Abstract
Prostatakreft (PCA) er en av de viktigste årsakene til dødsfall i USA. Den viktigste årsaken til dødelighet kan tilskrives metastaser. Kreft metastase innebærer sekvensielle og beslektede hendelser. mirnas og epitelial-mesenkymale overgang (EMT) er innblandet i denne prosess. MIR-195 er nedregulert i mange humane kreftformer. Men rollene til Mir-195 ved PCA metastase og EMT fortsatt uklare. I denne studien data fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) prostatakreft database ble re-analysert for å påvise MIR-195 uttrykk og sine roller ved PCA. MIR-195 ble deretter overuttrykt i kastreringsresistent PCA cellelinjer, DU-145 og PC-3. Rollen MIR-195 i migrasjon og invasjon in vitro ble også undersøkt, og vanlige markører i EMT ble evaluert gjennom Western blot analyse. En luciferase reporter-analysen ble utført for å bekrefte den målgenet av MIR-195; ble validert i PCA celler. I MSKCC data re-analyser ble MIR-195 dårlig uttrykt i metastatisk PCa; MIR-195 kan bli brukt til å diagnostisere metastatisk PCa ved å måle den tilsvarende uttrykk. Areal under mottaker drift karakteristikk (AUC-ROC) var 0,705 (P = 0,017). Lav MIR-195 uttrykk var preget med en kortere tilbakefall overlevelse (RFS) tid. MIR-195 overekspresjon trykt celle migrasjon, invasjon og EMT. Fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2) ble bekreftet å være et direkte mål for MIR-195. FGF2 knockdown også undertrykt migrasjon, invasjon og EMT; derimot, økte FGF2 delvis reversert den undertrykkende effekt av MIR-195. Og data fra ONCOMINE prostatakreft database viste at PCA pasienter med høyt FGF2 uttrykk viste kortere RFS tid (P = 0,046). Samlet denne studien viste at MIR-195 trykt PCa celle metastase av downregulating FGF2. MIR-195 restaurering kan anses som et nytt terapeutisk metode for å behandle metastatisk PCa
Citation. Liu C, Guan H, Wang Y, Chen M, Xu B, Zhang L, et al. (2015) MIR-195 Hemmer EMT ved målretting FGF2 i prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (12): e0144073. doi: 10,1371 /journal.pone.0144073
Redaktør: Kapil Mehta, University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 21 april 2015; Godkjent: 14 oktober 2015; Publisert: 09.12.2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Microarray datasett for prostatakreft ble hentet fra ONCOMINE Cancer Profiling Database (https://www.oncomine.org) for å undersøke FGF2 uttrykk i prostatakreft. Uttrykk av MIR-195 i prostatakreftcellelinjer ble hentet fra NCBI GEO database (GSE21032, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21032).
Finansiering: Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81370849, 81300472, og 81202034), Science Foundation Natural i Jiangsu-provinsen (BL2013032 og BK2012336) og Nanjing by (201.201.053) og Sørøst-universitetet (3290002402), Vitenskap Foundation of Ministry of Education of China (20120092120071), grunnleggende forskning midler til sentrale universiteter og vitenskapelige Innovasjonsprosjekt prosjekt~~POS=HEADCOMP av Universitetet i Jiangsu-provinsen (KYLX_0203). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA), en av de viktigste årsakene til dødsfall i USA, var ansvarlig for 29,480 amerikanske dødsfall i 2014 [1]. Lokal primærtumor er sjelden dødelig. Den viktigste årsaken til dødelighet kan tilskrives metastase [2]. Omtrent 90% av dødsfallene fra solide tumorer er forårsaket av metastaser [3]. PCa metastase er funnet i mindre enn 5% av pasientene i den første diagnose. I kastrering-resistente PCa (CRPC) gruppe, 50% -70% av pasientene sannsynlig utvikler benmetastaser [4]. Derfor mekanismen av PCa metastaser, særlig CRPC, bør undersøkes for å behandle PCa.
Kreft metastase innebærer sekvensielle og beslektede hendelser [5]. Epitelial-mesenchymale overgang (EMT), kjent for å slå inn i epitelceller mesenchymale celler, også utfører viktige funksjoner i cancermetastase [6]. Epitelceller få mesenchymale celler egenskaper, herunder kjøp av celle migrasjon og invasjon evner, gjennom EMT [7]. Mekanismene for EMT er komplekse. Mange faktorer, inkludert mirnas [8], er forbundet med EMT. mirnas er små, ikke-kodende RNA fra 20-22 nt som posttranscriptionally modulere genekspresjon ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av mRNA). Antall mirnas er funnet være avvikende expresaion i kreft og implisere apoptose, proliferasjon, differensiering og metastase [9]. Det er kjent at mange mirnas fremme eller hemme metastatisk tumor progresjon ved å regulere EMT [10]. MIR-29b og MIR-30a trykt uttrykk for herre transkripsjonsfaktor Snail en i programe av EMT [11, 12]. Derfor kan økt Mir-29b uttrykk hemme EMT og redusere celle invasjon [11]. Videre MIR-200 familiemedlemmer og MIR-205 undertrykke oversettelse av sink-finger E-box-bindinger (Zebs) 1 og 2; ZEB en og ZEB2 uttrykk aktiveres tidlig i EMT [13]
MIR-195 tilhører MIR-15/16/195 familien.; dette miRNA er lokalisert inn kromosom 17p13.1. Avvikende MIR-195 uttrykk har blitt observert i mange typer ondartede kreftformer, som brystkreft, mage, tykktarm, adrenokortikal, blære og eggstokkreft, leverkreft og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [14-21]. Videre kan MIR-195 også hemme invasjon og migrering i NSCLC, kolorektal kreft og osteosarkom [17, 18, 22]. MIR-195 ble også funnet å være lav uttrykk i PCA vev [23]. Men denne studien bare analysert Mir-195 uttrykk i prostata kreft, effekter av MIR-195 på PCa patobiologi, særlig i metastaser, er foreløpig ikke fastslått. Så vi undersøke hvilken rolle MIR-195 i EMT og metastasering av PCa i t studien
I denne studien data fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) prostatakreft database ble re-analysert.; Resultatene viste at MIR-195 var dårlig uttrykt i metastatisk PCa. Pasienter med lavere Mir-195 uttrykk utstilt kortere tilbakefall overlevelse (RFS) tid. MIR-195 kan også bli brukt til å diagnostisere metastatisk PCa ved å måle deres tilsvarende uttrykk; Arealet under mottaker-drift karakteristisk kurve (AUC-ROC) var 0,705 (p = 0,017). In vitro metoder ble brukt for å undersøke hvilken rolle MIR-195 i EMT og metastasering av PCa. Overexpressed MIR-195 i PCA celler hemmet EMT og celle metastasering. Luciferase reporter analyser og Western blot-analyse ble utført for å identifisere MIR-195 mål; Resultatene viste at fibroblast-vekstfaktor 2 (FGF2) er et direkte mål. FGF2 ble deretter slått ned i PCA celler og effekter som ligner på de av MIR-195 overekspresjon ble observert. Videre restaurerte FGF2 nivåene i celler som overuttrykt MIR-195 trolig hemmet effekten av MIR-195. Og data fra ONCOMINE prostatakreft database viste PCA pasienter med høy FGF2 uttrykk viste kortere RFS tid (P = 0,046). Disse funnene antydet at MIR-195 spiller en viktig rolle ved PCA metastaser.
Materialer og metoder
Data mining og bioinformatikk analyse
Microarray datasett for prostatakreft ble hentet fra ONCOMINE kreft Profilering Database (https://www.oncomine.org/resource/main.html#a%3A1878%3Bd%3A34%3Bdso%3AdatasetName%3Bdt%3ApredefinedClass%3Bec%3A%5B2%5D%3Bepv%3A150001.151078%2C3508%3Bet%3Anone%3Bp%3A200001310%3Bpg%3A1%3Bpvf%3A59119%3Bscr%3Adatasets%3Bss%3Aanalysis%3Bv%3A18 og https://www.oncomine.org/resource/main.html#a%3A8158%3Bd%3A156636663%3Bdso%3AdatasetName%3Bdt%3ApredefinedClass%3Bec%3A%5B2%2C1%2C3%2C5%5D%3Bepv%3A150001%3Bet%3Anone%3Bp%3A200011396%3Bpg%3A1%3Bpvf%3A800075355%2C800075356%3Bscr%3Adatasets%3Bss%3Aanalysis%3Bv%3A18) å undersøke FGF2 uttrykk i prostatakreft. Uttrykk av MIR-195 i prostatakreftcellelinjer ble hentet fra databasen (GSE21032, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21032) [24]. MIR-195 uttrykk mellom lokaliserte PCa og metastatisk PCa og den tilsvarende biokjemiske tilbakefall frihetstiden etter radikal prostatektomi ble gjen analysert i databasen. ROC-kurver ble generert, og AUC ble ansett for å evaluere følsomheten og spesifisiteten av bruken av MIR-195 uttrykk for å diagnostisere metastatisk PCa. FGF2 uttrykk og den tilsvarende biokjemisk tilbakefall-fri tid etter radikal prostatektomi i prostatakreft ble undersøkt i Cancer Profilering Database.
Cell kultur
LnCap cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) ble DU-145 og PC-3 cellelinjer kjøpt fra Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. LnCap og DU-145-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, HyClone, Beijing, Kina) supplert med 10% føtalt bovint (HyClone, Gaithersburg, Maryland, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ( HyClone, Beijing, Kina). PC-3-celler ble dyrket i DMEM /F12-medium (HyClone, Beijing, Kina) supplert med 10% føtalt bovint (HyClone, Gaithersburg, Maryland, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (HyClone, Beijing, Kina). Cellekulturene ble inkubert i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Oligonukleotider og celle transfeksjon
miRNA etterligner oligonukleotid-duplekser og liten interfererende RNA ( siRNA) ble kjemisk syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Deteksjons og anti-sense sekvenser av HSA-MIR-195 etterligner var: 5′-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3 «og 5′- CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3′, henholdsvis. RNA med ingen homologi med en hvilken som helst humant genomisk sekvens ble anvendt som negativ kontroll (NC): 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «(sense) og 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (anti-sense). Sekvensen av MIR-195 siRNA var 5»-GCCAAUAUUUCUGUGCUGCUA-3 «og kontrollsekvensen var 5′- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA -3». Deteksjons og anti-sense sekvenser av FGF2 siRNA var 5′-GGAGUGUGUGCUAACCGUUtt-3 «og 5′- AACGGUUAGCACACACUCCtt-3», henholdsvis. I celle transfeksjon, ble cellene sådd ut i seks-brønns plater og dyrket til 50% til 70% konfluens ble oppnådd i en, d. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, New Mexico, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfeksjon Blandingen ble erstattet med et medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) etter 6 timer til 8 timer.
cellemigrering og invasjons assays
cellemigrering og invasjons analysene ble evaluert ved anvendelse av en Transwell kammer (Millipore, Billerica, MA, USA). Cellene ble høstet ved 48 timer posttransfection, og 5 x 10
4-celler med 200 ul serumfritt medium ble podet i det øvre kammer. Det nedre kammer ble fylt med medium supplert med 10% FBS. I invasjon analyser, forkamrene var pre-belagt med Matrigel (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA) før celle seeding ble utført. Celler igjen på den øvre membranen ble fjernet etter 24 timer for invaderende celler og i 12 timer for trekk celler. Trekkende og invaderende celler på den nedre overflate ble fiksert i 90% alkohol og farget med 0,1% krystallfiolett. Fem tilfeldige felt fra hver membran ble talt opp. Eksperimenter ble utført uavhengig i tre eksemplarer.
Plasmid konstruksjon og luciferase assay
FGF2 3′-UTR-luciferase reporter vektorer ble opprettet av ligere FGF2 3′-UTR PCR produktene inn Xhol og NotI begrensning områder av psiCHECK-2 ™ Vector (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Mutant 3′-UTR regioner ble kjemisk syntetisert og ligert inn psiCHECK-2 ™ vektor. Celler ble dyrket i 24-brønners plater, og hver brønn ble transfektert med 250 ng av vektorer med 50 nM MIR-195 eller NC. Etter 48 timer av ko-transfeksjon, ble luciferaseaktiviteten bestemmes målt ved bruk av en dual-luciferase reporter analysesystemet (Promega, Madison, Wisconsin, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot-analyse
Celler ble lysert ved RIPA buffer (Beyotime, Shanghai, Kina) supplert med proteasehemmere. Proteinprøver ble underkastet elektroforese på 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamid-geler. Kastet elektroforese proteiner ble overført til en polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) og blokkert i 1 time med 5% skummet melk ved romtemperatur. Etter at proteinene ble inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten, ble blottene vasket, inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -merket sekundære antistoff ved 37 ° C i 1 time og visualisert ved hjelp av forbedret kjemiluminescens. Proteinnivåer ble bestemt ved å normalisere mot glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). De relaterte antistoffer var kanin anti-GAPDH (1: 500, Xianzhi bioteknologi, Hangzhou, Kina), anti-vimentin (1: 1000, Proteintech, Chicago, USA), anti-N-cadherin (1: 200, Proteintech, Chicago, USA), anti-E-cadherin (1: 500, Proteintech, Chicago, USA), muse-anti-FGF2 (1: 500, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), HRP-merket geit anti-kanin sekundært antistoff (1: 3000, Zhongshan Goldenbridge bioteknologi, Beijing, Kina) og HRP-merket geit anti-mus sekundære antistoff (1: 3000, Zhongshan Goldenbridge bioteknologi, Beijing, Kina).
Statistisk analyse
MIR-195 uttrykk og klinisk pasientdata ble lastet ned fra MSKCC database (https://www.mskcc.org). FGF2 uttrykk og kliniske pasientdata ble lastet ned fra ONCOMINE Cancer Profiling Database (www.oncomine.org). Alle eksperimentene ovenfor ble gjentatt tre ganger. Alle dataene i denne studien ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistiske beregninger ble utført ved hjelp av SPSS 16.0. Forskjeller mellom grupper ble beregnet ved å
t
-UNDERSØKELSER eller enveis ANOVA. Logg cox test ble valgt til å utføre overlevelse analyse. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Mir-195 uttrykk og dens effekt på diagnose og resultatet av pasienter med PCa
Vi re-analysert RNA sekvense data for PCa database (GSE21032). Uttrykket av MIR-195 mellom lokalisert og metastatisk PCas ble beregnet ved t-tester. Resultatet viste at MIR-195 i metastatisk PCa var betydelig lavere enn i lokaliserte PCa (9,92 ± 0,56 vs. 11,27 ± 0,07, P 0,0001, figur 1A). Videre ROC analyse viste at MIR-195 kan diskriminere mellom metastatisk kreft og primær PCa (AUC = 0,705, p = 0,017, figur 1B). Derfor undersøkte vi effekten av lav Mir-195 uttrykk på RFS i lokaliserte PCa. Pasientene ble delt inn i lave og høye uttrykk grupper ved hjelp av tall ligger i 30% av alle tall, 11,05 som en cut-off fra Mir-195 uttrykk. RFS analyse ble utført i 98 lokaliserte PCA tilfeller med oppfølgingsdata. Kaplan-Meier-kurver av RFS viste at PCA pasienter med lav Mir-195 uttrykk viste kortere RFS tid (P = 0,047, figur 1C). Derfor kan MIR-195 spille viktige funksjoner ved PCA metastaser
A) data i re-analysert MSKCC prostatakreft database viste at MIR-195 er uttrykt dårlig metastatisk PCa (metastatisk PCa vs. lokalisert PCA:. 9,92 ± 0,56 vs. 11,27 ± 0,07, P 0,0001). B) ROC analyse ved hjelp av uttrykk nivåer av MIR-195 i metastatisk PCa og lokalisert PCa (AUC = 0,705, p = 0,017). C) Kaplan-Meier-kurver av RFS av pasienter med PCa stratifisert av vev av MIR-195 nivåer. Pasienter med lave MIR-195 nivåer utstilt kortere RFS enn de med høye nivåer (P 0,05) * P 0,05.
EMT hemming av MIR-195 i PCA celler
For å undersøke om MIR-195 påvirker PCa celle invasjon og migrasjon, transfektert vi MIR-195-hemmer eller kontroll inhibitor i LnCap celler og MIR-195 etterligner eller kontroll miRNA i DU-145 og PC-3 celler og analysert celle migrasjon og invasjon evne ved hjelp av Transwell. Resultatene viste at MIR-195 etterligner gruppe inneholdt færre antall celler, som migrert inn i det nedre kammer i den Transwell filteret, enn den MIR-NC-gruppen i Du-145 og PC-3-celler (figur 2A). Invasion evne ble også signifikant nedregulert i MIR-195-transfektert DU-145 og PC-3 celler (figur 2B). Imidlertid ble det observert noen signifikant forskjellig mellom LNCaP celler transfektert MIR-195 hemmer og kontroll inhibitor i invasjon og migrasjonsanalyser (S1 Fig). Så vi valgte Du-145 og PC-3 for de neste forsøkene. EMT kan endre celle invasjon og migrasjon evne. For å finne ut om MIR-195 kan påvirke EMT, vi evaluert noen vanlige EMT markører gjennom Western blot analyse. En redusert ekspresjon av vimentin og N-cadherin-proteiner ble observert i celler transfektert med MIR-195 etterligner sammenlignet med den i celler transfektert med kontroll miRNA. E-cadherin uttrykk økt i celler transfektert med Mir-195 etterligner (Fig 2C). Disse resultatene antydet at MIR-195 kan hindre celle invasjon og migrasjon ved å hemme EMT.
A) Tvungen uttrykk for MIR-195 hemmet migrasjon i PCA cellelinjer. B) Tvunget uttrykk for MIR-195 hemmet invasjon i PCA cellelinjer. C) Felles EMT markører uttrykk etter transfeksjon MIR-195. * P 0,05. Original forstørrelse × 200.
FGF2 var et direkte mål på MIR-195
Bioinformatikk analyser ble utført ved hjelp av DIANA mikrotiterplater v5.0 og TargetScanHuman 6,2 identifisere målgener av speil 195. FGF2 ble valgt som potensielt mål genet fordi det ble spådd i begge databasene og hadde den høyeste totale sammenheng score i TargetScanHuman 6.2. 3′-UTR av FGF2 ble spådd til å inneholde fem bindingsseter for MIR-195. Vi analyserte sekvensen av bindingsseter og fant at områder som ligger fra 1053 til 1059 nukleotider og 1113 til 1119 nukleotider var en del av tre andre bindingsseter (tabell 1). Derfor bare nettstedene til 5065 til 5072, 5598 til 5605, 5639 til 5646, samt mutasjon områder, ble klonet inn luciferaserapportørplasmid plasmider (fig 3A). De reporter plasmider ble ko-transfektert med Mir-195 etterligner eller NC i PC-3 celler. Luciferase aktivitetsanalyse viste at MIR-195 etterligner undertrykte betydelig luciferaseaktiviteten av reporter plasmid som inneholder bindingsseter sammenlignet med NC av villtype-reporter, men ikke av den mutante en (figur 3B). MIR-195 overekspresjon bemerkelsesverdig hemmet FGF2 uttrykk i DU-145 og PC-3 celler (figur 3C). Disse resultatene antydet at FGF2 er et direkte mål gen av MIR-195.
A) Sekvens justering av menneskelig MIR-195 med 3 «UTR av FGF2 spådd av DIANA LAB. B) Dual-luciferase analyseresultatene for PC-3 celler viste at MIR-195 oppregulering redusert luciferase aktivitet. C) FGF2 protein ekspresjon i PCA-cellelinjer ble bestemt ved Western blot-analyse ved 72 timer etter transfeksjon. GAPDH ble anvendt som en kontroll. * P. 0,05
FGF2 knockdown fremkalte lignende effekter på PCA celler med overuttrykte MIR-195
FGF2 ble slått ned i PCA celler ved å innføre siRNA å avgjøre om effekter av MIR-195 kan delvis forklares ved å målrette av FGF2. Den FGF2 Uttrykket redusert ved 72 h posttransfection, som påvist ved Western blot-analyse (figur 4C). Antallet migrerte celler var betydelig lavere i DU-145 og PC-3 celler transfektert med FGF2 siRNA enn tilført med kontroll siRNA (Fig 4A). Antallet invaderte celler ble også redusert (figur 4B). I samsvar med MIR-195 transfeksjon, inhibering av FGF2 ekspresjon i PCA-celler ble redusert vimentin og N-cadherin ekspresjon og øket E-cadherin ekspresjon (Fig 4C).
A og B) lav ekspresjon av FGF2 hemmet migrasjon og invasjonen i PCA cellelinjer. C) FGF2 og felles EMT markører uttrykk etter siFGF2 ble transfektert. * P 0,05.
MIR-195 hemmet EMT i en FGF2 avhengig måte
For ytterligere å bekrefte om FGF2 var nødvendig for MIR-195 mediert EMT, behandlet vi cellene med rekombinant humant FGF2 protein (Sino Biological Inc., Beijing, Kina) etter transfeksjon ble utført. Antallet migrerte celler og invaderte betydelig øket etter behandling ble administrert (fig 5A og 5B). Vimentin og N-cadherin uttrykk økt, mens E-cadherin uttrykk redusert etter 48 timers behandling (Fig 5C). Resultatene viste at MIR-195 hemmet EMT av PCA celler i en FGF2 avhengig måte.
PCA cellelinjer ble behandlet med rekombinant humant FGF2 protein etter transfeksjon med MIR-195 ble utført. A) Antallet migrerte celler økte etter behandling. B) Antallet invaderte celler økte etter behandling. C) Felles EMT markører uttrykk etter 48 timers behandling.
FGF2 uttrykk og dens effekt på utfallet av pasienter med PCa
ONCOMINE prostatakreft database er den mest kjente databasen i verden med flere av høy kvalitet datasett. I Lapointe prostatakreft datasett, FGF2 uttrykk hadde ingen statistisk signifikant mellom metastatisk kreft og primær PCA vev (-,91190 ± 0.62090 vs. 0.57764 ± 0,35019, P = 0 0,174). Primære PCA pasienter ble delt inn i lave og høye uttrykk grupper ved hjelp av median antall som en cut-off av FGF2 uttrykk. Kaplan-Meier-kurver av RFS indikerte at PCA pasienter med høyt FGF2 uttrykk viste kortere RFS tid (P = 0,046, figur 6).
Kaplan-Meier-kurver av RFS av pasienter med PCa stratifisert av vev av FGF2 nivåer . I Lapointe studie pasienter med høye FGF2 nivåer utstilt kortere RFS enn de med høye nivåer (P 0,05).
Diskusjoner
mirnas er unormalt uttrykt ved PCA og endringer i miRNA uttrykket påvirke utbruddet, utvikling og metastasering av PCa. For eksempel, undertrykker MIR-146a tumorvekst og progresjon i CRPC [25]. MIR-29b, MIR-200 familie og MIR-205 påvirkning PCa metastase ved å regulere EMT [11, 13]. Videre kan miRNA uttrykket brukes for diagnostisering, staging og prognose analyse [26]. I denne studien, re-analyse av data fra MSKCC viste at MIR-195 var dårlig uttrykt i metastatisk PCa. ROC-analyse viste at MIR-195 kan diskriminere metastatisk kreft fra primær PCa; lav MIR-195 uttrykk utstilt kortere RFS tid. Resultatene viste at MIR-195 kan være innblandet i PCa metastaser; MIR-195 kan brukes som en biomarkør for diagnose og prognose analyse.
metastatisk sykdom er ansvarlig for de fleste kreftrelaterte dødsfall. Omdannelsen av primærtumor til metastatisk kreft er en flertrinns prosess. EMT er en viktig prosess i løpet av metastasering. Derfor er det rimelig å forvente at mirnas kan kontrollere metastase ved å regulere EMT. En stor antall mirnas finnes leke integrert roller i moduler EMT [10], MIR-195 er også korrelert med lymfeknutemetastase og dårlig prognose ved kolorektalkreft [27]. Men det regulatoriske prosedyren av MIR-195 ved PCA er fortsatt uklart. I vår studie ble effekten av MIR-195 om regulering av EMT og metastasering av PCa undersøkt. Induksjon av MIR-195 uttrykk hemmet EMT og invasivitet av PCA celler.
mirnas utføre biologiske funksjoner ved direkte binding til 3′-UTR av mRNA og ved å svekke protein oversettelse. Som sådan, ble gener regulert av MIR-195. CARMA3 og BCL-2 er direkte mål av MIR-195 i tykktarmskreft [18, 28]. IGF1R og HDGF er direkte mål for MIR-195 i NSCLC [14, 17] .I denne studien, FGF2 ble bekreftet å være et direkte mål gen av MIR-195 gjennom luciferase-analysen og Western blot-analyse. Bortsett fra det, høy FGF2 uttrykk utstilt kortere RFS gang i PCA pasienter. FGF2, som hører til FGF-familien 23-medlem, ble først funnet i 1974 [29]. FGF2 er å anse som en prototypisk vekstfaktor [30]. FGF2 er også overuttrykt i et stort antall mennesker karsinom, inkludert PCA og innblandet i onkogene atferd, inkludert invasjonen og migrasjon [31-34]. FGF2 uttrykk er regulert av mange miRNAs. FGF2 er også et mål av MIR-503 i levercellekarsinom [35]. MIR-646 kan nedregulere FGF2 og undertrykke osteosarkomcellelinje metastase [36]. I NSCLC, er FGF2 et mål av MIR-152 [37]. FGF2 induserer også EMT i mange celletyper, så som Hertwig største epithelial rot slire (hennes) celler, renale tubulære celler, tykktarmskreftceller, og PCA-celler [38-41]. FGF2 induserer EMT gjennom en alvorlig av signalveier [38, 41, 42]. I hennes celler, TGF-β1 og FGF2 indusere EMT gjennom et MAPK /ERK-avhengige signalveien [38]. I PC-3 celler, påvirker AKT /GSK-3β signalveien EMT, som er fremmet av FGF2, ved å kontrollere stabilitet, lokalisering og transkripsjon av Snail [41]. FGF2 fremmer også EMT gjennom PI 3-kinase signalveien [42]. I denne studien våre data viste at knockdown av FGF2 fremkalte tilsvarende virkning på PCA-celler med overuttrykt MIR-195 ved å hemme EMT og invasivitet. Etter MIR-195 ble transfektert, de behandlede celler med rekombinant humant FGF2 protein opphevet effekten av MIR-195.
I konklusjonen, MIR-195 hemmet PCa celle metastase og EMT ved å målrette FGF2. MIR-195 restaurering kan gi nye terapeutiske metoder for å behandle metastatisk PCa.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. . Effekten av MIR-195 inhibitor i LnCap
transfekterte MIR-195 inhibitor i LNCaP celler påvirket ikke migrasjons- og invasjons evner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0144073.s001 plakater (TIF )
S1 fil. Kliniske studier Sjekkliste
doi:. 10,1371 /journal.pone.0144073.s002 plakater (docx)
Takk
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81370849 , 81300472, og 81202034), Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BL2013032 og BK2012336) og Nanjing by (201.201.053) og Sørøst-universitetet (3290002402), Foundation of Ministry of Education of China (20120092120071), grunnleggende forskning Funds Science Naturlig for de sentrale universiteter og forskning innovasjon prosjektet fra Universitetet i Jiangsu-provinsen (KYLX_0203). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
