Abstract
cytostatika for kreft er begrenset av alvorlige, noen ganger livstruende, bivirkninger som oppstår toksisitet til sensitive normale celler fordi behandling ikke selektive for ondartede celler. Så hvordan kan de bli selektivt forbedres? Alternative farmasøytiske preparater av anti-cancermidler har blitt undersøkt for å forbedre konvensjonell kjemoterapi. Disse formuleringene er forbundet med problemer som alvorlige toksiske bivirkninger på friske organer, legemiddelresistens og begrenset tilgang på stoffet til tumor nettsteder antydet behovet for å fokusere på stedsspesifikke kontrollerte stoffet leveringssystemer. Som svar på disse bekymringene, har vi utviklet en ny medikamentleveringssystem basert på magnetiske erytrocytter konstruert med en viral pigg fusjonsprotein. Denne nye erytrocytt-basert medikament leveringssystem har potensial for magnetstyrt stedsspesifikk lokalisering og svært effektiv fusjon evne med målrettede celler. Her viser vi at erytro-magneto-HA virosomer levering av legemidler systemet er i stand til å feste og sikring med målcellene og å effektivt slippe terapeutiske forbindelser inne i cellene. Effekten av anti-kreft narkotika næringsdrivende økes og dosen som kreves er 10 gang mindre enn det som trengs med konvensjonell terapi
Citation. Cinti C, Taranta M, Naldi jeg, Grimaldi S (2011) Nylig Konstruert magnetiske Erytrocytter for vedvarende og målrettet levering av anti-kreft terapeutiske forbindelser. PLoS ONE 6 (2): e17132. doi: 10,1371 /journal.pone.0017132
Redaktør: Steven Ellis, University of Louisville, USA
mottatt: 12 oktober 2010; Godkjent: 21 januar 2011; Publisert: 23 februar 2011
Copyright: © 2011 Cinti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
suksess for enhver medisinsk behandling avhenger ikke bare av den farmakokinetiske /farmakodynamiske aktiviteten av det terapeutiske middel, men i stor grad, på biotilgjengeligheten ved virkningsstedet i det menneskelige system [1] – [4]. I det siste har alternative farmasøytiske formuleringer av antikreftmidler blitt undersøkt for å forbedre konvensjonell kjemoterapi. I konvensjonell /nåværende behandling oral tabletter, kapsler og injiserbare formuleringer brukes for levering anti-kreft narkotika. Disse formuleringene er forbundet med problemer som alvorlige toksiske bivirkninger på friske organer, vanskeligheter i klinisk administrasjon, legemiddelresistens og begrenset tilgang på stoffet til tumor nettsteder antydet behovet for å fokusere på stedsspesifikke kontrollert legemiddelleveringssystemer.
Drug leveringssystemer (DDSS) som lipid- eller polymerbaserte nanopartikler har blitt utformet for å forbedre de farmakologiske og terapeutiske egenskaper av legemidler som administreres parenteralt. Størstedelen av DDS for tiden er godkjent for parenteral administrering faller i kategorien av liposomale eller lipid-baserte formuleringer eller terapeutiske molekyler knyttet til polyetylenglykol (PEG) [5] – [7]. Selv om medikamentløseligheten ikke kan være en begrensende faktor for systemer som polymer-legemiddelkonjugater, hvori medikamentet er kjemisk knyttet til bæreren, kan det være en viktig faktor i liposomal DDS. Bæreevne av liposomer er ikke effektiv for meget store terapeutiske molekyler, slik som proteiner, spesielt når små liposom diameter er ønskelig av hensyn til biodistribusjon. Biologisk nedbrytbar nano /mikropartikler av poly (D, L-laktid-ko-glykolid) (PLGA) og PLGA-baserte polymerer er vidt undersøkt som bærere for kontrollert levering av makromolekylære terapeutiske midler, slik som proteiner, peptider, vaksiner, gener, antigener og vekstfaktorer . Litteraturen anført mange fordeler og ulemper ved PLGA og PLGA-baserte avleveringssystemer for avgivelse av makromolekylære medikamenter [8], [9]. Drug innkapsling, partikkelstørrelse, additiver som tilsettes ved formulering, molekylvekt, forholdet mellom laktid og glykolid grupper i PLGA og overflatemorfologi kunne påvirke frigjøringsegenskaper [10]. PLGA har en negativ effekt på proteinstabilitet ved tilberedning og lagring, hovedsakelig på grunn av syre-katalysert natur sin degradering [11]. I tillegg prosesseringsbetingelser som benyttes i produksjonen av PLGA stoffet levering kjøretøy ha skadelige effekter på visse protein sekundære strukturer [12].
I de siste årene, cellebaserte levering systemer har også blitt utviklet. Bruken av celler som terapeutiske bærere har utviklet seg som en tydelig konsept og leveringsmåte [13] – [17]. Cellebaserte kjøretøyer er spesielt attraktive for levering av bio-terapeutiske midler som er vanskelige å syntetisere, har redusert halveringstider, penetrering begrenset vev eller blir hurtig inaktivert ved direkte
in vivo
innledning. Som et spørsmål om fakta, besitter celle-baserte avleveringssystem en rekke fordeler, inkludert forlengede leveringstider, målretting av medikamenter til spesialiserte cellekamre og biokompatibilitet. Anvendelse av en fysiologisk bærer for å levere terapeutiske midler i hele kroppen til både forbedre deres effekt samtidig minimere uunngåelige skadelige bivirkninger, er en tiltalende perspektiv som kan bli brukt i mange kliniske situasjoner. Oppførselen av blodceller, som et leveringssystem for flere klasser av molekyler (dvs. proteiner, inkludert enzymer og peptider, terapeutiske midler i form av nukleotidanaloger, glukokortikoid analoger), er blitt undersøkt i stor utstrekning som de har flere egenskaper, som gjør dem unike og nyttige bærere [18] – [20]. I sammenheng med ekstrakorporeal farmakoterapi, er den mest lovende tilnærming ved bruk av autoerythrocytes som utviser unike morfologiske og fysiologiske egenskaper. Anvendelse av erytrocytter som beholdere for forskjellige medikamenter reduserer risikoen for bivirkninger og patologiske immunreaksjoner mot innkapslede midler, og dessuten gjør det mulig modifikasjon av deres farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper for å redusere doser og intervaller mellom dem. Effekt og sikkerhet av farmasøytiske midler innført i erytrocytter har blitt bekreftet i mange
in vivo
studier [20]. De magnetiske erytrocytter, som følge av den ko-innkapsling av medikamenter med enkelte ferrofluids- som kobolt-ferritt og magnetitt, har blitt rapportert å dirigere det innkapslede legemiddelet hovedsakelig i de ønskede områder av kroppen ved hjelp av et eksternt magnetfelt [21] – [23]. Bruk av ultralydbølger i regionen der magnetiske erytrocytter akkumulere kan indusere kjøretøy ødeleggelse og utgivelsen av et stoff på organ eller vev nivå [24], [25]. I tillegg til medikamentet målretting har denne metoden blitt evaluert for induksjon av lokal iskemi i tumorer, noe som kan derfor bidra til å fremme tumorremisjon på grunn av redusert lokal blodstrøm [22]. Men potensialet evne celle bærere for å gi stedsspesifikk eller målrettet levering av legemiddelselskap har ennå ikke fullt utforsket. Utvikling av celle målrettingsstrategier vil ytterligere fremskritt celle i kjøretøyer, utvide anvendbarheten av denne tilnærmingen levering og potensere terapeutiske resultater.
I et forsøk på å forbedre målretting og effektiv frigjøring av terapeutiske forbindelser ved intra-cellulært nivå av målceller, har vi utviklet en ny magnetfelt-kontrollerte erytrocytt-basert medikament leveringssystem. Feste en viral pigg fusjon glykoprotein på erytrocytter «membran og innkapsle superparamagnetiske nanopartikler og narkotika inn i erytrocytter, har vi produsert nye erytrocytter baserte legemiddelleveringssystem, erytro-magneto-HA virosomer, som har potensiale for magnetstyrt stedsspesifikk lokalisering og svært effektiv fusjon evne med målrettede celler. Tilstedeværelsen av viral fusjon glykoprotein som gjør bruk av ultralydbølgen unødvendig for å indusere «kjøretøy» ødeleggelse for frigivelse av terapeutiske forbindelser ved målsetet. Her viser vi hvordan erytro-magneto-HA virosomer oppfører seg noe beslektet med en omhyllet virus i deres evne til å invadere vertsceller. Disse konstruert erytrocytter er i stand til å fusjonere med cytoplasmatic membran av målceller i en meget kort tid og frigjøre de magnetiske nanopartikler og terapeutiske forbindelse inne i disse cellene. Den totale mengden av anticancermedikament 5-Aza-2-deoksycytidin har en terapeutisk effekt 10 ganger mindre enn for standard terapi, som tyder på at dette nye medikamentavleveringssystemet kan være i stand til å redusere cytotoksiske effekter av legemidler ved å øke biotilgjengeligheten av terapeutiske forbindelser på stedet av action og bedre farmakokinetikk. Denne nye erytrocytt-basert medikament leveringssystem kan potensielt brukes i mange kliniske innstillinger, inkludert neoplastiske sykdommer, sykdommer forårsaket av infeksjon av et menneske eller dyr virus og hjerte- og karsykdommer.
Materialer og metoder
Influensa virus vekst og isolering av Hemagglutinin (HA) glykoprotein
Influensa virus hentet fra allantoiske væske av 10 dager gamle embryon egg (egg ble hentet fra kylling fabrikk i Roma, Italia) ble pelletert ved ultrasentrifugering og pelleten ble resuspendert i okta (etylenglykol) –
n
-dodecyl monoeter (C
12E
8) og fikk stå over natten for å tillate fullstendig oppløseliggjøring av den virale membran. Suspensjonen ble forsiktig homogenisert og ultracentrifugated for å pelletere ned de virale nukleokapsider. Deretter ble suspensjonen virosom (supernatant inneholdende HA-protein) ble renset ved ultrasentrifugering på en diskontinuerlig sukrose-gradient (50% og 10% sukrose). Ved grenseflaten av sukrose lag, konsentrerer HA glykoprotein. Etter fjerning av dette laget, har HA blitt dialysert mot buffer og sterilisert ved filtrering.
Erytrocytter lysering og inkorporering av HA glykoprotein, superparamagnetiske nanopartikler og 5-Aza-2-dC medikament
humane røde blodceller (RBC) ble oppnådd fra blod fra friske donorer ved sentrifugering ved 1700 rpm i 10 min ved 4 ° C. Fersk innsamlede RBC ble vasket to ganger i fysiologisk fosfatbuffer saltvann (1X PBS) (1,37 M NaCl, 57 mM KCl, 54 mM Na
2HPO
4, 45 mM KH
2PO
4 pH 7,4 ).
2 x 10
9 RBC ble lysert i 300 ul lyseringsbuffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, 1 mM MgCl
2 ved pH 7,2) i 60 minutter ved 0 ° C . Den isotonisitet ble deretter gjenopprettet ved å tilsette 65 mL av en X forsegles buffer (1,37 M NaCl, 57 mM KCl, 54 mM Na
2HPO
4, 45 mM KH
2PO
4, 15 mM MgCl
2 pH 7,4), supplert med 0,1 mg 100 nm rød-merket superparamagnetiske nanopartikler (nano-screenMAG, Chemicell Company), 1 mikrogram HA influensa viral spike glykoprotein, og 0,38 eller 30,5 mikrogram 5-Aza-2-dC ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Suspensjonen ble inkubert i 45 minutter ved 37 ° C under forsiktig omrøring. Forseglede RBC (ghosts), inneholdende HA-fusjonsproteinet på lipidmembran og både 5-Aza-2-dC og superparamagnetiske nanopartikler innsiden (erytro-magneto-HA virosom), ble oppsamlet ved sentrifugering ved 10 000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Erytro-magneto-HA-virosomer ble vasket to ganger med 1 x PBS ved sentrifugering ved 9000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og resuspendert i 1 x PBS inneholdende 1% FCS.
Kinetikk av Erythro-magneto-HA-virosomer fusjon med HeLa-celler: analyse Spectrofluorimeter
Erythro-magneto-HA-virosomer ble fremstilt som beskrevet ovenfor, og ble merket ved tilsetning av oktadecyl rhodamin (R18). Erytro-magneto-HA-virosomer /R18 lastet ble tilsatt til HeLa-celler. Total lipid i erytro-magneto-HA-virosomer /R18 ble kvantifisert ved mengden av oktadecyl Rhodamin (R18) i deres membran, basert på det faktum at R18 står for 15% av den totale vekt av lipider på den. Erytro-magneto-HA-virosomer /R18 ble oppløst ved tilsetning av 0,1% (sluttkonsentrasjon) Triton X-100 i PBS, og fluorescensen av R18 (eksitasjon ved 560 nm og emisjon ved 590 nm) ble målt ved bruk av en aliquot av oppløsning med et spektrofluorometer Perkin Eimer 650-40), kalibrert med R18 standardløsninger inneholdende 0,1% Triton X-100. Graden av R18 selvlukkende i hvert erytro-magneto-HA-virosomer ble undersøkt ved sammenligning av R18 fluorescens før og etter oppløsning av erytro-magneto-HA-virosomer med 0,1% Triton X-100 i PBS. Erytro-magneto-HA-virosomer ble tilsatt til HeLa-celler. Den kinetiske av erythro-magneto-HA virosomer fusjon med HeLa-celler ble beregnet som% av R18 fluorescens dequenching (FDQ) med 560 og 590 nm som eksitasjon og emisjonsbølgelengder hhv. Som kontroll vi forberedt R18-merkede magnetiske erytrocytter uten rekonstituert HA fusjonsprotein. Den kinetiske fusjon av disse magnetiske erytrocytter med HeLa-celler ble også analysert.
HPLC-analyse av 5-Aza-2-dC innlemmelse i Erythro-magneto-HA virosomer
Kjemi og løsninger.
5-Aza-2-deoksycytidin (5-Aza-2-dC, Decitabine) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Ammoniumacetat var fra Carlo Erba (Milan, Italia). HPLC-kvalitet acetonitril (MeCN) var fra Rathburn (Walkerburn, UK).
HPLC-analyse av Erythro-magneto-HA virosomer inneholder decitabine.
2 × 10
9 erythro-magnetogalvanisk HA-virosomer ble inkubert med 200 ul lyseringsbuffer for å frigjøre innlemmet 5-Aza-2-dC medikament og sentrifugert ved 10000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble gjenvunnet og anvendt for HPLC-analyse, eller lagret i en -80 ° C fryser inntil analyse.
lager i standardløsninger av decitabine ved konsentrasjon på 114, 228, 456 og 1140 ng /ml, ble fremstilt hver for seg i vannoppløsning eller lysis buffer og lagret ved -80 ° C inntil analyse.
toppareal-forhold på sample /5-Aza-2-dC (decitabine, standard) ble anvendt for kvantifisering. Deteksjonsgrensen (LOD) ble definert som tre ganger den signal-til-støy-forhold. Den laveste grensen for kvantifisering (LLOQ) ble definert som den laveste nivået av analytt som kan detekteres pålitelig og reproduserbar med en presisjon på ≤20% og nøyaktighet på 80-120%.
Instrumentation.
HPLC-system bestående av en Dionex (Sunnyvale, CA, USA) 3000 Ultimate serie LC er koblet til en lineær ion trap LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, USA) massespektrometer utstyrt med en elektrospray ione kilde. Data ble ervervet og behandlet med Excalibur 2.1-programvaren. Forbindelsene ble separert på en Gemini C18 (150 mm-2,0 mm ID) og 3 um partikkelstørrelse (Phenomenex, Torrance, CA, USA) som er beskyttet av en Phenomenex Gemini C18 (4,0 mm-2,0 mm ID) og 3 um partikkelstørrelse vakt patron . HPLC-metoden benyttet gradienteluering; mobil fase oppløsningsmiddel A var vann med 0,1% maursyre og mobilfase B var acetonitril med 0,1% maursyre. Den innledende mobile fasesammensetning av 92% oppløsningsmiddel A og 8% løsningsmiddel B ble opprettholdt i 2 minutter. Mellom 2 og 9 min prosentandelen av mobil fase B ble øket til 35% og deretter tilbake til start den mobile fasesammensetningen i 0,1 minutter, med en total tid på 14 min. Kolonnen ble satt til en strømningshastighet på 0,2 ml min-1 og en temperatur på 36 ° C. Prøvevolum på 10 ul ble anvendt for alle LC-MS-eksperimenter. Massespektrometer ble operert i positiv elektrospray-modus. Den capillar temperaturen var 275 ° C og spray spenning 4,5 kV ble brukt.
Tumor HeLa celler behandlinger
Menneskelig HeLa-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD).
cellene ble holdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, ved deleforhold på 1:04 to ganger i uken.
for behandlinger, 3 ml av cellene ved en tetthet på 5 x 10
5 ble sådd i 6-brønns mikrotiterplater. To sett med eksperimenter ble kjørt parallelt for både Confocal Laser Scanning Mikroskopi (CLSM) og FACS analyse. For CLSM analyse, på bunnen av kulturplater ble det lagt dekkglass på hvilken cellene ble lar vokse.
Etter 24 timer ble kulturmediet forandret med media inneholdende 2,5 uM 5-aza- 2-dC alene eller 1 × 10
9 5-Aza-DC-lastet erytro-magneto-HA virosomer eller buffer der erytro-magneto-HA-virosomer ble resuspendert (supernatant, kontroll-2). Etter 30 minutter, 1, 6, 24, 48 og 96 timers inkubering, behandlede og ubehandlede (kontroll-1) celler ble analysert ved CLSM og FACS-analyse.
Confocal Laserscanning Mikroskopi (CLSM) analyse av fusjons hendelsene i erythro-magneto-HA virosomer med tumorceller
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP dyrket på lysbilder i nærvær av 5-Aza-2-DC-lastet erythro-magneto-HA virosomer ble vasket i 1 x PBS buffer og festes med 4 % paraformaldehyde. Cellekjerner ble kontra med DAPI og montert i antifade medium. Fluorescens og lyse-feltet bilder ble innhentet av en Leica TCS SP5 invertert mikroskop system, utstyrt med fem lasere emitting fra UV til synlig (405 Diode, Argon, HeNe 543, HeNe 594 og HeNe 633). Den DAPI fluorescens ble påvist ved eksitasjon av 405 nm og utslipp av 454 nm, mens den røde fluorescens av superparamagnetiske nanopartikler ved eksitasjon av 543 nm og utslipp av 613 nm.
Cytofluorimetric analyse (FACS analyse)
FACS-analyse ble utført på HeLa-celler behandlet med 2,5 uM 5-Aza-dC eller 1X 10
9 5-Aza-2-dC-lastet erytro-magneto-HA-virosomer og sammenlignet med de ubehandlede (kontroll -1) etter 24, 48 og 96 timers dyrkning. FACS-analyse ble også utført på HeLa-celler behandlet med buffer hvori erytro-HA-virosomer ble resuspendert for å sjekke fraværet av uinkorporert 5-Aza-2-dC medikament (kontroll-2). Behandlede og ubehandlede celler ble fiksert i etylalkohol og kjernene ble farget med 10 ug /ml propidiumjodid og inkubert med 100 pg /ml RNase i 1 time ved 37 ° C. Atom DNA innhold som skiller cellesyklus fasene ble bestemt ved flowcytometri bruke Becton Dickinson FACScan CentroII.
Etikk uttalelser
For denne studien vi ikke trenger moral godkjenning siden arbeidet ble ikke omfatter mennesker eller dyrestudier.
Denne studien ble gjennomført uten bruk av givere fra menneske frivillig materiale, menneskeblod ble hentet fra overføringer bag fra blodbanken, for de grunner vi ikke trenger informert samtykke .
Resultater
Behaviour av erythro-magneto-HA virosomer
En ny erytrocytt-basert medikamentleveringssystem som beskrives her er potensielt stand til å levere narkotika å målrette vev øker biotilgjengeligheten av terapeutiske forbindelser ved virkningsstedet fører til en bedre terapeutisk effekt med minimale bivirkninger. Humane erytrocytter ble isolert fra blodet til en frisk donor og behandlet med en hypoton løsning for å fremkalle åpning av membranporene og frigjøre hemoglobin. En blanding inneholdende Hemagglutinin (HA) virale spike-fusjonsproteiner, fluorescerende superparamagnetiske nanopartikler og den terapeutiske forbindelsen ble tilsatt i løpet av det gjenforseglbare av «spøkelse» erytrocytter. På grunn av den høye affinitet for membraner, binder hemagglutinin til cytoplasmatic membranen av erytrocytter mens magnetiske nanopartikler (grønn fluorescens) og narkotika trenge gjennom porene i «spøkelse» erytrocytter (Fig. 1).
Confocal Laser Scanning Mikroskopi ( CLSM) bilder av erytro-magneto-HA virosomer innkapsle 100 nm fluorescens-merket superparamagnetiske nanopartikler (grønn) og 5-Aza-2-dC.
for å verifisere effektiv fangst av fem-Aza-2 -DC (Decitabine) i vår erytrocytt-baserte medikamentleveringssystem og å kvantifisere utbyttet av terapeutiske forbindelse innkapslet, utførte vi HPLC-analyse (fig. 2). Væskekromatografi /tandem massespektrometri kvantifisering metode (QTOF /MS) har blitt brukt for å kvantifisere og identifisere 5-Aza-2-DC isoformer og deres nedbrytningsprodukter i henhold til fysiologiske betingelser for pH og temperatur som tidligere beskrevet [26], [ ,,,0],27].
(A) Peaks av 1,14 ng 5-Aza-dC (standard). (B) Peaks av 5-Aza-dC innkapslet i 2 × 10
9 erythro-magneto-HA virosomer. RT: retensjonstid; AA: peak teller i området. (C) Kalibreringskurve av 5-Aza-dC. Topparealet verdiene av standarder ble satt i forbindelse med det ng /10 ul av 5-aza-2-dC prøve løp. Standardløsninger som ble brukt var 1,14, 2,28, 4,56 og 11,40 ng 5-Aza-DC (svarte rhombuses). Grey trekanter viser fem-Aza-DC konsentrasjoner innenfor de to erythro-magneto-HA virosomer prøvene brukes i
in vitro
eksperimenter.
I figur 2 A og B, den toppene av både 5-Aza-2-dC (standard) og 5-Aza-2-dC lagt inn i 2 x 10
9 erytro-magneto-HA-virosomer er vist. Prøvene ble overvåket i positiv modus, noe som resulterer i arter av 1 masseenhet høyere enn de nøytrale molekyler. Data ble visualisert ved å ekstrahere de ionekromatogrammer ved m /z = 229. I standardløsning (fig. 2 A) to topper svarende til både enkelt ladet β- (I) og a-formene (II) av 5-Aza-2- -DC (m /z = 229) er til stede. I eksemplet, er en annen topp tydelig i tillegg til 5-Aza-2-dC β- og a-formene (I og II). Denne toppen tilsvarer en guanylurea derivat (III) (m /z = 219). Som tidligere vist, ekstrahert ionekromatogrammer ved m /z = 219 (guanylurea-derivater, enkelt ladede monomere arter) er ikke unike som en identifikator av guanylurea-derivater som forbindelser med m /z = 229 også fremstille fragmenter med m /z = 219 når visualisert ved massespektrometer [28]. p-former (I) av 5-aza-2-dC blitt hydratisert ved C-6 posisjonen og den ring åpnes for å frembringe en ringåpne-formylert derivat, fulgt av tap av maursyre, som deretter frembringer et guanylurea derivat (III). Deformylation av en hvilken som helst av de ringåpne formylert derivater inn i guanylurea-derivater (III) resulterer i tap av H-6 proton som maursyre. Retensjonstidene (RT) såvel som i området verdier (AA) for hver topp er vist i figur 2 A og B.
For å kvantifisere mengden av 5-aza-2-dC inneholdt i erythrocyte- baserte avleveringssystem, ble 10 pl av hver standard og prøve injisert i HPLC. Forskjellige konsentrasjoner av standarden, som strekker seg fra 0114 ng /mL (0,5 uM) til 1,14 ngμl (5 uM) av 5-aza-2-dC, ble fremstilt og toppområdet til hver 10 pl prøve ble beregnet ved hjelp av HPLC . Topparealet verdiene av standarder ble satt i forhold til det ng av 5-aza-2-dC og en kalibreringskurve ble konstruert (fig. 2 C). Figur 2 A viser området verdi (AA: 660,834) detektert ved HPLC svarende til 1,14 ng (0,5 uM) av 5-aza-2-dC standardløsning. Ulike prøver av erythro-magneto-HA virosomer ble utarbeidet og ulike mengder av 5-Aza-2-st, som spenner fra 0,5 ng /mL (2,5 mm) til 42 ng /mL (200 mm), ble lagt under det gjenforseglbare. For å vurdere den effektive mengde av 5-aza-2-dC innesluttet i erytrocytter for hvert preparat, 2 x 10
9 erytro-magneto-HA-virosomer ble lysert i 200 ul lyseringsbuffer. Den totale mengden av medikament innlemmes i 2 x 10
9 erytro-magneto-HA-virosomer var 3,6 ng eller 360 ng ved 2,5 pM eller 200 pM av 5-aza-2-dC ble tilsatt til erytrocytter under forsegles henholdsvis (fig. 2 C). Derfor effektiviteten av inkorporering for hver prøve var ca 1%.
For å teste effektiv inkorporering av Hemagglutinin (HA) på erytrocyttmembraner og dens fusjonsaktivitet, vi evaluert kinetikken av sammensmeltingen av vår konstruerte erythro-magneto -Ha virosomer med målceller. Oktadecyl Rhodamine (R18) merking ble anvendt for å bestemme blanding av erytro-magneto-HA-virosomer med HeLa-celler. Fusion har blitt rapportert som% av R18 fluorescens dequenching (FDQ) med 560 og 590 nm som eksitasjon og emisjonsbølgelengder, henholdsvis. Sammensmeltingen av erytro-magneto-HA virosomer med HeLa-celler som starter etter en svært kort periode (noen minutter) og andelen av fusjon øker eksponentielt med tiden (Fig. 3). I motsetning til dette har magnetiske erytrocytter uten Hemaglutinin (HA) ikke viser fusjonsaktivitet med HeLa-celler. Disse data tyder på at det virale spike glykoprotein (HA) renset fra influensavirus og rekonstituert i magnetiske erytrocytt kjøretøyer beholder sine fusogene egenskaper med cytoplasmatic membraner av målcellene og tildeler magnetiske erytrocytter evnen til å smelte sammen med målcellene.
5-Aza-2-DC-lastet erytro-magneto-HA virosomer ble merket med Octadecyl Rhodamine (R18) og inkubert med HeLa-celler. Fusion har blitt rapportert som% av R18 fluorescens dequenching (FDQ) med 560 og 590 nm som eksitasjon og emisjonsbølgelengder hhv. RBC: 5-Aza-2-DC-lastet magnetiske erytrocytter uten rekonstituert HA fusjonsprotein (kontroll); RBC-HA: 5-Aza-2-DC-lastet erytro-magneto-HA virosomer
Effekt av Decitabine lastede erytro-magneto-HA virosomer på tumorceller
Å. bekrefte effektiviteten og effekt av vår erytrocytt-baserte medikamentleveringssystem, behandlet vi HeLa-tumorceller, enten med 5-Aza-2-dC alene eller innkapslet i erytro-magneto-HA-virosomer. 5 x 10
5-tumorceller ble behandlet enten med 1,800 ng av 5-aza-2-dC (2,5 uM), en konsentrasjon som er vist å ha terapeutisk virkning
in vitro
, eller med 1 x 10
9 erytro-magneto-HA-virosomer inneholdende 10 ganger mindre 5-Aza-2dC (180 ng).
opptaket til målcellen, og levering av den terapeutiske forbindelse i cytoplasma av tumorceller er vist på fig. 4. Ved svært kort tid (fra 30 min til 1 time) er det fortsatt mulig å skille konstruerte erytrocytter som begynner å blande med målceller (Fig. 4 A og B). Etter 6 timer var det meste av målcellene viser erytro-magneto-HA virosomer i cytoplasma (fig. 4 C). Erytro-magneto-HA virosom, internalisert inne i «host» celle, ser ut som en viral endosomet. Membranen av erytro-magneto-HA virosomer begynner å smelte sammen med membranen til målcellen mellom 12 og 24 timer, hvoretter de fluorescerende nanopartikler og medikamentet begynner å diffundere inne i tumorceller. Etter 24 timer ble alle tumorcellene viste en sterk fluorescens i cytoplasma og noen har den typiske morfologien for tidlig apoptose. Ved 96 timer fleste kreftceller vises den karakteristiske mikrokjerner morfologi sen apoptose (Fig. 4 D).
I den venstre er skjematisk timing og virkningsmekanismen av erytro-magneto-HA-virosomer, innkapsle 100 nm fluorescens-merket magnetiske nanopartikler (grønn) og 5-aza-2-fm. I den høyre er vist CLSM bilder av erytro-magneto-HA-virosomer (grønt) etter 30 minutter (A), 1 time (B), 6 timer (C), 24 og 96 timer (D) inkubering med HeLa-celler fremhevet av DAPI farging (blå). (CTRL) Ubehandlet HeLa-celler (kontroll).
Effekten av 5-aza-2-dC rekonstitueres til erytro-magneto-HA-virosomer for å fremme apoptose i forhold til fritt medikament er vist i figur 5. HeLa-celler ubehandlet (kontroll) og behandlet med 1800 ng 5-Aza-2-dC eller med 1 x 10
9 erytro-magneto-HA-virosomer inneholdende 180 ng av Decitabine ble analysert ved FACS. Som kontroller for å vurdere mulige toksiske effekter av kjøretøyet alene på celler, ble HeLa-celler dyrket også i nærvær av bufferløsning hvori 5-Aza-2-dC-lastet erytro-magneto-HA-virosomer ble suspendert (supernatant) og med erythro -magneto-HA virosomer innkapsle bare fluorescerende magneto-nanopartikler
Ctrl (kontroll) ubehandlede celler.; Aza: celler behandlet med 1800 ng (2,5 uM) av 5-aza-2-dC; Erytro Aza: celler behandlet med erytro-magneto-HA-virosomer inneholdende 180 ng av 5-aza-2-dC; Erythro: losset 5-Aza-2-dC erythro-magneto-HA virosomer; Supernatanten: celler behandlet med buffer hvor erythro-magneto-HA virosomer ble resuspendert (kontroll 2)
Etter 96 timer bare 12,6% av celler behandlet med 1 800 ng av gratis 5-aza-. 2-dC vises apoptotiske, sammenlignet med 96% av celler når cellene ble behandlet med 180 ng i erytro-magneto-HA-virosomer. Dessuten, ved 24 timer betydelig apoptose er sett med medikamentavgivelsessystem, mens praktisk talt ingen virkning observeres for medikament alene. Disse observasjoner tyder på at erytro-magneto-HA-virosomer leveringssystemet øker den anti-neoplastiske effekt av 5-aza-2-dC ved forbedring av medikament biotilgjengelighet. Verken supernatant, hvor den 5-Aza-2-dC-lastet erytro-magneto-HA-virosomer suspenderes, og heller ikke erytro-magneto-HA-virosomer som kun inneholder fluorescerende nanopartikler har en effekt på celleproliferasjon, noe som viser at vår erytrocytt-baserte medikamentavgivelse systemet i seg selv har ingen toksisk effekt på cellene. Sammen tyder disse resultater på at denne nye erytrocytt-baserte medikamentavgivelsessystem har potensial til å øke effektiviteten og effekten av terapeutiske forbindelser.
diskusjon
cytotoksisk kjemoterapi eller radioterapi av kreft er begrenset av alvorlige, iblant livstruende bivirkninger på grunn av mangel på spesifisitet for målceller alene. En strategi for å forbedre spesifisiteten er å innkapsle de terapeutiske midler inn i et medikamentavleveringssystem i stand til å dirigere terapeutiske forbindelser til et målområde.
Carrier erytrocytter har blitt evaluert for deres bruk i medikamentavgivelse i mennesker å bevise deres sikkerhet og effekt [ ,,,0],29]. Erytrocytt-basert levering av nye og konvensjonelle legemidler er dermed opplever økende interesse i levering av legemidler og i å håndtere komplekse sykdommer, spesielt når bivirkningene kan bli alvorlige problemer [13], [19], [30]. Nylig, erytrocytter er blitt anvendt for å innkapsle det antibiotiske amikacin, og en vedvarende frigjøring fra belastede erytrocytter i løpet av en 48 timers periode ble påvist, noe som tyder på en potensiell bruk av erytrocyttene som en langsom systemisk-release system for antibiotika. Administrasjonen av amikacin ved lastet erytrocytter hos rotter fører til store endringer i den farmakokinetiske oppførsel av antibiotika [31], [32]. Erytrocytt-baserte medikamentavgivelsessystem presenterer flere fordeler: Det er spesielt effektiv i å slippe stoffer i sirkulasjon i lang tid (uker), erytrocytter har en stor fangst kapasitet, er lett bearbeides og har evne til å imøtekomme tradisjonelle og biologisk preparater [ ,,,0],18], [30]. Erytrocytter lastet med ferromagnetisk kolloid forbindelse kan magnetisk drevet ved målorganet /vev ved hjelp av et eksternt magnetfelt [21] – [23], [33] Til slutt, det finnes en anordning som tillater innkapsling av stoffer inn i autologe erytrocytter gjør denne teknologien tilgjengelig i mange kliniske settinger og konkurransedyktig i forhold til andre stoffet leveringssystemer [34].
i dette arbeidet vi peke ut en ny erytrocytt-basert medikament leveringssystem, erytro-magneto-HA virosom
