Abstract
Formål
Analysen av
MET
genkopitallet (CN) har vært ansett for å være en potensiell biomarkør for å forutsi respons på MET-målrettet terapi i ulike kreftformer. Men dagens standardmetoder for å bestemme
MET
CN er SNP 6,0 i genomisk DNA av kreft cellelinjer og fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) i tumormodeller, henholdsvis, som er kostbare og krever avansert tekniske ferdigheter og resultat i relativt subjektive vurderinger. Derfor har vi ansatt en ny metode, dråpe digital PCR (ddPCR), for å fastslå
MET
genkopitallet med høy nøyaktighet og presisjon.
Metoder
genomisk DNA av kreft cellelinjer eller tumormodeller ble testet og sammenlignet med
MET
genet CN og
MET /CEN-7
forholdet bestemmes av SNP 6,0 og fisk, henholdsvis.
resultater
i cellelinjer, den lineære sammenslutning av
MET
CN oppdaget av ddPCR og SNP 6.0 er sterk (Pearson korrelasjon = 0,867). I tumormodeller,
MET
CN oppdaget av ddPCR var signifikant forskjellig mellom
MET
genamplifisering og ikke-forsterkning grupper etter FISH (gjennomsnitt: 15,4 vs 2,1;
P
= 0,044). Gitt at
er MET
genamplifisering definert som
MET
CN 5.5 av ddPCR, den samstemmighet mellom ddPCR og FISH var 98,0%, og Cohens kappa koeffisient var 0,760 (95% CI, 0,498 til 1,000;
P
. 0,001)
Konklusjoner
resultatene viste at ddPCR metoden har potensial til å kvantifisere
MET
genet kopiantall med høy presisjon og nøyaktighet sammenlignet med resultatene fra SNP 6,0 og fisk i kreftcellelinjer og tumorprøver, henholdsvis
Citation. Zhang Y, Tang ET, Du Z (2016) Påvisning av
MET
genkopitallet i Kreft Prøver Bruke Droplet Digital PCR metode. PLoS ONE 11 (1): e0146784. doi: 10,1371 /journal.pone.0146784
Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES
mottatt: 18 september 2015; Godkjent: 22 desember 2015; Publisert: 14 januar 2016
Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Amgen Inc. Alle forfatterne er ansatte i Amgen Inc. Funder gitt støtte i form av lønn for YZ, ET, og ZD, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er artikulert i forfatterens Bidrag delen
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er ansatte i Amgen Inc. Dette kommersiell tilknytning endret ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer .
Innledning
i normale fysiologiske funksjoner, er MET uttrykt i celler av epitelial opprinnelse, hvor det spiller en viktig rolle i cellevekst og homeostase [1]. Imidlertid har avvikende MET signale blitt observert i flere humane kreftformer, inkludert lever- og magekreft [2-6].
MET
genamplifisering er blitt rapportert å være korrelert med dårlig prognose i pasienter med GC [7-9] og kan brukes som en potensiell biomarkør for å estimere sykdomsprognosen eller logisk respons på MET-inhibitorer i kliniske forsøk. Derfor er det viktig å utvikle et nøyaktig og optimalisert plattform for å bestemme
MET
genkopitallet før MET-rettet terapi. I rutinemessige undersøkelser, SNP 6,0 og FISH er standard metoder for å evaluere
MET
kopi antall kreftcellelinjer
in vitro Kjøpe og tumorprøver
in vivo
, henholdsvis. Men disse metodene har mange begrensninger, inkludert avanserte tekniske ferdigheter som kreves for høye kostnader og behov for erfarne eksperter til å analysere tumorprøver, noe som resulterer i varierende resultater mellom laboratorier. For eksempel er FISH-analyse utføres vanligvis på formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) vev, noe som krever en rekke kompliserte prosesser, for eksempel fiksering og farging immunhistokjemi, og kan føre til genomisk DNA-skade og brudd. Disse problemene øker sannsynligheten for falske negative resultater på grunn av den lave kvalitet og kvantitet av DNA. Derfor er påvisning av genet presiseringer utfordrende på grunn av lav følsomhet av disse metodene.
dråpe digital PCR (ddPCR) er en metode som absolutt kan kvantifisere
MET
kopiere nummeret uten behov for standardkurver. I et typisk digitalt PCR, blir prøven tilfeldig fordelt til adskilte skillevegger slik at noen inneholder ingen nukleinsyretemplat og andre inneholder en eller flere kopier mal. Skilleveggene er PCR amplifisert til sluttpunktet, og deretter leses ved hjelp av en dråpe leser for å bestemme fraksjonen av positive skillevegger basert på fluorescens amplitude, hvorfra den absolutte konsentrasjonen av target eller referanse DNA blir beregnet statistisk ved modellering som en Poisson-fordeling. Derfor er ddPCR et endepunkt måling som gjør det mulig å kvantifisere nukleinsyrer uten behov for standardkurver, eksterne kalibratorer og endogene kontroller [10].
I denne studien har vi søkt å ansette ddPCR analyser til absolutt kvantifisere
MET
kopiantall i kreftcellelinjer og tumorprøver og sammenlignet våre resultater med de som ble oppnådd ved hjelp av SNP 6,0 og fisk for de samme prøvene.
Materialer og metoder
Cell linjer, PDX prøver, og utvinning av genomisk DNA
åtte menneskelig GC og trettiåtte HCC cellelinjer ble kjøpt fra fem organisasjoner: American Type Culture Collection (ATCC), japansk Innsamling av forsknings Bioressurser (JCRB), koreanske cellelinje Bank (KCLB), Shanghai Institute of Biological Sciences, CAS (SIBS), og Zhongshan Hospital Fudan University (ZHFU) (se tabell 1). Cellelinjene ble rutinemessig dyrket i 96-brønners plater i ATCC anbefalte vekstmedium ved 37 ° C, 5% CO
2 og 95% fuktighet. Genomisk DNA ble ekstrahert fra kreftcellelinjer med TIANampGenomic DNA Kit (Tiangen, Cat: DP304) i henhold til produsentens instruksjoner. Ett hundre og femtiseks FFPE av pasient-avledet xenograft (PDX) modeller (inkludert 116 GC og 39 HCC modeller) ble innhentet fra Shanghai LIDE Biotech Company. For de PDX modellprøver, ble genomisk DNA ekstrahert ved hjelp av DNeasy blod og vev Kit (Qiagen, Cat #: 69509) i henhold til produsentens protokoll. DNA-konsentrasjonen ble bestemt med et Nanodrop spektrofotometer (Thermo), og spaltet med HaeⅢ enzym (NEB, Cat #: R0108S) ved 37 ° C i 1 time. Den fordøyd DNA-prøven ble fortynnet 10 ganger med Autoclaved Millipore H
2o og lagret i en -20 ° C fryser.
DDPCR for bestemmelse av
MET
CN
TaqMan PCR-reaksjonsblandingen ble satt sammen i et sluttvolum på 20 pl med 2x Supermix, 20x 20x primere og prober og 20 ng av det genomiske DNA som templat. Hver reaksjonsblanding ble deretter fylt i en DG8 patron (Bio-Rad) med 70 ul av dråpe generasjon olje for å generere en liten dråpe. Dråpene fra hver brønn ble deretter overført til en 96-brønners PCR-plate. Platene ble varmeforseglet og deretter termisk syklet under følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter (en syklus); 40 PCR-sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min; og en holde ved 4 ° C. Etter PCR ble platene plassert på en QX200 dråpe leser (Bio-Rad) som analyserte dråper av hver brønn på platen og kvantifisert mål-DNA. PCR-data ble analysert ved bruk av QuantaSoft versjon 1.7.4.0917 (Bio-Rad) for å bestemme kopiantallet variasjon (CNV). Den 20x referanse analysen for AP3B1 inkludert primere målrettet mot cent loci på kromosom 5, og en probe merket med en HEX fluorescerende signal (Bio-Rad). Den 20 x CNV PCR-analyse for MET inkludert primere målrettet mot området fra intron 20-exon 21 på kromosom 7, og proben ble merket med et fluorescerende signal FAM (Life Technologies, cat # Hs02884964_cn). Hver brønn ble replikert for alle prøvene.
MET
kopiantall ble beregnet som forholdet mellom konsentrasjonene av
MET Hotell og
AP3B1 Hotell og multiplisert med to. Hver data for
MET
CN hjelp ddPCR representerer to eller tre fusjonerte tekniske replikere brønner uten mal kontroll (NTC) som en negativ kontroll.
SNP 6,0 analysen
Blant 46 cellelinjer, ble SNP 6,0 rådata til 35 av de cellelinjer som er lastet ned fra CCLE prosjekt (https://www.broadinstitute.org/ccle/home), og de rå data for de andre 11 cellelinjer ble oppsamlet under anvendelse av den Affymetrix Genome-Wide Menneskelig SNP Array 6,0 plattform, herunder BEL7402, HCCC-810, NOZ, OCUG-en, OZ, QGY7701, QGY7703, SMMC7721, SNU354, SNU368, og SNU739. Alle rådata ble behandlet ved hjelp PICNIC programvare og presenteres som
MET
eksemplarer.
MET
FISH
MET
genet forsterkning ble analysert ved FISH bruke Dako
MET /CEN-7
IQISH Probe Mix (Ruo).
CEN-7
cent sonden ble brukt som referanse kontroll, i henhold til produsentens instruksjoner. De formalinfikserte, parafininnstøpte prøver (cellepellets) ble seksjonert og deretter underkastet deparaffinization og rehydrering. H E farging ble utført først. Varmen Forbehandlingen ble utført i forbehandlingen oppløsning i en mikrobølgeovn i 3 minutter og 50 sekunder, avkjølt til romtemperatur i løpet av 15 minutter, og deretter vasket. Seksjonene ble spaltet i RTU pepsin i 6 minutter ved 37 ° C (tiden kan justeres for ulike seksjons tykkelser). Etter vasking seksjonene var fullstendig dehydrert. Avsnittene som inneholder proben ble denaturert ved 66 ° C i 10 minutter og deretter hybridisert ved 45 ° C i 1-2 timer. Etter stringent vasking seksjonene ble dehydrert, montert i medium med DAPI, og lagret i mørke ved 4 ° C i 15 minutter før lesing. En fluorescens mikroskop og passende filtre ble anvendt for å skanne og å identifisere den aktuelle tumorområdet. Signalene fra den røde MET genet og grønt CEN-7-genet ble talt i 20 kreft kjerner i minst to områder for å bestemme
MET /CEN-7
forholdet. FISH scoring ble definert som følger: forholdet ≤2.0:
MET
forsterkning ble ikke observert; Forholdet 2.0:
MET
forsterkning ble observert. Hvis forholdet var borderline (01.08 til 02.02), ble ytterligere 20 kjerner telles, og forholdene ble beregnet på nytt.
Statistisk analyse
De gyldige HCC og GC målinger for
MET
CN ble kombinert for de statistiske analysene. Pearsons korrelasjoner og lineær regresjon ble brukt for å evaluere forholdet mellom ddPCR og SNP 6,0 eller fisk. Å sammenligne forskjellene i
MET
CN analysert av ddPCR mellom genet forsterker og ikke-forsterkning grupper analysert av fisk,
t
-UNDERSØKELSER ble brukt. Konsistensen av genamplifisering basert på ddPCR og FISH ble evaluert i henhold til samstemmighet og Cohens kappa koeffisient. Analysene ble utført med SAS 9.4-programvaren.
Resultater
Sammenligning av
MET
CN test mellom ddPCR og SNP 6,0 i kreftcellelinjer
Genomisk DNA ble oppnådd fra 8 GC og 38 HCC cellelinjer for
MET
kopiantall deteksjon, og resultatene av ddPCR analysen ble sammenlignet med de av SNP 6,0 for å bestemme hvorvidt ddPCR kan erstatte vanlige molekylærbiologiske teknikker. Resultatene er vist i tabell S1. Vi er fast bestemt på
MET
kopiere numre av cellelinjer
in vitro
hjelp Affymetrix microarray. Deretter brukte vi ddPCR å teste
MET
kopiantall i de samme prøvene ved å normal til
AP3B2
referanse genet. Vi observerte at cellelinjer med høy
MET
kopiere numre ifølge SNP 6,0 hadde også høye ddPCR målinger. Den lineære forening for
MET
kopiere antall målinger mellom ddPCR og SNP 6.0 er sterkt basert på Pearsons korrelasjon (r = 0,867;
P
0,001). Videre skråningen og skjærings
MET
CN av SNP 6,0 til ddPCR i lineær regresjon var signifikant (
P
0,001) med en verdi lik 1,996 (standardfeil av estimater = 0,177) og -4.159 (standardfeil av estimater = 0,752), henholdsvis (fig 1).
dataene er basert på en lineær regresjonsmodell som justerer for SNP 6.0 med skjæringspunktet. Solid linje angir passende kurve; grå boksen representerer 95% konfidensintervall; stiplet linje viser 95% prediksjon grenser. Hver data for
MET
CN hjelp ddPCR representerer to eller tre fusjonerte tekniske replikere brønner uten mal kontroll (NTC) som en negativ kontroll.
MET
genet forsterkning analyse i GC og HCC PDX modeller
Fordi ddPCR kan nøyaktig vurdere
MET
kopiere nummer i kreftcellelinjer, vi så avgjort om ddPCR kunne påvise tilstedeværelse av
MET
forsterkning og sammenlignet resultatene til de som oppnås fra FISH. Mange publikasjoner har rapportert bruk av digitale PCR måling av genkopitallet i FFPE- vev sammenlignet med FISH [11,12]. Her har vi analysert 116 GC og 39 HCC PDX tumormodeller. Rådata er oppsummert i Tabell S2.
MET
kopiantall analysert av ddPCR er signifikant forhøyet i
MET
forsterkning gruppe (mener, 15,4) sammenlignet med
MET
ikke-forsterkning gruppe (gjennomsnitt, 2,1) analysert ved fiske med
t
-test med ulik varians (
P
= 0,044) (fig 2). Den lineære sammenhengen mellom
MET
CN analysert ved ddPCR og
MET /CEN-7
forholdet analysert ved FISH var relativt sterk, som vurderes av Pearsons korrelasjon (r = 0,782;
P
0,001). Videre bruker lineær regresjon, stigningstallet og skjærings av forholdet mellom FISH til
MET
CN av ddPCR var signifikant (
P
0,001), med en verdi lik 2,723 (standardfeil estimater = 0,176) og -0.803 (standardfeil av estimater = 0,272), henholdsvis (figur 3). Vanligvis resultatene antydet at
MET
kopi tallverdier innhentet av ddPCR kunne skille mellom
MET
ikke-forsterkning og forsterknings grupper definert av fisk og som ddPCR kan brukes til å måle
MET
kopiere nummer i PDX-modeller.
P
-verdi var basert på
t
-test forutsatt forskjell avvik for hver gruppe. Hver data for
MET
CN hjelp ddPCR representerer to eller tre fusjonerte tekniske replikere brønner uten mal kontroll (NTC) som en negativ kontroll.
Dataene er basert på en lineær regresjon modell som justerer for FISH-forhold med skjæringspunktet. Solid linje angir passende kurve; grå boksen representerer 95% konfidensintervall; stiplet linje viser 95% prediksjon grenser. Hver data for
MET
CN hjelp ddPCR representerer to eller tre fusjonerte tekniske replikere brønner uten mal kontroll (NTC) som en negativ kontroll.
samstemmighet og Cohens kappa koeffisient var brukes til å observere konsistensen av genamplifisering mellom ddPCR og FISH og vurdere om det var en god cut-off verdi for å definere ddPCR baserte genamplifikasjon sammenlignet med FISH ratio 2.0. Blant de cut-off kandidater,
MET
CN 5.5 av ddPCR hadde høyest samstemmighet (98%) og Cohens kappa koeffisient (κ = 0,760) (95% CI, 0,498 til 1,000;
P
0,001). Spesielt blant de 155 gyldige PDX prøver, selv om de fleste av prøvene hadde konsistensen av
MET
genamplifisering mellom ddPCR og FISH, bare 3 PDX modeller (GAPF528, GAPF509, og GAPF012) som var positive for
MET
CN av ddPCR viste ingen påviselig FISH ratio . 2.0 (tabell 1)
Diskusjoner
Menneskelige genomer utviser segmental kopiantall variasjon (CNV) på tusenvis av loci [ ,,,0],1. 3].
MET
genamplifisering er blitt beskrevet i magekreft (GC) og hepatocellulært karsinom (HCC), noe som resulterer i feilregulering av MET signalering og er assosiert med klinisk prognose og dårlig prognose [6]. Den avvikende MET signal har vært ansett som et robust mål i anti-kreft terapi. Således er det tenkelig at en rekke studier [7-9] har vist
MET
genamplifikasjon som en potensiell biomarkør for å estimere pasienter med cancer som vil dra nytte av behandling med selektive inhibitorer MET eller antistoffer. Så langt har det ikke vært standardisert metode for å validere
MET
genamplifisering eller
MET
kopiantall.
SNP 6,0 og fisk er de metodene som konvensjonelt brukes til å evaluere
MET
kopiantall i kreftcellelinjer
in vitro Kjøpe og tumorprøver
in vivo
, henholdsvis. Men en rekke saker komplisere påvisning av genet forsterkning. Først disse metodene er svært kostbare og har behov for avanserte tekniske ferdigheter, og dermed informatikk teknikere eller erfarne patologer må analysere dataene og gjøre subjektive vurderinger. For det andre,
in vivo
tumorprøver, for eksempel FFPE- vev, er alltid testet av fisk og bruke lange fragment sonder, som resulterer i variasjoner i genkopitallet deteksjon avhengig sondene rettet mot forskjellige gen loci. Derfor søkte vi å identifisere en metode med enkle tekniske krav til mer nøyaktig oppdage
MET
kopiantall.
I denne studien har vi undersøkt muligheten for å bruke en ny metode for ddPCR å kvantifisere
MET
kopiere nummer eller vurdere genamplifisering fra kreftprøver bestående av cellelinjer eller FFPE- svulster. Resultatene viste at ddPCR kunne bestemme den MET status i tumorprøver. Vi fant det var en positiv korrelasjon mellom
MET
kopiere numre oppdaget av ddPCR og SNP 6,0 ifølge Pearson korrelasjoner (r = 0,867;
P
0,001). Selv om microarray teknologi er verdifulle tilnærminger for CNV besluttsomhet, har de begrenset dynamisk område og er dyrt for high-throughput screening i befolkningen studier [10]. På grunn av begrensningene i SNP 6,0 tilnærming i nøyaktig måling kopi tall større enn 4 og mangel på følsomhet og oppløsning, kan ddPCR bli utviklet for å måle høy kopi CNV mer nøyaktig i et stort antall prøver, som beskrevet tidligere [13]. Basert på vurdering av
MET
forsterkning i 155 FFPE PDX svulster, ddPCR kan sikkert reflektere
MET
forsterkning status i forhold til fisk, med en 98% samstemmighet. Videre er det betydelig forskjell på
MET
CNV oppdaget av ddPCR mellom FISH-positive og FISH-negative grupper, som gir en meget betydelig bevis på prinsippet.
Spesielt, men i de fleste av 155 FFPE PDX svulster, status for MET oppdaget av ddPCR var sammenlignbare med de oppdaget av FISH, tre FFPE- svulster som
MET
kopitallverdier var høy (CN 5,5) i ddPCR viste ikke genamplifikasjon av fisk (
MET /CEN-7
ratio 2,0). Bakgrunnen for uoverensstemmelse av
MET
forsterkning mellom ddPCR og FISH kan være undervurdering av
MET
forsterkning av FISH eller overvurdering av
MET
forsterkning av digital PCR. På den ene side, nærværet av
MET
genamplifikasjon kan bli maskert på grunn av ufullstendig karakteristisk for hybridisering av lange fragment prober på fisken, og føre til ikke-spesifikk identifikasjon av
MET
forsterkning. Spesielt kan variasjonen i
MET
forsterkning tilskrives sonden rettet mot ulike genomisk loci oppdaget av fisk. På den annen side, kan fikseringsprosessen brukes for FFPE vev forårsaker DNA-fragmentering, skade eller sammensmelting, og dermed fører til et falskt negativt resultat. I tillegg, med tanke på at tap av kromosom ofte forekommet i mange kreftformer kan resultere i kromosomal ustabilitet genomisk [14-16], innebærer det at tapet av referanse genloci i tumoren kan forårsake en falsk-positiv forhøyet forhold på
MET product::.
AP3B1
i ddPCR, snarere enn høy
MET
kopiere antall
av notatet,
MET
CN annen PDX prøve (GAPF101 ) er 0,00022 uten vellykket CN anrop ved ddPCR, ekstremt lavere enn
MET /CEN-7
forholdet 1 av fisk. Det innebærer at sletting eller skade av
MET
kan oppstå i delvis regionen MET som ble angrepet av ulike sonder ansatt i ddPCR og fisk, noe som resulterer i forskjell fra MET status mellom fisk og ddPCR. Det vil være interessant å utforske årsakene til disharmoni i fremtidig forskning.
Ellers analyse av tumorprøver av fisk krever kompleks eksperimentell teknologi og kan avhenge av en subjektiv vurdering av patologer. Resultatene kan variere mellom ulike patologer basert på sine erfaringer. I denne studien, viser vi at ddPCR er en kvantitativ metode som absolutt kan kvantifisere
MET
kopiantall i kreftprøver enten
in vitro
eller
in vivo
, uten behov for standardkurver eller endogen kontroll.
Samlet disse data tyder på at ddPCR har potensialet til å detektere
MET
kopitall i kreftcellelinjer eller FFPE-DNA og sterkt korrelert med SNP 6,0 eller FISH, henholdsvis.
MET
genamplifisering har blitt beskrevet å være assosiert med tumorigenesis og metastatisk progresjon og regnes som en biomarkør for å forutsi nytte av MET-rettet behandling i ulike kliniske studier [7-9]. Våre funn gir innsikt som ddPCR plattformen kan være i stand til å beregne forholdet mellom MET status og pasientens prognose i kliniske studier, og bidra til å bedre forutse og screene pasienter i responsen på MET-rettet behandling.
støtte Informasjon
S1 Table. Sammenligning av
MET
kopiantall oppdaget av ddPCR versus av SNP 6,0
doi:. 10,1371 /journal.pone.0146784.s001 product: (PDF)
S2 Table. Sammenligning av
MET
kopiantall oppdaget av ddPCR versus ved FISH
doi:. 10,1371 /journal.pone.0146784.s002 product: (PDF)
