Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) har vært ansett som en kritisk faktor i målretting onkogener eller tumorsuppressorgener i tumorigenesis. Den genetisk predisposisjon for mirnas-signalveier knyttet til utvikling av oral plateepitelkarsinom (OSCC) forblir uløst. Denne studien undersøkte sammenslutninger av polymorfismer med fire mirnas med mottakelighet og clinicopathological kjennetegn OSCC.
metodikk /hovedfunnene
Totalt 895 mannlige forsøkspersoner, inkludert 425 kontroller og 470 mannlige kreft i munnhulen pasienter, ble valgt. Polymerasekjedereaksjon-rflp (PCR-RFLP) og real-time PCR ble anvendt for å analysere miRNA146a, miRNA196, miRNA499 og miRNA149 genetisk polymorfisme mellom kontrollgruppen og gruppen tilfelle. Denne studien fastslått at en signifikant sammenheng med miRNA499 med CC genotype, sammenlignet med personer med TT genotype, hadde en høyere risiko (AOR = 4,52, 95% CI = 1,24 til 16,48) av OSCC. Videre en innvirkning på de fire mirnas genet polymorfisme på mottakelighet av betelnøtter og tobakk fører til kreft i munnhulen ble også avdekket. Vi fant en beskyttende effekt mellom klinisk utviklingsfase (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36 til 0,94) og tumorstørrelse vekst (AOR = 0,47, 95% CI = 0,28 til 0,79) hos yngre pasienter (alder 60).
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at genetisk polymorfisme av miRNA499 er forbundet med oral kreftutvikling, og samspillet av miRNAs genetisk polymorfisme og miljøkreftfremkallende er også knyttet til en økt risiko for kreft i munnhulen i taiwanske.
Citation: Chu YH, Tzeng SL, Lin CW, Chien MH, Chen MK, Yang SF (2012) Konsekvenser av mikroRNA Gene Polymorfisme på i hvilken grad miljø faktorer som fører til Karsinogenese i Oral Cancer. PLoS ONE 7 (6): e39777. doi: 10,1371 /journal.pone.0039777
Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA
mottatt: 07.01.2012; Godkjent: 25 mai 2012; Publisert: 28 juni 2012
Copyright: © 2012 Chu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
MircoRNAs (mirnas) er små fragment RNA, som inneholde omtrent 20-22 nukleotider, kan målrette spesifikke mRNA og negativt regulere sin translasjonsforskning effektivitet og stabilitet [1]. Tidligere funn har vist at en miRNA kan påvirke uttrykket av flere målgener. I henhold til regulering av forskjellige mål RNA, kan mirnas delta i cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering, overlevelse og [2]. Altered miRNA uttrykket har blitt observert i flere sykdommer, spesielt i kreft [3].
I Taiwan er den fjerde vanligste kreftformen blant menn kreft i munnhulen. En rask økning av forekomsten av kreft i munnhulen skjedde i de siste årene og råolje dødeligheten av kreft i munnhulen var 10,1 per 100 000 i 2007, og rangert som den sjette årsaken til kreftdød [4]. I de siste årene, forekomsten av kreft i munnhulen var spesielt høy i Sør-Asia. Dette fenomenet synes spesielt i befolkninger vant til å tygge Areca (betel) mutteren [5]. Epidemiologiske studier har også antydet at mottakelighet for kreft i munnhulen er mediert av både miljømessige kreftfremkallende (inkludert alkoholinntak, tobakk, og mutter tygging) og genetiske faktorer [6]. Stadig flere bevis viser at mirnas er forbundet med hode og nakke /munnhulekreft [7], og flere mirnas har vist seg å være uregulert i hode- og halskreft [8]. Dette forholdet er også blitt fastslått i laboratorieforsøk [9].
enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) er en variasjon i DNA-sekvensen som oppstår når nukleotider (A, T, C eller G) forandring i minst ett % av en viss populasjon. Noen epidemiologiske studier viser at miRNA genetiske variasjoner er assosiert med progresjon til munnhulekreft [10], [11]. Mens mirnas har fått stor oppmerksomhet de siste årene, har SNPs i miRNA og pre-miRNA sekvenser blitt påvist å være koblet til deres kandidat gener [12]. I dbSNP database har over 400 mirnas SNPs er dokumentert. For å få tilstrekkelig kraft for å vurdere potensialet foreningen, undersøkte vi miRNA146a (rs2910164), miRNA149 (rs2292832), miRNA196 (rs11614913), og miRNA499 (rs3746444), de med mindre allelfrekvensene ≥5% og også lokalisert på pre-miRNA regioner i den kinesiske populasjoner [13], [14]. I et annet aspekt, er disse fire miRNA SNP’er blitt rapportert som viktig for tumordannelse på grunn av deres målretting på flere viktige gener [15]. Derfor ble disse fire miRNA SNPs er valgt i denne studien. Vi har også vurdert som et unikt fenomen i Sør-Asia, der de fleste orale kreft individer har en mutter tygge vane. Vi kombinerte kliniske status og laboratorie utfall å bestemme forholdet mellom disse SNPs og mottakelighet for kreft i munnhulen.
Resultater
Den statistiske analyser av demografiske kjennetegn er vist i tabell 1. Det var signifikante forskjeller i fordelingen av betel-pund tygging (
p
0,001), alkoholforbruk (
p
0,001), og tobakksbruk (
p
0,001 ) mellom friske kontrollpersoner og OSCC pasienter. Fordi disse forskjellene mellom de to gruppene kan være confounders justerte vi disse egenskapene i videre statistisk analyse.
Fordelingen av miRNA SNP genotyper er beskrevet i tabell 2. I våre friske kontroller, miRNA polymorfismer (rs2910164 , rs11614913, og rs3746444) likedannet Hardy-Weinberg likevekt, bortsett rs2292832 (
p
0,001). Vi brukte logistisk regresjon modell for å beregne justert odds ratio (AORs). Korrigert alder, røykestatus, alkoholinntak og mutter tyggevaner, fant vi at miRNA499 CC genotyper viste signifikant (
p
0,05) høyere risiko for 4.52- (95% CI = 1,24 til 16,48) av ha OSCC sammenlignet med den tilsvarende villtype (WT) homozygote. Men det var ingen signifikant høyere oral kreftrisiko for personer med miRNA146a, miRNA149 og miRNA196 polymorfe gen sammenlignet med de med WT-genet.
Med tanke på at risikofaktorer som mutter tygde kan endre genetisk mottakelighet for kreft i munnhulen, og den interaktive effekter mellom miljørisikofaktorer og genetisk polymorfisme av mirnas er vist i tabell 3, Tabell S1 og Tabell S2. Individer med minst en C allel av miRNA499 og en mutter-chewing vane hadde respektive høyere risiko for 17.33- (95% KI = 9.63-31.17) for å ha kreft i munnhulen (tabell 3). Individer med minst en G allel av miRNA146a, C-allelet av miRNA149, eller C-allelet av miRNA196, og en mutter-chewing vane hadde respektive høyere risiko for 9.93- (95% CI = 6,01 til 16,41), 8.67- ( 95% CI = 5,06 til 14,89), og 10.98- (95% CI = 6,21 til 19,39) for å ha kreft i munnhulen (tabell S1). Tilsvarende tobakksforbruket forhøyet oral kreftrisiko hos personer polymorfe for miRNA146a, miRNA149, miRNA196 og miRNA499 i forhold til personer med WT-genet, men uten røyking (Tabell 3 og Tabell S2) betydelig. Vi evaluerte videre genet-miljøet statistisk interaksjon mellom miRNA polymorfismer, røyking og Betel pund på kreft i munnhulen (tabell 3, Tabell S1 og Tabell S2). Statistisk signifikans ble funnet for samspillet mellom alle miRNA polymorfismer, røyking og Betel pund på kreft i munnhulen utvikling (p 0,05). Ovennevnte Resultatene tyder på at mirnas genet polymorfismer ha en sterk innvirkning på kreft i munnhulen mottakelighet betelnøtter og /eller røyking forbrukere.
For å utforske konsekvensene av polymorfe genotyper av mirnas på kliniske status OSCC, vi videre klassifisert OSCC pasienter i to undergrupper: en undergruppe med minst en polymorf allel, og den andre undergruppen med homozygote WT alleler. Data fra den statistiske analysen viste at som har polymorfe miRNA499 gen hadde en beskyttende effekt av tumorstørrelsen vekst (AOR = 0,46, 95% CI = 0,29 til 0,72) sammenlignet med pasienter med villtype (tabell 4). Imidlertid ble det ikke observert noen signifikant sammenheng mellom miRNA416a, miRNA149 og miRNA196 genet polymorfismer og clinicopathologic kovariater (data ikke vist). Videre, sammenlignet med WT genotypen (T /T), pasienter med i det minste en polymorf C allel av miRNA499 viste en beskyttende virkning mellom klinisk utvikling trinn (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36 til 0,94), og tumorstørrelsen vekst ( AOR = 0,47, 95% CI = 0,28 til 0,79), hos yngre pasienter (age≤60), som vist i tabell S3. Imidlertid ble det ikke observert noen signifikant sammenheng mellom miRNA499 genet polymorfismer og clinicopathologic kovariater hos eldre pasienter (alder 60). (Tabell S4)
Diskusjoner
I denne studien har vi forutsatt roman informasjon SNPs av miRNA499 på foreningen av kreft i munnhulen mottakelighet. Etter å kombinere den viktigste risikofaktoren for kreft i munnhulen, disse genetiske rammer kan også øke mottakelighet for kreft i munnhulen. Tatt i betraktning tidligere funn, har miRNA499 vært fast bestemt på å vise høyere uttrykk i hjerte og skjelettmuskelvevet [16]. Spesielt i hjertet, har tidligere undersøkelser har også funnet at høy ekspresjon av miRNA499 øker risikoen for kardiomyocytt hypertrofi og kardiomyopati. Videre antyder noen bevis for at miRNA499 kan regulere mitokondrielle dynamikk gjennom ved å målrette spesifikke proteiner som p53 [17]. Tidligere studier har også vist at miRNA499 er sterkt forbundet med hjertesykdommer ved å regulere cellulær differensiering og proliferasjon [18], [19]. Disse funnene viser at miRNA499 er muligens forbundet med hjertesykdommer og også kreftutvikling.
Basert på klinisk status, har tidligere studier har funnet at miRNA-486, miRNA-30d, miRNA-en, og miRNA-499 utstilt høy ekspresjon i serum og var også forbundet med overlevelse i ikke-små-celle lungekreft [20]. Andre studier har funnet at genetisk variant i pre-miRNA kan bidra til prosessen med å karsinogenese i brystkreft [14], [21], magekreft [22], livmorhalskreft [23], [24], og hode og hals kreft [15]. I denne studien, vi først vist at polymorfisme av miRNA499 er assosiert med kreft i munnhulen.
Tidligere studier har funnet at miRNA146a kan bidra til tumorprogresjon, metastase, prognose, og overlevelse i magekreft og kreft i munnhulen [25 ], [26]. Et annet funn viste også at miRNA146a polymorfisme kan regulere miRNA146a uttrykk [27]. En rekke laboratorieforsøk har også oppdaget at miRNA146a kunne hemme celledifferensiering og overlevelse i det hematopoetiske system [28]. Videre koblet til kreft, kan miRNA146a undertrykke celle invasjon i bukspyttkjertelkreft [29]. I detalj, forbinder noen bevis miRNA146a med transkripsjonsfaktorer så som NF-kB [30]. Disse funnene gir en ny visjon som miRNA146a kan påvirke kreft progresjon ved å regulere celledifferensiering, men kan ikke påvirke apoptose. Selv om vi fant ingen sammenheng mellom miRNA146a og flere kliniske tilstander i vår studie, basert på disse funnene, kan fremtidige studier vurdere felles prognose status eller overlevelse.
Nyere studier har identifisert at miRNA196 kan samhandle med flere transkripsjonsfaktorer og involvere i kreftutvikling og progresjon [31], [32]. Noen funn tyder på at overekspresjon av miRNA196 fører til mer gunstig prognose og overlevelse i leukemi [33]. I tillegg er miRNA196 assosiert med inflammasjon i bestemte kreft [34]. Videre Christensen et al., Rapporterer en polymorfisme i den modne sekvens av miRNA196a2 i en case-control studie (n = 1039) på hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [35]. Når forfatterne stratifisert på svulststedet de ikke observerer en signifikant sammenheng mellom kreft i munnhulen og miRNA196a2, selv om effekten anslaget var beskyttende, lik de resultatene som presenteres i denne studien. Selv om årsaken til disse avvikene ikke er kjent, kan de ulike resultatene fra rapporten og denne undersøkelsen er knyttet til rase /etnisk forskjell.
Med tanke på at årsakene til Kreftsvulster er komplekse, analyserte vi flere risiko faktorer, for eksempel røykestatus og mutter tyggevaner, i denne studien. Vi forventer at disse gene polymorfismer kunne påvirke mottakelighet for kreft i munnhulen. Basert på resultatene, observerte vi at disse polymorfismer betydelig økt odds ratio i hver gruppe, muligens fordi funksjonene til disse mirnas regulere differensiering og proliferations i tumorprogresjon. Vi fant også at genetisk polymorfisme av miRNA499 er assosiert med distal metastasering av OSCC. En tidligere studie for kolorektal kreft har funnet at overekspresjon av miRNA499 kan lette migrering og invasjon av kreftceller in vitro, så vel som metastaser til lunge og lever in vivo [36]. I tillegg gir denne studien også identifisert gaffelhodeboks O4 (FOXO4) og programmert celledød 4 (PDCD4) som direkte og funksjonelle målene for miRNA499 [36]. Videre Reis et al., Rapporterer også at PDCD4 som en suppressor av migrasjon og invasjon og kan være en klinisk relevant biomarkør med prognostisk verdi i OSCC [37]. Disse nevnte funnene kan gi en foreløpig forklaring med våre funn for sammenhengen mellom miRNA499 og distal metastasering av OSCC. Detaljerte relevante mekanismer kan garanterer videre studier.
En av begrensningene i vår studie er at informasjon om alkohol, betelnøtter, og tobakksbruk er dikotomisert til «stadig bruker» versus «never-bruker.» Som resultat, mer detaljerte analyser basert på mengde, lengde, og tidligere historie med mutter, alkohol og tobakk var ikke i stand til å bli utført. Datainnsamling støttet seg på selvrapportering, som noen individer kan være motvillige til å rapportere sine sedvanlig bruk av slike stoffer. Derfor kan det være rester av konfunderende effekt fra betelnøtter, alkohol og tobakk feilklassifisering. Videre den funksjonelle rollen miRNA i vekst eller metastasering av munnhulekreft er verdt for videre undersøkelser, som vil inngå i vårt videre arbeid. Kloner inneholdende forskjellige genotyper av miRNA499 SNP’er vil bli konstruert for å belyse de mulige funksjoner av miRNA499 (proliferasjon, cellesyklusregulering, migrering og invasjon) i orale cancercellelinjer, så vel som de underliggende mekanismer. Videre denne studien avdekket avvik av miRNA 149 (rs2292832) genotyper til Hardy-Weinberg likevekt i kontrollgruppen. En tidligere studie med 107000 genotyper generert fra 443 SNPs har funnet at genotypen distribusjoner for 36 av de 313 analyser (11,5%) ble fraveket HWE (P 0,05) [38]. Ved å søke etter mulige årsaker, analyser for SNPs viste uspesifikke eller genotyping feil har blitt identifisert. Men de har også funnet avvik fra HWE for de resterende 10 SNPs ble uforklarlige. Selv om årsaken til avviket av miRNA 149 genotyper til Hwe i vår kontrollgruppe er ikke utforsket ennå, kan resultatene fra ovennevnte studien gi noen retning for vår fremtidige studier.
I konklusjonen, oppdaget vi en signifikant sammenheng mellom miRNA499 genet polymorfismer og mottakelighet for kreft i munnhulen. Det er imidlertid ingen forbindelser mellom SNP’er og klinisk status. Etter å ha vurdert mutter tygge, som er den mest innflytelsesrike faktoren for kreft i munnhulen, fant vi at de fire mirnas som bærer mutasjonen genotype kan øke sannsynligheten for kreft i munnhulen. Disse genmutasjoner kan påvirke miRNA mål effektivitet og stabilitet og øke forekomsten av kreft i munnhulen, men de detaljerte mekanismene fra gene nivåer til protein nivåer som til slutt påvirker kreftutvikling bør klassifiseres, kanskje kartlegge en ny retning for målet terapi.
Materialer og metoder
fag og Prøvetaking
Vi rekrutterte 470 mannlige pasienter ved Chung Shan Medical University Hospital i Taichung og Changhua Christian Hospital og Show Chwan Memorial Hospital i Changhua, Taiwan som en sak gruppen mellom 2007 og 2011. i mellomtiden, kontroller ble inkludert fra den fysiske undersøkelsen i løpet av de tre sykehusene, som også fasiliteter som saker ble hentet fra. Ved slutten av rekruttering, totalt 425 mannlige deltakere som hadde hverken selv rapportert historie for kreft i alle områder ble inkludert. I tillegg ble pasienter med oral forstadier sykdom som oral submucous fibrose, leukoplaki, erythroplaki, verrucous hyperplasia, etc. ekskludert fra kontrollgruppen. Deltakelsen var omtrent 91% for saker og 76% for kontroller. Ettersom alle tilfeller og kontroller ble fortløpende samlet uten noen valg, og basert på informasjon på spørreskjemaer, ble ingen signifikant genetisk relasjon eller familiehistorie funnet.
Når det gjelder saker og kontroller, eksponeringsinformasjon, inkludert betel quid tygge ( evig vs. aldri-bruker), bruk av tobakk (røyker versus ikke-røyker) og alkoholforbruk (nåværende tung drikker, definert ved CDC som forbruker et gjennomsnitt på mer enn 2 drinker per dag vs. ikke aktuell tung drinker), var alt hentet fra spørreskjema. Mens medisinske opplysninger av tilfellene, inkludert TMN klinisk staging, primær tumor størrelse, spredning til lymfeknuter og histologisk klasse, ble hentet fra pasientjournaler. Oral kreftpasienter ble iscenesatt klinisk ved diagnosetidspunktet i henhold til TNM staging system av amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) [39]. Tumor differensiering undersøkt av patolog ifølge AJCC klassifisering. Denne studien er gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board og informert skriftlig samtykke er innhentet fra den enkelte.
DNA Extraction
Hele blodprøver, samlet fra friske kontroller og muntlige kreftpasienter, var er lagt inn i rør inneholdende EDTA, etter sentrifugert og lagret ved -80 ° C. Venøst blod fra hvert individ ble trukket inn i vakuumrør inneholdende EDTA og lagret ved 4 ° C. Genomisk DNA ble ekstrahert ved QIAamp DNA blod mini-sett (Qiagen, Valencia, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA ble oppløst i TE-buffer [10 mM Tris (pH 7,8), 1 mM EDTA], og deretter kvantifisert ved en måling av OD260. Endelig forberedelse ble lagret ved -20 ° C og brukes som maler for polymerase chain reaction.
Polymerase Chain Reaction-rflp (PCR-RFLP)
mirnas genet rs2910164, rs11614913, og rs3746444 polymorfismer ble bestemt ved PCR-RFLP-analyse [15]. Primerne sekvenser og restriksjonsenzymet for analyse av disse mirnas gen-polymorfismer ble beskrevet i Tabell S5. PCR ble utført i totalt 10 pl volum inneholdende 100 ng DNA-templat, 1,0 ul 10 x PCR-buffer (Invitrogen, Carslbad, CA, USA), 0,25 U av Taq DNA-polymerase (Invitrogen), 0,2 mM dNTP (Promega, Madison, WI , USA) og 200 nM av hver primer (MDBio Inc. Taipei, Taiwan). PCR-veksling var 5 minutter ved 94 ° C etterfulgt av 35 sykluser med 1 minutt ved 94 ° C, en minat 58 ° C i miRNA146a, 1 minutt ved 63 ° C i miRNA196a2, og 1 min ved 67 ° C i miRNA499, og 2 min ved 72 ° C, med et avsluttende trinn ved 72 ° C i 20 min for å tillate en fullstendig utvidelse av alle PCR-fragmenter. Resultatene er vist i figur 1. For hver analyse ble passende kontroller (nontemplate og kjent genotype) inkludert i hver skrive løp for å overvåke reagens forurensning. For å validere resultatene fra PCR-RFLP og for kvalitetskontroll, ble rundt 10% av analysene gjentas fra ulike partier og flere tilfeller av hver genotype ble bekreftet av DNA sekvensanalyse.
(A) For miRNA146a rs2910164 genet polymorfisme , villtype homozygote alleler (C /C) ga en 25 og 122-BP-produkter, de heterozygote alleler (C /G) ga 25-, 122- og 147-bp produkter, mens de muterte typen homozygote alleler (G /G ) ga en 147-bp produkt. (B) For miRNA196 (rs11614913) genet polymorfi, villtype homozygote alleler (T /T) ga en 149-bp produktet, heterozygote alleler (C /T) ga 24-, 125- og 149-bp produkter, mens muterte typen homozygote alleler (C /C) ga en 24- og 125-bp produkter (C) For miRNA499 (rs3746444) genet polymorfisme, villtypen (T /T) ga 26- og 120-bp produkter; de heterozygote alleler (C /T) ga 26-, 120- og 146-bp produkter, mens de muterte typen homozygote alleler (C /C) ga en 146-bp produkt.
Sanntids PCR
allel diskriminering av miRNA149 rs2292832 genet polymorfismer ble vurdert med ABI StepOne ™ real-Time PCR System (Applied Biosystems) og analysert ved hjelp av SDS v3.0 programvare (Applied Biosystems), ved hjelp av TaqMan analysen. Sluttvolumet for hver reaksjon ble 5 ul, inneholdende 2,5 ul TaqMan genotyping Master Mix, 0,125 mL TaqMan prober blanding, og 10 ng genomisk DNA. Den sanntids-PCR-reaksjon inneholdt en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser, hver bestående av 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min.
Statistical Analysis
de distribusjoner av demografiske karakteristika og genotypefrekvensene mellom saker og kontroller, samt clinicopathological funksjoner i ulike genotyper ble analysert ved Fishers eksakte test, siden den lille utvalgsstørrelsen var til stede i enkelte kategorier av variabler. De odds ratio (ORS) med sine 95% konfidensintervall (CIS) av sammenhengen mellom genotypefrekvensene og munnhulekreft ble anslått av flere logis regresjonsmodeller, etter kontroll for kovariatene. Nonparametric metoden ble brukt på grunn av ikke normalfordeling av noen variabler estimerte. Vi montert en logistisk regresjonsmodell med hovedeffekter (mirnas genetisk polymorfisme, røykestatus og betel pund tygging status), samt et interaksjonsledd mellom dem (mirnas genotyper * demografisk karakteristiske), sammenligner modellen mot en modell med bare de viktigste effektene . Interaksjon Effekten ble definert som forskjellen i deres avvik, og videre vurdert ved hjelp av likelihood ratio test for å beregne χ
2 og
p
verdier [40]. Et
p
verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Dataene ble analysert på R statistisk programvare.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Association of miRNA genotype og mutter tygge status.
doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Association of miRNA genotype og røykestatus.
doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Forholdet mellom klinisk status og miRNA499 genotyper i orale kreftpasienter (≤60 bare, N = 332).
doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s003 plakater (DOC)
Tabell S4.
Forholdet mellom klinisk status og miRNA499 genotyper i muntlig kreftpasienter ( 60 bare, N = 138).
doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s004 plakater (DOC)
Tabell S5.
Primer sekvenser og PCR betingelser for forsterkning av miRNA SNPs.
doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s005 plakater (DOC)
