelp av to ulike siRNAs rettet mot ulike deler av menneske Praf2 mRNA. Western blot-analyse av Praf2 viser en sterk nedgang i Praf2 uttrykk med hensyn til kontroll-transfekterte celler (Fig. 7A). Ingen åpenbare morfologiske forskjell var merkbar mellom kontroll og Praf2 knock-down-celler 72 timer etter transfeksjon i normale vekstbetingelser. Vi spurte derfor om Praf2 lyddemping kan påvirke cellular følsomhet for den toksiske effekten av et kjemoterapeutisk middel som etoposid. Som vist på fig. 7B stanse av Praf2 med både sirnas valgt resulterte i en reduksjon på mer enn 50% i caspaseaktivering i forhold til kontroll transfekterte celler. Følgelig clonogenicity av U2OS celler behandlet med etoposid økt fra under 20% av Ctrl transfekterte celler til nesten 60% i Praf2 forstummet celler (Fig. 7C). Nedgangen i caspaseaktivering observert etter Praf2 RNAi var ikke apoptotiske stimulus-spesifikke eller celletype-spesifikk, da det var tydelig også i U2OS celler behandlet med paklitaxel eller doksorubicin (fig. S2A) og i brystkreftcellelinjen MDA-MB 231 behandlet med etoposid (fig. S2B).
(A) Analyse av immunoblot av effekt av Praf2 slå ned etter transfeksjon av U2OS celler med to ulike siRNAs rettet mot Praf2 mRNA. (B) U2OS celler transfektert med kontroll (Ctrl) eller Praf2 målretting sirnas (siRNA5 og siRNA6) etter 48 timer ble behandlet med 50 mikrometer etoposid i 24 timer. Cellular caspase 3 og 7 aktiviteter ble målt ved hjelp av caspase-Glo 3/7 luminometric analysen. Grafen viser prosentandelen av caspase 3 og 7 aktivering i prøvene behandlet med den Praf2 målretting sirnas sammenlignet med aktiviteten som er tilstede i celler transfektert med styre siRNA i 3 uavhengige eksperimenter. (C) Clonogenicity av U2OS celler transfektert med kontroll eller Praf2 målretting sirnas og behandlet eller ikke med etoposid. 48 timer etter transfeksjon av celler med U2OS kontroll siRNA eller Praf2 siRNA6, ble cellene behandlet med 50 uM etoposid i 3 timer og enn forskyves igjen til normal medium i 2 uker. Koloniene ble farget ved hjelp av krystallfiolett. Grafen viser prosent kolonier dyrkes etter etoposid behandling i forhold til den ubehandlede kontroll.
diskusjon
Bcl-xL er en C-hale forankret protein med evnen til å lokalisere på flere intracellulære membraner. For å ha et stort bilde av settet av membranproteiner som samvirker med Bcl-xL, utførte vi Tandem Affinitetsrensing av totale cellulære membraner av HeLa-celler som stabilt uttrykker TAP-merket Bcl-xL. Gitt at ikke-ioniske vaskemidler som Triton-100 eller NP-40 er kjent for å endre konformasjonen av proteiner av familien Bcl-2 [23], ble alle eksperimentene utført i nærvær av CHAPS, et vaskemiddel som forlater konformasjon av Bcl-xL uendret. Som angitt i tabell 1, fant vi mange proteiner co-rensing med TAP-BCL-XL. De er imidlertid sannsynlig å reflektere ekte protein-protein interaksjoner av minst to grunner. Først av alt, som vist i felt 1 på fig. 2C, renselser fra samme cellelinje bærer en TAP-tag-bare konstruere gjenopprette nesten ikke målbare proteiner, noe som tyder på at alle gjen proteiner er faktisk knyttet til BCL-XL. For det andre, som omtalt nedenfor, ved hjelp av denne fremgangsmåten har vi funnet ko-eluering med Bcl-xL mange proteiner er kjent for å være i stand til spesifikt å interagere med Bcl-xL. Vi har inndelt listen over proteiner som finnes til å samhandle med BCL-xL inn de funksjonelle kategoriene diskutert her. Det er verdt å legge merke til at alle proteiner som finnes er enten trans-membran proteiner eller løselige proteiner lokalisert i intracellulære organeller. De fleste av dem lokalisere til sub-cellulære avdelinger kjent for å være målrettet av BCL-XL. Mange av dem er flere komponenter av protein komplekser. Disse observasjonene utgjør en god indikasjon på gyldigheten av fremgangsmåten som brukes og av spesifisiteten og sensitiviteten til den teknikk som brukes. Vi kan derfor trekke den konklusjon at BCL-XL kan være engasjert i flere forskjellige protein komplekser på flere sub-cellulære nettsteder. Denne konklusjonen er videre støttet av den sukrose-gradient fraksjoneringsdata er presentert i fig.
