Abstract
Vår tidligere studie viste at DEK protein ble overuttrykt i kolorektal kreft (CRC) sammenlignet med normal kolorektal slimhinne. DEK ble også signifikant korrelert med prognostiske kjennetegn ved pasienter med CRC, viser at DEK spilt en viktig rolle i CRC progresjon. I dette arbeidet, vurderer vi virkningene av DEK på biologiske atferd i CRC og utforske de relaterte molekylære mekanismene. Resultatene viste at DEK ble overuttrykt i humane CRC vev, og er korrelert med Ki-67-indeksen og den apoptotiske indeks. DEK uttømming av RNAi i SW-620 og HCT116 cellene betydelig redusert celledeling, men økt celle apoptose. Oppregulering av DEK var involvert i p53 /MDM, Bcl-2 familien, og caspase veier. Vår studie viser at DEK fremmer veksten av CRC, og kan være et terapeutisk mål i CRC
Citation. Lin L, øse J, Ma Y, Jin T, Quan C, Kong J et al. (2014) mekanismene bak kreft vekst og apoptose av DEK Overuttrykte i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (10): e111260. doi: 10,1371 /journal.pone.0111260
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 26 juni 2014; Godkjent: 24 september 2014; Publisert: 23 oktober 2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Special Fund of 973 prophase Forskning fra den nasjonale Ministry of Science Technology of China (2014CB560708), er tilskudd fra National Natural Science Fond i Kina (61371067), og grunnleggende vitenskapelige forskningsfond av Jilin University i Kina (2013-01). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal karsinom (CRC) er den tredje vanligste kreftformen og den nest vanligste årsaken til kreft død på verdensbasis [1]. Livskvaliteten og 5-års overlevelse er lave i avanserte CRC selv med kirurgisk eksisjon ledsaget av kjemoterapi og strålebehandling. Tidlig påvisning av CRC er avgjørende for vellykket behandling fordi avansert høyverdig sykdom er korrelert med økt metastaser og mortalitet [2] – [4]. Derfor identifisering av nye CRC meklere og biomarkører, særlig de som er forbundet med spredning og vekst, er fortsatt kritisk for å bekjempe dødelighet av tilbakevendende sykdom. Fremdriften i kreft patogenesen kan hjelpe avdekke vitale /gyldige molekylære biomarkører som er involvert i kolorektal kreftutvikling og bidra til å utvikle og oppdage nye terapeutiske intervensjoner, og forebyggende strategier og agenter. Våre tidligere data har vist at DEK protein uttrykk er oppregulert i CRC vev [5]. Overekspresjon er særlig markert i høy grad og sene stadier av CRC, noe som gjør DEK en potensiell ny biomarkør for prognosen av CRC og et mål i kampen mot tilbakefall [5].
DEK ble opprinnelig oppdaget som målet på en translokasjon hendelse t (6; 9) i en undergruppe av akutt myeloid leukemi [6] – [7]. Nå er DEK fremstår som et medlem av en ny klasse av DNA topologi modulatorer som kan være mål og effektorer av pro-tumorigene hendelser [8]. DEK finner på kromosom 6p22.3 [9], og er en svært konservert nucleoprotein som kan fosforyleres. Består av 375 aminosyrer, er DEK hovedsakelig i kjernen eukromatin, og fortrinnsvis uttrykker i aktivt prolifererende og ondartede celler, hvor den kan nå opp til 4 til 6 millioner eksemplarer per kjerne [8]. Senere studier har identifisert flere ganger DEK som en ofte overuttrykt gen i et antall av neoplasmer [10] – [12]. Videre kan DEK utøve virkninger på mRNA-spleising, transkripsjonskontroll, DNA-skade reparasjon, differensiering, cellelevedyktighet og celle-til-celle-signalisering [11], [13] – [15]. Imidlertid har de funksjonene DEK
in vitro
i CRC cellulær oppførsel ikke blitt evaluert. Tidligere viste vi at DEK protein ble overuttrykt i 109 tilfeller av CRC vev, var signifikant korrelert med pasientenes prognose egenskaper, og var en uavhengig risikofaktor for total overlevelse [5]. Denne studien observerer uttrykk for DEK i en ny gruppe av innsamlede primære CRC, og korrelerer DEK uttrykk med Ki-67 og apoptotiske indekser, som gjenspeiler bidragene fra celleproliferasjon og celle tap, henholdsvis. Dessuten klar vi rolle DEK i CRC progresjon med DEK RNA interferens (RNAi) i en cellelinje avledet fra en CRC.
DEK er en inhibitor av p53-avhengig og-uavhengig celle senescence og apoptotiske fenotyper [ ,,,0],7], [14], [16], og transkripsjonelt oppregulert ved Rb /E2F vei, som ofte gjennomtrengt på CRC [17] – [19]. Derfor er dens ekspresjon sterkt indikerer proliferasjon og apoptose. Her definerer vi bestemte onkogene aktiviteter DEK i CRC
in vitro
, og identifisere en molekylær mekanisme som DEK bidrar til tumorvekst.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke for studien som holdt Helsinki-deklarasjonen og ble godkjent av menneskelig etikk og forskningsetiske komiteer av Yanbian University Medical College i Kina. Gjennom kirurgi samtykkeskjema, ble alle deltakerne informert om at de resected prøvene ble lagret ved sykehuset og potensielt brukes til vitenskapelig forskning, og at deres privatliv vil bli opprettholdt.
Vevsprøver
Fresh prøver fra fire tilfeller av CRC ble koblet sammen med tilstøtende noncancerous vev, og ble inkludert med rutinemessig behandlet og diagnostisert 55 tilfeller av kolorektal kreft vev som ble valgt tilfeldig fra pasienter som gjennomgår kirurgi mellom 2009 og 2012 på svulstvev Bank of Yanbian University Medical College . De patologiske parametere ble nøye gjennomgått i alle tilfellene. I alt 22 av de tilstøtende normale tykktarmsslimhinnen vev fra kreft reseksjon margin, og 18 av kolorektal adenom vev ble også inkludert. Ingen av pasientene hadde fått cellegift før operasjon eller hadde fjernmetastaser. H . E-fargede objektglass ble anmeldt av to erfarne patologer (Lin Z, Jin T) og en passende parafin blokk ble valgt for denne studien
Immunhistokjemisk (IHC) analyse for DEK og Ki-67
IHC fargemetode og tolkningskriterier ble som tidligere beskrevet [5]. I korthet, for å eliminere endogen peroksidase-aktivitet, ble 4 um tykke vevssnitt deparaffinized, rehydrert og inkubert med 3% H
2o
2 i metanol i 15 minutter ved romtemperatur (RT). Antigen gjenfinning ble utført ved 95 ° C i 20 min ved å plassere objektglassene i 0,01 M natrium-citrat-buffer (pH 6,0). Platene ble deretter inkubert med DEK antistoff (1:50, BD Biosciences Pharmingen, CA, USA) og et monoklonalt muse anti-Ki-67-antistoff (klon: MIB-1; Dako, Glostrup, Denmarkat 4 ° C over natten etter. inkubering med biotinylert sekundært antistoff ved romtemperatur i 30 minutter, ble platene inkubert med streptavidin-peroksidase-komplekset ved RT i 30 min. Immunfarging ble utviklet ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin, og Mayers hematoxylin ble brukt for kontra. Vi brukte mus IgG som en isotop-kontroller. i tillegg ble det positive vevssnitt behandles mens utelatelse av det primære antistoff som negativ kontroll.
Både DEK og Ki-67 er vanligvis uttrykt i cellekjernen. IHC-farging for DEK var semi- kvantitativt scoret som «-« (negativ, ingen eller mindre enn 5% positive celler), «+» (5-25% positive celler), ++ « «(26-50% positive celler) og» +++» ( mer enn 50% positive celler). Bare den atomuttrykksmønster ble betraktet som positiv farging, og de sterkt positive betyr «++» og «+++» positive celler. Ki-67 indeks (antall Ki-67-positive tumorceller dividert med det totale antall tumorceller x 100%) ble bestemt ved telling av antallet tumorceller i 20 tilfeldig utvalgte høy effekt felt (x 400).
apoptotisk analysen i vevssnitt av CRC
apoptotiske indeksen ble målt ved hjelp av en in situ apoptose deteksjon kit (Takara Bio, Otsu, Japan). De flekker prosedyrer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Etter rutinemessig deparaffinization ble vevet seksjon fordøyet med proteinase K (20 mg /ml i PBS) i 15 minutter ved romtemperatur og vasket med PBS. Objektglass ble deretter inkubert i 3% hydrogenperoksid i 5 min og vasket med PBS. TdT enzym og substrat ble pipettert på seksjonene, som deretter ble inkubert ved 37 ° C i 90 min. Etter vasking ble FITC anti-HRP-konjugat tilsettes til lysbildene i 30 minutter. Platene ble vasket, farget med diaminobenzine (Nichirei, Tokyo, Japan), og kontra med hematoksylin. Den apoptotiske indeks (antall positive tumorceller dividert med det totale antall tumorceller x 100%) ble bestemt ved telling av antallet tumorceller i 20 tilfeldig utvalgte høy-strømfelt (x 400) [20]. Korrelasjonene mellom DEK uttrykk og Ki-67 eller apoptotiske indeksen ble evaluert i over menneskelige CRC vev.
Western blotting
Primære antistoffer mot DEK (1:1000, BD, biovitenskap Pharmingen, San Diego, CA, USA), mutant-p53 (1:2000, Santa Cruz, CA, USA), MDM2 (1:2000, Santa Cruz, CA, USA), BCL-2 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), Bax (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), PARP (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), caspase-3 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), caspase-8 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), og caspase-9 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) ble brukt.
friske vevsprøver av CRC ble malt til pulver i flytende nitrogen og lysert med SDS-PAGE prøvebuffer. Konfluente celler ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM natriumklorid, 0,5 mM EDTA, 0,09 enheter /ml aprotinin, 1 mg /ml pepstatin, 10 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og 1 mg /ml leupeptin) . Lik proteinprøver (20 pg) ble separert på 12% SDS-polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 i 1 time ved romtemperatur. Membraner ble inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C. Membranen ble vasket 3 ganger med TBST og inkubert med HRP-konjugert geite-anti-muse-IgG. (Cwbiotech, Beijing, Kina) og HRP-konjugert geite-anti-kanin-IgG (Cwbiotech, Beijing, Kina) ved romtemperatur i 2 timer. Så uttrykket ble oppdaget ved hjelp av ECL prime western blotting deteksjonsreagensen (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) i henhold til produsentens instruksjoner. β-aktin (Sigma, St. Louis, MO, USA) ble brukt som lasting kontroll. Bilder ble tatt med Champchemi Professional bildeanalysesystem (Sagecreation, Beijing, Kina), og proteinbånd ble kvantifisert ved hjelp LANE 1D programvare (Sagecreation, Beijing, Kina).
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT- PCR) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
for RT-PCR, ble total RNA fra CRC prøver og cellelinjer hentet ved hjelp Trizol reagens (Takara, Shiga, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Første cDNA ble syntetisert ved Prime Script revers transkriptase (Takara Bio, Dalian, Kina) og oligo (dT) ved å følge produsentens instruksjoner. Alle PCR-reaksjoner ble utført i 20 pl reaksjonsblanding, med utgangspunkt i 4 minutter ved 94 ° C for denaturering cDNA, og PCR-amplifikasjon ble utført i 23~36 sykluser ved 94 ° C i 15 s og 53~58 ° C i 30 s for å binde primerne, og som strekker seg primerne ved 72 ° C i 1 min. Alikvoter av PCR-reaksjonen ble fjernet etter forskjellige antall ganger, og det ble oppløst ved elektroforese på 3% agarosegeler. Bilder ble tatt med Champchemi Professional bildeanalysesystem (Sagecreation, Beijing, Kina), og kvantifisering ble utført med LANE 1D programvare (Sagecreation, Beijing, Kina).
Real-time PCR ble utført av en Bio- Rad sekvens deteksjonssystem i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av dobbelt-trådet DNA-spesifikk SYBR Premiks Eks TaqTM II Kit (Takara, Shiga, Japan). Primersett for spesifikke gener er vist i tabell 1. Real-time PCR reaksjoner ble gjort i tre paralleller, og terskelen sykkel tall (CT) ble bestemt på nivået som viste de beste kinetiske PCR parametere. No-templat kontrollen ble anvendt som negativ kontroll, og smeltekurver ble erholdt for å bekrefte spesifisiteten av PCR-produktet. En komparativ CT-metoden (2
-ΔΔCt) ble brukt for å måle den relative kvantifisering av DEK genet.
Cell kultur og transfeksjon
Menneskelige kolorektal kreft cellelinjer SW-620 , HT29, SW-480, og HCT116 ble kjøpt fra Celle Bank of Chinese Academy of Medical Science (Shanghai, Kina), og konservert ved Cancer Research Center of Yanbian University. Disse cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 eller DMEM-medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mmol /l L-glutamin, og 100 U /ml penicillin /streptomycin i fuktig 5% CO
2 ved 37 ° C
DEK siRNA (siDEK) målrettet menneske DEK genet, og siRNA tomannsboliger med ikke-spesifikke sekvenser ble brukt som negative kontroller (siControl).; alle sekvensene ble designet og syntetisert av RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Kina) (tabell S1). Den siDEK anvendt i denne studien er vist i tabell 1.
MTT-analysen
Ett tusen celler pr brønn ble inkubert i 96-brønners plater. Tjuefire timer senere ble siControl og siDEK transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De siDEK sekvenser ble tilsatt i en doseavhengig måte ved 30 nM, 50 nM og 100 nM. Førti-åtte timer senere, 5 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubering ved 37 ° C i 4 timer, ble supernatantene fjernet omhyggelig. Så ble 200 ul dimetylsulfoksid ble tilsatt til hver brønn og brønnene ble grundig blandet i 10 min. Absorbansverdien (OD) ved 560 nm fra hver brønn ble målt ved hjelp av mikroplateleser (TECAN-uendelig M200 pro, Mannedorf, Sveits).
immunfluorescens farging
CRC cellelinje, SW- 620, ble dyrket på dekkglass til 70% konfluens og deretter fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og permeabilisert med 0,5% TritonX-100 ° C i 10 min etter 24 timer. Blokkering ble utført med 3% bovint serumalbumin fraksjon V (Solarbio, Beijing, Kina) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, ble cellene inkubert med mus-anti-human DEK (01:50, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubasjon med Alexa Fluor 568 geit-anti-mus IgG (H + L) (A11004, 1:1000, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask med PBS ble cellene kontra med 49-6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) (Beyotime, Shanghai, Kina) og glassene ble montert med Antifade Mounting Medium (Beyotime, Shanghai, Kina). Til slutt ble immunofluorescence signaler visualisert og tatt opp med Leica SP5II konfokalmikroskop [21].
Colony formasjon analysen
Egge siDEK (SiControl) og siDEK transfektert SW620 cellelinje ble sådd ut i 10 cm retter på tettheten av 5 × 10
4 celler per parabolen. Neste dag ble mediet erstattet med medium inneholdende 800-1000 ug /ml G418 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Etter ca 7 dager, ble mediet byttet ut. Analysen ble stanset da koloniene var klart synlige, selv uten å se under mikroskop, og det var omtrent 2~3 ukers inkubering ved 37 ° C, 5% CO2. Deretter ble cellene fiksert med 0,5% paraformaldehyd, farget med krystallfiolett og deretter tellet i henhold til definerte størrelse av koloni [22].
Hoechst33342 farving
Celler ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
4 celler /mL og dyrket i 2 til 4 dager til 80% til 90% konfluens. Et celletetthet på 0,5-3,0 x 10
6 celler /ml ble oppnådd og fiksert i 10 minutter ved romtemperatur med 3% paraformaldehyd (50 ul) før behandling med Hoechst 33342. Hoechst 33342 ble oppløst i destillert vann ved 25 mg /ml og tilsatt til DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) med 2% FBS ved en sluttkonsentrasjon på 16 ug /ml i 15 min. Apoptose Hastigheten ble beregnet ved å telle 500 celler i et fluorescerende mikroskop.
Strømningscytometri
SW-620-celler ble dyrket i seks-brønns plater, og ble transfektert med den siRNA-målretting DEK eller kappløpet siRNA for 48 timer med Lipofectamine 2000 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. Etter behandling ble cellene høstet med trypsin (0,25%) – EDTA og oppsamlet ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 min ved romtemperatur. Cellene ble vasket og resuspendert i bindingsbuffer, før den blir merket med Annexin V-FITC og 7AAD i 20 min. Fluorescens (DNA-innhold) ble målt ved strømningscytometri ved bruk av standard programvare. Celler som var Annexin V-FITC (-) og 7AAD (-) ble betraktet som levende celler, mens celler som var Annexin V-FITC (+) og 7AAD (-) ble ansett tidlig stadium apoptotiske celler. Celler som var Annexin V-FITC (+) og 7AAD (+) ble ansett sene stadier av apoptotiske celler.
Statistisk analyse
Hvert forsøk ble utført in triplo. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 statistikkpakke (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), og sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av t-test. Korrelasjonene av DEK uttrykk nivåer med CRC og histologiske faktorer ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
P
. 0,05
Resultater
DEK protein er overuttrykt i CRC
For å demonstrere hvilken rolle DEK på CRC målte vi DEK protein nivåer i fire tilfeller av CRC med matchet tilstøtende ikke-tumor friske vev. Western blot data viste robust DEK protein uttrykk i CRC vev sammenlignet med matchede tilstøtende ikke-tumorvev (Fig. 1).
(A) Bilder av vestlige blotter av DEK protein uttrykk i fire matchet par av CRC ( T) og tilstøtende ikke-tumorvev (NT). (B) Relative T /NT prosenter av DEK protein uttrykk nivåer i paret CRC og tilstøtende ikke-tumorvev vises (økt ganger endring, **
P
0,01).
DEK proteinekspresjon viste et kjernefysisk IHC fargemønster i CRC (fig. 2). Antallet celler som inneholder DEK protein (positiv rate) var signifikant høyere i CRC-vev (80,0%, 44/55) enn i normalt tilstøtende mucosa (36,4%, 8/22) og i kolorektale adenomer (16,7%, 3/18) . Tilsvarende sterkt positive frekvensen av DEK protein var 50,9% (28/55) i CRC, som var betydelig høyere enn i tilstøtende normalt tykktarmsslimhinnen (18,2%, 4/22) og i kolorektale adenomer (16,7%, 3/18) (Begge
P
0,001). (tabell 2)
(A) DEK protein flekker var negativ i tilstøtende normale kolon vev. (B) DEK protein viste diffust og sterkt atom positiv farging i sent stadium CRC. (C) DEK protein er positiv i invasive kreftceller i serosa i tykktarmen. (D) DEK protein er negativ i CRC uten metastaser.
Korrelasjon mellom DEK uttrykk og Ki-67-indeksen og apoptose indeksen i menneske CRC vev
Vi har evaluert sammenhenger mellom DEK uttrykk og Ki-67 og apoptotiske indekser i menneske CRC vev. Ki-67-indeksen var 26,60 ± 8,12% i vev med lave DEK uttrykk nivåer og 48,17 ± 7,87% i vev med høy DEK uttrykk nivåer (Fig. 3A). DEK uttrykk nivåer og Ki-67-indeksen var positivt korrelert (
P
= 0,030). Den apoptotiske indeksen var 0,78 ± 0,10% i vev med lave DEK uttrykk nivåer og 0,30 ± 0,16% i vev med høy DEK uttrykk nivåer (Fig. 3B). Det var også en signifikant sammenheng mellom DEK uttrykk nivåer og apoptotisk indeks (
P
= 0,010).
(A) signifikante forskjeller ble observert i samkjøre DEK uttrykk og Ki-67-indeksen (
P
= 0,030). (B) Det var også en signifikant sammenheng mellom DEK uttrykk og apoptotisk indeks (
P
= 0,010). . (DEK lav, «-» og «+»;. DEK høy, «++» og «+++»)
DEK uttrykk i CRC celler ved RT-PCR og Western blot
IHC data vist ovenfor, og vår tidligere rapportert data [5] tyder på at DEK kan være involvert i utviklingen av CRC og en god markør for spredning og metastasering. Derfor vi har oppdaget uttrykket nivåer av DEK mRNA og protein i flere CRC cellelinjer, inkludert SW-620, SW-480, HCT116 og HT29. RT-PCR-data viste at alt av SW-620, SW-480, HT29 og HCT116-celler viste høye ekspresjonsnivåer av DEK mRNA (fig. 4A). Lignende resultater ble observert for proteinnivåer av disse cellelinjer ved Western blot analyser (fig. 4B). Her valgte vi SW-620 celler, som har høy spredning og metastase potensialet bekreftes av tidligere rapporter [23], for følgende eksperimenter.
Effekter av DEK RNAi på celleproliferasjon av tykktarmskreft cellelinje , SW620
Vi transfektert SW-620 celler med DEK RNAi, og funnet ut at DEK RNAi effektivt downregulated mRNA og protein uttrykk nivåer av DEK i SW-620 celler ved immunfluorescens farging, RT-PCR og Western blot analyser (fig. 5A-C).
(A) Nuclear lokalisering av DEK protein er observert i siControl og siDEK SW-620 celler. DEK (rød) lokalisert til SW-620 cellekjerner ved immunfluorescens farging og konfokalmikroskopi observasjon. DAPI farging (blå) ble inkludert for å visualisere kjernen. (B) DEK mRNA uttrykk i menneske CRC cellelinje SW-620 etter siControl og siDEK. (C) DEK protein uttrykk i menneske CRC cellelinje SW-620 etter siControl og siDEK.
Effektene av DEK protein uttrykk på cellevekst ble testet ved hjelp av en MTT analyse. Veksthastigheten av de 100 nM siDEK-behandlede celler ble redusert på en doseavhengig måte (fig. 6A). Absorbansverdiene for MTT-assay etter 72 h og 96 h var 0,43 ± 0,02 og 0,62 ± 0,03 for siControl, og 0,35 ± 0,03 og 0,39 ± 0,02 for de siDEK-transfekterte SW-620-celler, både
P
0,05, respektivt (figur 6B.). I tillegg viste en kolonidannelsesbestemmelsen SW-620-celler ble effektivt redusert i nærvær av siDEK (100 nM). Til sammenligning siDEK hemmet kolonidannelse i SW-620 celler med ca 70% (
P
0,05) (Fig. 6C). Disse data indikerte at det var en signifikant reduksjon i cellevekst i siDEK-transfekterte celler sammenlignet med de siControl cellene.
(A) MTT-analysen viste siDEK (100 nM) etterligner betydelig redusert spredning av SW- 620 celler i forhold til siControl gruppe (
P
= 0,034). (B) MTT-analyse etter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer for siControl og siDEK-transfekterte SW-620-celler, *
P
0,05, respektivt. (C) Colony formasjon analysen viste siDEK behandling hemmet kolonidannelse i SW-620 celler med ca 70% (
P
0,001).
Effekter av DEK uttrykk på apoptose av SW-620 celler
Som vist i fig. 7A, etter SW-620 celler ble transfektert med 100 nM siDEK eller siControl, den apoptotiske hastigheten øker betydelig hos siDEK SW-620 celler sammenlignet med siControl-transfekterte SW-620 celler. Prosentandelen av Annexin V-FITC + /7AAD- celler var 13,13% i siDEK gruppe, og 4,99% i siControl gruppen, noe som indikerer at DEK uttømming økte tidlig apoptose av SW-620-celler (fig. 7B).
(A) Hoechst33342 farging viste at knockdown av DEK genet indusert apoptose. (B) transfekterte siDEK for 48 timer markant økt tidlig stadium apoptotiske celler angitt med en høyere prosentandel av Annexin V-FITC + /7AAD- celler sammenlignet med siControl gruppen.
Uttrykk av p53 /MDM2, caspase-familien, og Bcl-2 /Bax proteiner i siDEK-transfekterte celler
Som vist i fig. 8A, uttrykket nivåer av mutant-p53 og MDM2 ekspresjon i siDEK-behandlede SW-620-celler ble redusert betraktelig i Western blot-analyser, hvilket antyder at DEK stimulerer veksten av SW-620-celler via p53 /MDM2 pathway. Dessuten ble ekspresjonen av Bcl-2 nedregulert etter siDEK behandling. I motsetning til dette ble Bax uttrykk oppregulert under de samme betingelser. Disse observasjoner antydet at Bcl-2 /Bax reaksjonsvei spiller en viktig rolle i SW-620 celler «progresjon som er regulert av DEK (Fig. 8B).
(A) Mutant-p53 og MDM2-proteiner var signifikant nedregulert i siDEK-transfektert SW-620 celler. (B) Forholdet mellom BCL-2 /Bax var signifikant redusert i siDEK-transfekterte SW-620-celler. (C) PARP-protein ekspresjon var mye høyere i siDEK celler, og caspase-3 og -9-proteiner var signifikant lavere i siDEK-transfekterte SW-620 celler enn de i siControl gruppe. Caspase-8 protein nivåer forble uendret.
I tillegg våre data viste også at kløyvde caspase-3 og kløyvet caspase-9 ble redusert i siDEK cellene, mens uttrykket nivået av caspase-8 ikke endring. Men spaltet poly ADP ribose polymerase (PARP) uttrykk nivåer økt med siDEK søknad. Disse data antydet at caspase-3 og kaspase-9, men ikke caspase-8, er involvert i SW-620 celle apoptose etter siDEK transfeksjon, noe som indikerer at siDEK aktivert også caspase-avhengige reaksjonsveier (Fig. 8C).
mekanismen for DEK funksjon i CRC ble også bekreftet i en annen cellelinje CRC HCT116, og funnet at lignende resultater med det i SW620 celler. Dataene ble gitt som et supplement tall (fig. S1-S3).
Diskusjoner
DEK genamplifisering og oppregulert uttrykk har blitt beskrevet i flere krefttyper, inkludert leverkreft, blærekreft, og melanom [7], [16], [24]. Verkene til Khodadoust et al [7] viste at DEK uttrykk nivåer kan skille godartet nevi fra maligne melanomer, noe som indikerer at dette proteinet kan vise seg svært nyttig for differensialdiagnoser. Nylig, Datta et al. [24] rapporterte at oncoproteinet DEK ble oppregulert i blærekreft vev sammenlignet med normale motstykker som bestemt ved Western blot. Faktisk DEK protein var til stede i annullert urinen til pasienter med lav- og høy grad av blære kreft, noe som tyder på at DEK kan brukes som en biomarkør for påvisning av blærekreft ved bruk av pasienturinprøver. Vår nåværende studien er den første til å rapportere om de onkogene aktiviteter DEK i CRC ved tappe DEK, og å definere funksjonelle og molekylære mekanismer for DEK i CRC patogenesen.
Vår tidligere studie [5] viste at den sterkt positive frekvensen av DEK protein var 48,62% (53/109) i kolorektal kreft, som var signifikant høyere enn i enten tilstøtende normal tykktarmsslimhinne (9,17%, 10/109) eller kolorektal adenom (13,46%, 7/52). DEK overekspresjon i CRC var positivt korrelert med tumor størrelse, klasse, lymfeknutemetastaser, serøse invasjon, sent stadium, og sykdomsfri overlevelse og 5-års overlevelse. Videre analyser viste at pasienter med sent stadium CRC og høy DEK uttrykk hatt verre overlevelse enn de med lav DEK uttrykk. Videre multivariat analyse viste høy DEK uttrykk, serøse invasjon, og sent stadium er betydelige uavhengige risikofaktorer for dødelighet hos CRC. I dette arbeidet, analyser western blot og IHC flekker viste at høy DEK uttrykk var betydelig mer vanlig i CRC vev enn i enten ved normal kolorektal slimhinne eller kolorektal adenom.
Ki-67 antigen uttrykt av voksende celler under G1, S, G2 og M fasene, men ikke i løpet av G0 fase (hvilende celler) [25]. Ki-67 blir brukt som en markør av tumor proliferasjon og aggressivitet, og det kan ha en stor effekt på prognosen for pasienter med CRC [26] – [27]. Våre tidligere resultater viste at DEK proteinekspresjon mønster var meget lik den Ki-67 antigenet som en prolifererende markør i livmorhalskreft [28]. En positiv korrelasjon mellom DEK uttrykk og Ki-67 eller apoptotiske indeksen i CRC vev ble også funnet i denne studien.
Wise-Draper et al. [29] anvendes RNAi tilnærminger for den spesifikke målretting av DEK i kreft og primærceller, og fant at DEK uttømming i HeLa livmorhalskreftceller resulterte i induksjon av apoptose. Lignende resultater ble oppnådd med primære humane keratinocytter, impliserer DEK som kreft og primær celleoverlevelsesfaktor. I denne studien har vi også oppdaget sammenhengen mellom DEK overekspresjon og mer ondartede atferd av CRC bruker SW-620 og HCT116 humane CRC celler med og uten RNAi behandling. Den celle apoptose analyse viste at DEK uttømming økte tidlig apoptose av SW-620 og HCT116-celler. Til tross for dette har vi også observert at DEK uttømming hemmet cellevekst i en MTT analyse, og kolonidannelse assay. Disse resultatene var enig med resultatene av Ki-67 og apoptose indeksen i CRC vevsprøve. Våre funn tyder på at DEK regulerer CRC cellevekst og overlevelse
in vitro
.
Den menneskelige p53 protein er den hyppigst inaktivert tumorsuppressorgenet i menneskelig kreft og er involvert i kontroll av celleformering som reaksjon på stress [30]. Imidlertid har p53 en kort halveringstid og holdes ved lave eller ikke-påvisbare nivåer ved kontinuerlig proteolytisk nedbrytning i normale celler. Vedvarende degradering av p53 formidles hovedsakelig av E3 ligase MDM2 [31]. Ved å binde p53, MDM2 blokkerer trans domenet til p53 og derfor inhiberer dens transkripsjonelle aktivitet [32]. Utfordret med spenningssignaler som hypoksi eller DNA-skade, er tilbakekoblingssløyfen fra MDM2-p53 forstyrret, noe som fører til apoptose eller malignitet [33]. Khodadoust studie foreslått en ny rolle for DEK i celleoverlevelse, involverer destabilisering av p53 på en måte som er egnet til å bidra til menneskelig kreftutvikling [7]. I tillegg Wise-Draper et al. også vurdert at celledød i respons til DEK uttømming ble ledsaget av øket proteinstabilitet og transkripsjonelle aktivitet av p53 tumor suppressor, og påfølgende oppregulering av kjente p53 målgener for eksempel Bax [29]. Bax, et pro-apoptotiske faktor av Bcl-2-familien, er plassert i en monomer form i cytosol eller løst festet til membran under normale forhold. Etter et dødsfall stimulans, cytosoliske og monomere Bax translocate til mitokondriene, hvor de blir integrerte membranproteiner.
