Abstract
Kreft celle metabolisme lydhør overfor androgen deprivasjon terapi (ADT) kan være involvert i utvikling og progresjon av prostatakreft og den ultimate svikt i androgen-deprivasjon terapi. For å undersøke regulere metabolske effekter på androgen-uavhengig vekst av prostata kreft, en etablert LNCaP-Koreas celle modell som ligner den kliniske scenario av kastrering resistent prostatakreft (CRPC), ble brukt i denne studien. Denne cellelinjen ble dyrket fra androgen-sensitive LNCaP foreldre celler, i en androgen-redusert tilstand, ligner klinisk androgen deprivasjon. For å vurdere effekten av smsDX på invasivitet av prostatakreftceller vi brukte leging av sår analyse og Matrigel ™ invasjon analysen. Vi evaluerte differensielt uttrykte proteiner av den parentale LNCAP celler og LNCaP-celler etter s ADT ved hjelp av to-dimensjonal gelelektroforese (2-DE), etterfulgt av MALDI-TOF massespektrometrisk analyse. Det dekkede området i såret, og antallet celler som invaderer gjennom en Matrigel kammer var betydelig mindre for celler behandlet med smsDX enn de var for kontrollceller som ble behandlet med bærer. 56 proteiner ble funnet uttrykt forskjellig i LNCaP-celler som s sammenlignet med LNCaP-celler, majoriteten av dem ble nedregulert etter ADT behandling. 104 proteiner av LNCaP-celler og 86 i LNCaP-s-celler, hver for seg, ble funnet uttrykt forskjellig etter behandling med smsDX, Når vi utforsket disse proteinfunksjoner i nettstedet UniProtKB /Swiss-Prot, overraskende har de fleste av proteinene ble funnet å være involvert i den cellulære metabolisme og mitokondriefunksjon regulering. LNCaP-s som potensielle metastatisk androgen-uavhengig kreftceller, dets metabolisme og mitokondrie funksjoner kan endres ved en ny somatostatin derivat smsDX, de smsDX regulerende effekt på metabolismen i LNCaP-Koreas levere mer terapeutisk informasjon med behandling av CRPC.
Citation: Yan L, Xing Z, Guo Z, Fang Z, Jiao W, Guo X, et al. (2013) Somatostatin Derivative (smsDX) Mål cellenes stoffskifte i prostata kreft celler etter androgen deprivasjon. PLoS ONE 8 (2): e55790. doi: 10,1371 /journal.pone.0055790
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 12. september 2012; Akseptert: Per 31. desember 2012; Publisert: 07.02.2013
Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Grant Sponsor : The National Natural Science Foundation of China (nr 81172435) og Shandong Natural Science Foundation (No. ZR2010HM026). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn, og den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet i USA og Europa hanner [1]. Den tumorprogresjon til CRPC fasen er en kompleks prosess som kan involvere både klonal seleksjon og adaptive mekanismer i heterogene svulster sammensatt av celler som reagerer forskjellig på androgen deprivasjon (ADT). Men de mekanismer som svulster skaffe androgen uavhengighet fortsatt uklare, og må tas opp før effektive behandlingsstrategier kan utvikles.
ADT er ofte benyttet i behandling av avansert prostatakreft. Men androgen deprivasjon er ikke kurativ [2], slik at den dødelige CRPC er uunngåelig. Tegn på vaskulær degenerasjon, hypoksi og metabolsk stress i prostata svulstvev forsterkes etter kirurgisk eller medisinsk kastrasjon [3]. Etter en kort remisjon, hadde de fleste av prostatakreft blir androgen-uavhengig. CRPC celler etter ADT er i stand til å overleve den lave oksygen og næringsmiljø og dukke opp med en forskjellig fenotype. Androgen deprivasjon er kjent for å indusere nevroendokrine (NE) differensiering i LNCaP-celler, og omfatter i overgangen til androgen uavhengighet [4], [5]. NE svulster har vist seg å overuttrykker somatostatin reseptorer (SSTRs) [6]. Den SSTR1-5 uttrykket kan bli regulert av somatostatin og dets derivat smsDX mulig via reguleringen av mitokondrier av LNCaP som til slutt kan utløse mitokondrie-mediert apoptose [7]. Somatostatin-analoger bindes til SSTRs og antas å ha dobbelt antitumoraktivitet, både direkte (anti-proliferativ) og indirekte (hemming av forskjellige peptidhormoner utskilt av tumorceller) [8], [9]. Somatostatin analog, har lanreotid vist seg å ha betydelig antineoplastisk virkning i forskjellige tumorer, inkludert CRPC [10]. Men regulering av somatostatin analog på prostatakreft cellenes stoffskifte ikke har vært tydelig adressert.
Vi argumenterer for at hemming av androgen reseptor (AR) uttrykk er i seg selv tilstrekkelig til å indusere celledød i AR-positive celler. Men når disse AR-positive celler gradvis mistet AR uttrykk eller i en lavere AR uttrykk i prostatakreftceller, kan disse CRPC cellene får energi forsyning via mitokondrie aktiviteter. Ifølge resultatene av Sotgia F gruppe [11], kan epiteliale kreftceller tar opp energirike metabolitter fra nabo stromale fibroblaster som gir den nødvendige energirike mikromiljøet for å tilrettelegge for tumorvekst og angiogenese. Disse cellene sultet strippet for androgen kunne bruke disse metabolittene i den mitokondrielle trikarboksylsyre syklus (TCA), som resulterer i en høyere proliferativ kapasitet. For CRPC celler vekst etter ADT, up-regulere enzymer som omdanner adrenal androgener til testosteron og DHT (spesielt AKR1C3) ytterligere styrke sin intratumoral androgen syntese og reaktive AR transkripsjonen aktivitet [12], er AR reaktive økt intratumoral syntese av testosteron og DHT fra svake androgener produsert av muligens
de novo
fra kolesterol i verts stroma og ekstracellulære metabolitter.
hoved~~POS=TRUNC oppstår fra prostata kreft er dens tilbøyelighet til å metastasere. Lokal invasjon er en av de grunnleggende tidlige trinnene i metastasering, som uten det tumorspredning ikke kan forekomme. Den flertrinnsprosess med invasjon og metastase er skjematisert som en sekvens av diskrete trinn, ofte kalt invasjon-metastase kaskade [13], [14]. I løpet av denne kaskade den metabolske omprogrammering for å støtte syntese av nye proteiner, lipider og nukleinsyrer er kritisk for cellevekst og deling [15]. Vi spekulerer i at de cellulære metabolske forandringer vil følge med prostatakreft fremgangen til dødelig CRPC status. Vår studie vil fokusere på de smsDX hemmende effekt på invasivitet av prostatakreft og regulering av om cellenes stoffskifte etter hemming av AR aktivitet, formidlet av androgen uttømming. Ved hjelp av LNCaP og LNCaP-S-celler for å undersøke proteiner som involverer i cellemetabolisme og energifunksjoner i prostata cancer, og for å bestemme de regulerende effekter forårsaket av somatostatin-derivat smsDX, demonstrerte vi ADT nedregulerer meste av mitokondrie protein, muligens resulterer i aktiveringen mitokondriell-mediert apoptotiske sti. De smsDX effekter på ER fører til overekspresjon av GRP78, sammen med to andre ER proteiner PDIA1 og PDIA3. smsDX utøver sin effekt ved dysregulating av metabolske enzymer på flere nivåer, som omfatter i ferd med å CRPC celle invasivitet og overlevelse. Som konklusjon viser disse resultater tyder på at ADT regulerer mitokondrie-mediert og ER stress signalering i LNCaP-celler og fører til omprogrammering av metabolismen i CRPC celler, gir smsDX regulerende virkninger på de CRPC cellene nyttig informasjon for behandling av CRPC.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og reagenser
LNCaP human prostatacancercellelinje (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) ble rutinemessig opprettholdt i det faste medium (fenolrødt-positive RPMI 1640 medium supplementert med 5% FBS, 1% glutamin og 0,5% gentamicin), som beskrevet tidligere ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Mediet ble forandret to ganger i uken av, og cellene ble trypsinisert og subcultivated gang i uken. For forsøkene ble androgen sensitive LNCaP-celler med passasjenummer 28-33 utnyttet. For å etablere en androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinje, vi dyrket en LNCaP-s cellelinje fra en foreldreprostatacancer LNCaP-cellelinje i et androgen-deprivasjon tilstand. Etter 8-12 passasjer, ble LNCaP-s celler behandlet med smsDX. Somatostatin var fra Ferring, Kiel, Tyskland. Cellekulturen ble behandlet med smsDX (fra professor Sten Nilsson Lab) eller med somatostatin i tre dager, 1 nM per dag, som beskrevet av Liu Z [7]. Anti-human AR, CGA og NSE, anti-TOM40 antistoff (sc11414), ble β-aktin (kanin anti-aktin antistoff R-22) som er kjøpt fra Santa Cruz Biotecnology. TCTP (# 5128), STMN1 (# 3352) og VDAC2 (# 9412) antistoffer ble kjøpt fra Cell Signa kommersielt. CBX3 (HPA004902) og grp78 (G9043) antistoffer ble kjøpt fra Sigma kommersielt.
Sårtilheling analysen
Celler ble dyrket til konfluens på seks-brønns vevskulturplater og et sår ble gjort ved skraping i midten av cellen monolag med et P200 pipettespiss. Etter flytende celler ble fjernet ved grundig vasking med iskald fosfatbufret saltløsning friskt komplett medium som inneholdt 10 nM smsDX eller den tilsvarende mengden av PBS ble tilsatt. Migrasjon og celle bevegelse hele sårområdet ble undersøkt etter 24 timer.
Matrigel invasjonen analysen
invasjon analysen ble utført ved hjelp av Matrigel belagt Transwell inserts (BD ™) med 8 mikrometer porer i 24-brønn plater, som i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble en suspensjon av 1 x 10
6-celler i 100 ul serumfritt medium ble tilsatt til innsatsen og 500 ul av RPMI 1640-medium inneholdende 20% FBS supplert med 1-10 nM smsDX eller den tilsvarende mengde av saltvann var tilsettes til bunnen av brønnen. Etter at platene var inkubert i 48 timer ved 37 ° C innskuddene ble løst i metanol, ble filtrene farget med 0,1% krystallfiolett, og antallet celler som invaderte gjennom Matrigel belagte Transwell innsatser ble tellet ved 40 x forstørrelse. Antall celler ble tellet i uavhengige eksperimenter triplikate i minst 10 felter pr brønn. Analysene ble gjentatt 3 ganger.
Western blot analyse
I androgen-avhengige LNCaP celler etter ADT behandling, vi dyrket en stabil LNCaP-Koreas cellelinje. Androgen uavhengig prostatakreft celle biomarkører og proteiner som er berørt av smsDX ble testet. Western blotting ble utført for å validere flere utvalgte differensielt uttrykte proteiner identifisert av 2-DE baserte MS. Primære antistoffer ble anvendt ved følgende fortynninger: geit-anti-humant AR, CGA og NSE, 1:1000; p-aktin, 1:1500; anti-TOM40 antistoff, 1:800. TCTP, 1:1000; STMN1, 1:1000; VDAC2, 1:1000; CBX3, 1:1000; GRP78, 1:1000. Western blots ble utført som beskrevet [16]. Kort sagt ble celler lysert med buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 0,1% NP-40 og 5 mM EGTA, 50 mM natrium influensa-tetraklorid, 60 mM β-glycerol-fosfat, 0,5 mM natrium-vanadat, 0,1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotinin og 10 ug /ml leupeptin. Proteinprøver (35 ug) ble utsatt for en 10% SDS-PAGE og elektroforetisk overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranene ble først inkubert med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann (TBS). Etter vasking tre ganger i 0,1% Tween 20-TBS (TBST), ble membranene inkubert med forskjellige primære antistoffer separat ved 4 ° C over natten, fulgt med det tilsvarende sekundære antistoffer separat (1:2000) i 1 time ved romtemperatur og antistoff-bundet proteiner ble oppdaget av ECL system (Amersham Biosciences, Little Chalfont Buckinghamshire, UK).
Prøvepreparering og protein utvinning og konsentrasjon
den cellulære utvinning fra LNCaP og LNCaP-s celler og fremstillingen av den totale cellelysat ble utført som tidligere beskrevet av [17]. Proteinbestemmelse ble gjort ved hjelp av Pierce BCA-proteinanalyse-reagens (Rockford, IL, USA).
IEF og SDS-PAGE
Prøvene ble fortynnet til et totalvolum på 250 pl, 0,2% Pharmalyte , 8 M urea, 0,3% DTT, 2 M CHAPS og et spor av bromfenol-blått (Sigma). En mengde på 100 ug protein ble applisert på hver strimmel via rehydratisering ved hjelp av ikke-lineær pH 3-10 Klar Strip IPG, strimler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Fokusering ble utført for totalt 45 500 Vh i en protean IEF celle (Bio-Rad). Prefabrikkerte gels (12,5% homogen Tris-HCL Criterion) SDS-PAGE (Bio-Rad) ble kjørt ved hjelp av en Criterion Dodeca celle gelapparatur (Bio-Rad). Totalt 4 gels ble kjørt per prøve gruppe. Elektroden rennende buffer var 25 mM Tris, 192 mM glysin, 0,1% vekt /volum SDS. Gelene ble kjørt ved 250 V i ca. 1 time til bromfenol blå markøren nådde bunnen av gelen ved en temperatur på ca 15 ° C. Proteinene ble visualisert ved sølvfarging som beskrevet av [18].
Gel skanning og bildeanalyse
2-DE geler ble skannet på 100 mikrometer oppløsning (12-bits /pixel) med en GS -710 laserdensitometer (Bio-Rad). Data ble analysert ved hjelp PDQuest ™ programvare versjon 7 (Bio-Rad). Etter automatisk gjenkjenning av alle protein flekker, ble gel-bildene nøye redigert. De enkelte proteiner mengder ble uttrykt som ppm av den totale integrerte OD. Alle 2-DE kartene ble matchet og evaluert uavhengig. Den metodiske reproduserbarhet 2-DE-analyse ble bestemt ved anvendelse gruppe korrelasjonsanalyse. I korthet er den totale optiske tetthet direkte korrelert til det totale proteinkonsentrasjonen. Mindre forskjeller i gel lasting, driftsforhold, og sølvfarging kan påvirke prøve sammenligninger og påvirker 2-D-gel reproduserbarhet. Fire geler ble kjørt fra hver behandlingsgruppe og sammenligninger av intensiteten av passet flekker mellom 2-DE geler ble utført ved anvendelse av korrelasjonskoeffisienten analyse. En korrelasjonskoeffisient ble målt mellom to geler basert på optiske densiteter av de samme punkter i de to geler som sammenlignes. En korrelasjon koeffisient på 1 vil innebære at de to prøvene som sammenlignes er identiske. I en gruppe bestående av 4 prøver, et maksimum på seks parvise sammenligninger er mulig. Den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisient blant smsDX prøvene var 0,85 (n = 6 gel par, rekkevidde 0,80 til 0,92).
Massespektrometri analyse
Proteiner ble identifisert med en vMALDI-LTQ instrument (Thermo Electron , San José, California, USA). Spot plukking, avfarging, fordøyelse, utvinning, prøveopparbeidelse og spotting på MALDI målet platene ble utført ved hjelp av en spothandling arbeidsstasjon (Ettan Spothandling arbeidsstasjon, GE Healthcare) og en standard protokoll ved GE Healthcare. Platen inneholdende de kombinerte ekstraktene ble inndampet til tørrhet. Hver prøve ble fremstilt ved å utgjøre de tørkede peptider i 2,5 mL av matriseoppløsning (2,5 mg /ml av α-cyano-4-hydroksy-kanelsyre (Sigma) i 50% acetonitril inneholdende 0,05% TFA). 2,0 ul prøve ble oppdaget på en ren MALDI mål glideflate og fikk tørke. Prøvene ble analysert med en vMALDI-LTQ (Thermo Electron, San José, California, USA). Analysen ble gjort ved hjelp Xcalibur 1.4 programvare i dataavhengig modus. En undersøkelse scan (MS) ble etterfulgt av MS /MS-skanninger på de 5 mest tallrike ioner. Denne strengen av 6 skanne hendelser ble gjentatt seks ganger for hver prøve spot. Dynamisk Utelukkelse ™ sikres at totalt 30 forskjellige peptider ble valgt ut og fragmentert for hver prøve. MS-spektra ble oppsamlet i den 900-2000 Da massen rekkevidde mens massen området for MS /MS-spektra ble velges automatisk av systemet basert på en Q-verdi på 0,25. Standarden kollisjonsenergi på 38 ble satt for alle analyser. En frist på 5 minutter /prøven ble valgt, om ikke 30 MS /MS spektra kan overtas. Database søk ble gjort ved hjelp av både maskot og Sequest søkealgoritmen mot den menneskelige sesjon i IPI protein database (versjon 2.38). De to søkene ble sammenlignet i egenutviklet software Promiscuous MS /MS. Minimum to peptider og en maskot score på 45 var nødvendig for et protein for å bli akseptert som identifiseres.
Resultater
Etablering av androgen-uavhengig cellelinje, LNCaP-s og påvisning av AR , CGA og NSE uttrykk i LNCaP-s celler
for å møte den naturlige utviklingen av prostatakreft fra androgen følsomme for androgen selvstendig stat, er svært viktig for
in vitro
studie en prostatakreft cellemodell . Så vi dyrket en LNCaP-s cellelinje fra en foreldre prostatakreft cellelinje LNCaP i en androgen-deprivasjon tilstand. NE-celler er karakterisert ved en neuronal-lignende fenotype som produserer og utskiller en serie av nevropeptider som er involvert i tumor proliferasjon, transformasjon og metastase [19]. De morfologiske karakteristika viste en neuronal morfologi med kompakt avrundede celle organer, har utvidet og fine forgrenede prosesser. Dermed androgen-sensitive LNCaP celler kjøpt en NE-lignende fenotype (figur 1) LNCaP-s i en androgen-reduserende tilstand. NE-lignende celler, ble undersøkt ved å teste markører for NED, kromogranin A (CGA) og neuron-spesifikk enolase (NSE). Etter dyrking i androgen-redusert tilstand, LNCaP-celler viste en redusert ekspresjon nivå av AR, en øket NSE uttrykk nivå, men CGA med ingen signifikant ekspresjon. Figur 1 viser forskjellige uttrykk av AR, CGA og NSE i LNCaP-s celler.
Foreldre LNCaP celler har en epitheial morfologi og LNCaP-s celler viste en neuronal morfologi. AR, CGA og NSE uttrykk i LNCaP og LNCaP-s celler undersøkt ved RT-PCR og Western blotting.
smsDX hemmet invasivitet av prostata kreft celler
Det er vel etablert at somatostatin og dets analoge virkninger på proliferasjon av prostata kreftceller [20]. Men somatostatin-effektene på invasivitet ikke blitt undersøkt. For å vurdere effektene av smsDX på invasivitet av prostatakreftceller vi brukte sårheling analysen og Matrigel ™ invasjon assay Det dekkede området i såret, og antallet celler som invaderer gjennom en Matrigel kammer var betydelig mindre for celler behandlet med smsDX enn de var for kontrollceller som ble behandlet med bærer i LNCaP og LNCaP-celler s (figur 2 og 3). Inhiberingen av smsDX viser en doseavhengig måte med celletallet invaderende egenskaper i både LNCaP og LNCaP-celler s. Disse resultatene tyder på at smsDX redusert invasivitet av prostatakreftceller.
Representative photomicrographs demonstrere sårheling i LNCaP celler (A) og LNCaP-s celler (B). Monolag av LNCaP /LNCaP-s celler ble avbrutt med steril pipette tips til create uniformand behandlet med PBS eller 1-10 nM smsDX i 24 timer.
Matrigel invasjonen data når LNCaP /LNCaP-s celler i øvre brønn ble inkubert i serumfritt medium og nedre brønn ble fylt med serumfritt medium og 1-10 nM smsDX eller PBS. Etter 24 timer ble antall celler som invaderte gjennom Matrigel tellet i minst 10 felter pr brønn. Representative fotografier viser LNCaP (A) og LNCaP-s (B) celler som invaderte gjennom Matrigel. Redusert fra × 100.
2D gel elektroforese analyse
Figur 4 viser representative 2D gels av kontroll og smsDX prøver i LNCaP og LNCaP-s celler. Tre replikater ble kjørt for hver gruppe, kontroll og smsDX. De smsDX effekter på LNCaP og LNCaP-celler s ble sammenlignet separat med kontrollgruppen ved bruk av en Mann-Whitney-testen.
hel-celle-lysat ble utsatt for 2-DE hjelp av IPG strimler pH 3-10 i den første og 12,5% SDS polyakrylamid gel i den andre dimensjonen. A, Foreldre LNCaP celler, B, derivative LNCaP-s celler. C, LNCaP + smsDX, D, LNCaP-s + smsDX.
Proteiner forskjellig uttrykt mellom LNCaP og LNCaP-s celler
Totalt 222 plasser ble vellykket identifisert ved hjelp 2DE- baserte MS. I den første analyse ble det smsDX-behandlede LNCaP-celler sammenlignet med LNCaP kontrollgruppen ved bruk av en Mann-Whitney-testen. 56 proteiner ble funnet å være forskjellig uttrykt i LNCaP og LNCaP-s (tabell S1). I den andre analysen, 104 og 86 proteiner, hver for seg, ble funnet differensielt uttrykt i LNCaP-celler og LNCaP-celler etter s smsDX behandling (tabell S2A og S2B tabell). Uttrykket av spesifikke isoformer av metabolske enzymer er blitt vist å være avgjørende for tilpasning av kreftceller til endringer i næringsstoffer, spesielt for glykolytiske enzymer [21]. Så isoformer av proteiner ble også oppført i denne tabell. Det samme proteinet ble noen ganger funnet i flere avsluttende flekker på 2de geler, er det mulig på grunn av posttranslasjonell modifisering av proteinet etter stress.
femti-seks proteiner ble funnet ned-uttrykte (mer enn 1,2 ganger endring) i LNCaP-s celler i forhold til foreldre LNCaP celler, som er oppført i tabell S1.
Proteiner både i LNCaP og LNCaP-s celler påvirkes av smsDX inkubasjon med en fold endring ≥1.2 ble oppført i tabellen S2A og bord S2B .
Sortert funksjoner av proteiner i effekten av smsDX på prostatakreft (LNCaP-er) celler etter ADT behandling
de ulike funksjonene til proteiner med tiltredelse kode gå til nettstedet http: //www.uniprot.org/uniprot/. Proteinene ble kategorisert som er identifisert på grunnlag av deres kjente biokjemiske funksjoner inkludert metabolisme, signale transduksjon, opprettholdelse av cellestrukturen, transkripsjonsregulering og cellesyklusregulering. Mesteparten av androgen deprivasjon stresset proteiner ble nedregulert etter ADT behandling. Når vi utforsket disse proteinfunksjoner i nettstedet UniProtKB /Swiss-Prot, overraskende har de fleste av proteinene som påvirkes av ADT behandlingen ble funnet å være involvert i cellemetabolisme og mitokondriefunksjon regulering. Basert på de antatte funksjoner i KEGG pathway database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), tabell S3 (A, B, C) ble hentet fra tabellen S2A og bord S2B å markere likheter /forskjeller i effekten av smsDX mellom LNCaP og LNCaP-s cellelinjer. Tabell S3A oppført førtiåtte vanlige proteiner mellom LNCaP og LNCaP-s celler etter eksponering for smsDX. Tabell S3b, S3C listet opp de forskjellig berørte proteiner i LNCaP og LNCaP-s celler, hver for seg.
Androgen deprivasjon kan påvirke mitokondrie protein uttrykk, for eksempel HSPD1, ETFA, GLUD1, PMPCB og et al. Disse proteinene ble funnet å tilhøre mitokondrielle proteiner som involverer i glukose metabolisme, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og indre mitokondrie-mediert apoptotiske funksjon. Proteinene med viktige roller i cellen metabolisme, inkludert energi (APRT, ATP5B, CKB, Tubb) lipid (ACAT2, ACADM, PRDX6), glukose (ENO1, TPI1) og aminosyre og proteinsyntese (PHGDH, EIF5A, EIF1AY) ble funnet nedregulert i LNCaP-s celler. Noen av metabolske enzymer som er involvert i TCA ble også identifisert. ADT behandling fører til en nedgang i proteinuttrykk av flere ER anstand, inkludert GRP78, ERP29, PDIA1 og PDIA3 protein.
Validering av proteiner berørt av smsDX og ADT behandling i prostata kreft celler med Western blotting
proteiner i LNCaP-s celler involverer i ulike signalveier ble identifisert i denne studien, kan disse proteinene bli regulert av smsDX på annen endring brett som er oppført i tabell S2. Validering av proteiner berørt av smsDX og ADT behandling i prostatakreftceller ble utført ved Western blotting. Flere mitokondrie proteiner, ER proteiner og proteiner som involverer metabolisme ble valgt til å oppdage for validering med immunoblotting. Figur 5 viser at TCTP, STMN1, og CXB3 i LNCaP celler etter ADT ble nedregulert og TOM40, GRP78 og VDAC2 som involverer i mitokondrie aktivitet i LNCaP-s celler var oppregulert etter når de ble behandlet med smsDX.
A, Nedre uttrykk for protein TCTP, STMN1, og CXB3 i LNCaP celler etter ADT i LNCaP-s celler. B, Ned regulert uttrykk for TOM40, GRP78 og VDAC2 i LNCaP celler ved androgen-deprivasjon, opp regulerte uttrykk i LNCaP-s celler ved smsDX behandling.
metabolske veier regulert av somatostatin derivat (smsDX) i prostata kreft celler
Basert på KEGG veien database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), presenterte vi et diagram av metabolske veier regulert av smsDX i prostatakreft fra androgen avhengige til CRPC status (figur 6). Enzymene i sirkel ble identifisert ved 2-DE MS i denne studien.
Enzymer og metabolitter som er en del av glycosis, fett Acide syntese og TCA syklus vises. G6PD, glukose-6-fosfat-dehydrogenase 1. ENO1, Alpha enolase. PPP, pentosefosfateveien pathway. ACAT2, Acetyl-CoA acetyltransferase. ACAMD, acyl-CoA dehydrogenase. IDH2, isocitrat dehydrogenase [NADP]. MDHM, Malate dehydrogenase. GLUD1, Glutamat dehydrogenase1. α-KG, α-ketoglutarat. Dette forenklede diagrammet er basert på KEGG veien database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Enzymene i sirkel ble identifisert ved 2-DE MS i denne studien.
Diskusjoner
Androgen spiller en avgjørende rolle i prostata kreft vekst, så androgen deprivasjon og blokaden av AR signale aksen er i dag den viktigste behandling for prostatakreft og dens progresjon. Det er godt dokumentert at klinisk androgen-deprivasjonsterapi er forbundet med økt NE differensiering i prostata karsinomer, og er involvert i overgangen til androgen uavhengighet [22], NE celler er karakterisert ved en neuronal-lignende fenotype: de er ikke-proliferative og uttrykke neuronale-lignende proteiner, så som NSE og CGA. Androgen deprivasjon kan påvirke serum CGA nivåer for ulike grad i prostata kreft [23]. Overekspresjon av NSE i LNCaP-s i vår studie ble funnet i utviklingen av NED fra androgenavhengige LNCaP-celler. I denne studien, etter opp til 10 passasjer LNCaP celler i en redusert androgen tilstand ble NE-lignende karakteristikker av LNCaP-s identifisert av en neuronal morfologi og endret uttrykk for AR og NSE.
Effektene av somatostatin hemming på kreftcelle levedyktighet og spredning har blitt godt undersøkt, men så vidt vi vet, hadde sin effekt på invasivitet ikke undersøkt. Ved hjelp av sårtilheling og Matrigel invasjonen assay vi observert at smsDX hemmet invasivitet av både LNCaP og LNCaP-s celler. Selv om den eksakte mekanismene for smsDX indusert undertrykkelse av invasivitet er foreløpig ikke klart, kan det være på grunn av reaksjoner på skadede mitokondrielle funksjoner. I våre tidligere studier [7], [24], smsDX regulert mitokondrielle og relaterte proteiner både i androgen avhengige og uavhengige prostata kreft celler, slik at kreft-assosiert endringer i stoffskiftet er muligens ansvarlig for celle spredning og overlevelse signaler i tilbakevendende prostatakreft og CRPC.
for å bestemme regulere metabolske effekter av smsDX på utviklingen av prostatakreft fra androgen-avhengige til androgen uavhengig mellommann, vi spilte to-dimensjonal elektroforese (2-dE) etterfulgt av MALDI-TOF massespektrometrisk analyse. Etter sammenligning av protein uttrykk i LNCaP-s og dets foreldre LNCaP celler, ble femtiseks proteiner funnet å være forskjellig uttrykt opp til 1,2 ganger endring som viste i tabell S1. Disse proteiner ble sortert i henhold til deres forskjellige funksjoner i cellemetabolisme, inkludert sukker, energi, lipid og aminosyre prosess. Resultatene tyder på at androgen-regulert metabolske endringer er de viktigste forskjellene under utviklingen av prostatakreft fra androgen-sensitive til androgen-resistent status. De er like og forskjellige effekter forårsaket av smsDX ble funnet mellom LNCaP og LNCaP-s celler. Stress forårsaket av androgen deprivasjon og smsDX til prostatakreft cellemiljøet kan muligens skyldes mitokondriefunksjon skader og aktivere AMPK sti i prostatakreftceller. Mitokondrie prosesser spiller en viktig rolle i tumor initiering og progresjon. Økt metabolsk aktivitet er et kjennetegn på prolifererende kreftceller [25]. Så undertrykke kreftcellen metabolsk aktivitet gir en alternativ strategi for CRPC scenen. ADT for prostatakreft skyldes unormal mikro tilstand lokke fram svar fra tumorcelle for å påvirke metabolsk aktivitet. Disse tilpasningene optimalisere svulst celle metabolisme å få energi og næringsstoffer fra svulstens mikromiljø. Flere rapporter har vist at androgen biosyntese og AR signalering i prostatakreftceller er intimt påvirkes av lipogenese [26] – [28]. Så rettet mot mulige underliggende molekylære mekanismene som knytter metabolisme kunne forenkle videre utvikling av lovende terapeutiske tilnærminger for CRPC status.
Basert på de dataene vi samlet her, har vi funnet smsDX regulert PI3K /AKT /mTORC1 sti og TCA syklus via opp og ned regulere ulike metabolske proteiner som er oppført i tbale S2A og bord S2B. I prostatakreft AKT aktiveres via PI3K veien som har dukket opp som en kritisk vei for celle overlevelse. Fjerne androgen støtte fra LNCaP celler utløser en rekke hendelser, inkludert cellesyklus arrest og økt PI3K /Akt aktivitet, som kulminerte i den endelige kjøpet av androgen- uavhengig fenotype [29]. Aktivert PI3K /AKT fører til økt glukoseopptak og glykolyse [30] .Dette sti fremmer også glukose karbon flux inn biosyntetiske veier som er avhengige av funksjonell mitokondrie metabolisme, inkludert fettsyre, kolesterol og isopronoid syntese alle krever acetyl-CoA. AKT aktiverer også ATP-citratelyase (ACL) fremme konvertering av mitokondrie-avledet citrate til acetyl-CoA for lipid syntese. mTORC1 er en godt karakterisert cellevekst regulator fungerer som nedstrøms PI3K /AKT, har mange effekter interwined med mitokondrie metabolisme. mTORC1 er best kjent for å øke proteinsyntesen [25]. Alpha enolase (ENO1), også kjent som pyruvat dehydrogenase fosfatase, er det avgjørende for cellulær energi metabolisme [31]. ENO1, som en viktig glycolytic enzym, spiller en avgjørende rolle i anaerob glykolyse. I denne studien, kan ENO1 bli opp regulert av smsDX, som viste at smsDX har en regulerende effekt på glykolyse i prostatakreftceller.
TCA syklus er en sentral sti i metabolismen av sukker, fett og amino syre, TCA syklus metablites resultere i redusert cellulær differensiering.
