Abstract
Varianter i regulatoriske områder er spådd til å spille en viktig rolle i sykdom mottakelighet for vanlige sykdommer. Polymorfismer tilordning til mikroRNA (miRNA) bindingsseter er vist å forstyrre muligheten for mirnas å målrette gener resulterer i differensial mRNA og protein ekspresjon.
Skin svulst mottakelighet 5 product: (
Skts5
) ble identifisert som et locus overdragelse mottakelighet for kjemisk-indusert hudkreft i NIH /Ola av SPRET /outbred F1 tilbakekrysninger. For å finne ut om polymorfismer mellom stammer som er tilordnet antatte miRNA bindingsseter i tre utranslaterte område (3’UTR) av gener på
Skts5
påvirket uttrykk, gjennomførte vi en systematisk evaluering av 3’UTRs av kandidatgener over dette locus. Ni gener hadde polymorfismer i sine 3’UTRs som passer ledd data og åtte av disse inneholdt polymorfismer mistenkt for å forstyrre eller innføre miRNA bindende. 3’UTRs av seks gener,
Bcap29
,
Dgkb, Hbp1, Pik3cg, Twistnb
, og
Tspan13
ulikt berørt luciferase uttrykk, men så ikke ut til å være forskjellig regulert av de evaluerte mirnas forutsagt til å binde seg til bare en av de to isoformer. 3’UTRs fra fire ekstra gener valgt fra locus som passer mindre strenge kriterier ble evaluert.
Ifrd1 Hotell og
Etv1
viste forskjeller, og inneholdt polymorfismer spådd å forstyrre eller opprette miRNA bindingsseter, men viste ingen forskjell i regulering av miRNAs testet. I sammendraget, flere 3’UTRs med antatte funksjonelle varianter mellom følsomme og resistente stammer av mus påvirket differensial uttrykk uavhengig av forventet miRNA bindende
Citation. Skeeles LE, Fleming JL, Mahler KL, Toland AE (2013) The Effekt av 3’UTR Varianter på Differential Expression of søker Cancer Følsomhets Genes. PLoS ONE 8 (3): e58609. doi: 10,1371 /journal.pone.0058609
Redaktør: Akio Kanai, Keio University, Japan
mottatt: 16 oktober 2012; Godkjent: 06.02.2013; Publisert: 05.03.2013
Copyright: © 2013 Skeeles et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis fra MGO RSG-07-083 fra American Cancer Society, CA134461 fra National Cancer Institute og OSU Comprehensive Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Toland er et akademisk redaktør i PLoS ONE. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Mus spretus
mus er motstandsdyktig mot hudkreft i forhold til
mus musculus
mus. I tidligere linkage studier av dimetylbenz [a] antracen (DMBA) /12-tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA) – indusert hudkreft ble identifisert en rekke hudkreft mottakelighet loci i SPRET /outbred ved NIH /Ola F1 backcross mus [1] – [4]. Linkage studier ble også utført med SPRET /eij av FVB /N, SPRET /eij ved NIH /Ola og STF /Pas ved NIH /Ola F1 backcross mus som er identifisert ytterligere mottakelighet loci. En av huden mottakelighet loci,
Skin svulst mottakelighet 5 product: (
Skts5
), ble funnet i SPRET /outbred ved NIH /Ola krysser, men ikke i STF /Pas ved NIH /Ola F1 eller SPRET /eij av FVB /N krysser [3], [4]. Heis resultater for SPRET /eij ved NIH /Ola var usikre for denne regionen. Sekvensanalyser av 54 gener og kodifiseringselementer på tvers av et 14 Mb topp binding region ved
Skts5
førte til identifisering av et antall kodeendringer i samsvar med sammenhengen Analyser (Mahler et al., 2008).
Differential gene expression er postulert å være like viktig, om ikke viktigere, for sykdom følsomhet som ikke-kodende synonymt endringer [5]. Genekspresjon forskjeller på grunn av arvelige faktorer kan være forårsaket av variasjoner i enhancer eller promoter-bindingsseter, variasjoner i epigenetisk regulering påvirker metylering eller kromatin modifikasjoner, variasjoner i ekspresjon av trans-virkende faktorer eller forskjeller i regulering av microRNAs (mirnas) [6] – [9]. Enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) faller spesielt i 3’untranslated region (3’UTR) av gener kan påvirke mRNA-stabilitet og translasjon gjennom virkninger på polyadenylering og regulatorisk protein-mRNA og miRNA-mRNA-interaksjoner [10] – [12]. Foreløpige studier på mennesker har identifisert variasjoner i 3’UTR av gener som synes å påvirke kreftrisiko ved å forstyrre normal miRNA bindende [13], [14]. En slik variant i
KRAS2
genet øker risikoen for lungekreft og kreft i eggstokkene ved å endre evne miRNA
la-7
å binde [15], [16]. En annen studie på mus sett på miRNA komplementære områder for tre mirnas som ble innført eller forstyrret av SNPs av allel-ubalanse sekvensering [17]. Forskjeller i uttrykk som passer med RNA-sekvensdata ble observert for en stor andel av antatte målgener, noe som tyder på at variasjoner i 3’UTRs ha en sentral rolle i genekspresjon forskjeller mellom individer.
For å finne ut om polymorfismer i antatte miRNA bindingsseter ble påvirker genekspresjon og kan være funksjonelle kandidater for
Skts5
, utførte vi en systematisk analyse av 3’UTR regionene for genene over locus. Vi identifiserte sekvensvarianter i ni gener som passer med leddanalyse (var polymorfe mellom SPRET /outbred og NIH /Ola og ikke forskjellig mellom STF /PAS og NIH /Ola eller SPRET /eij og FVB /N). SNPs fra åtte av disse 3’UTRs ble spådd å kartlegge til antatte mikroRNA bindingssteder. Ytterligere 18 gener var polymorfe mellom SPRET /outbred og NIH /Ola og SPRET /eij og FVB /N, men ikke mellom STF /PAS og NIH /Ola. Her beskriver vi effekten av variantene fra disse kandidat mottakelighet gener på uttrykk.
Materialer og metoder
Animal materielle og cellelinjer
Ingen levende dyr ble brukt i denne studien ; eksisterende DNA og vev ble gitt av samarbeidspartnere eller gjennom kommersielle kilder. UCSF og Universitetet i Roswell Park Institutional Animal Care og Bruk komiteer (IACUC) godkjent det opprinnelige dyret arbeidet som produserte prøvene brukt i denne studien. Laboratorie opprinnelsen til hver av de stammer av mus i studien er som følger: STF /PAS (innavlet linje vedlikeholdes av Institute Pasteur), SPRET /eij (innavlet linje vedlikeholdes av Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), outbred
spretus product: (SPRET /outbred, outbred linje vedlikeholdes av Hiroki Nagase, Roswell Park Institute), FVB /N (innavlet linje vedlikeholdes av Jackson laboratorier) og NIH /Ola (innavlet linje vedlikeholdes av Allan Balmain). NIH /Ola og SPRET /outbred er homozygot over
Skts5
. Vev for NIH /Ola mus ble gitt av Dr. Allan Balmain og vev for SPRET /outbred mus ble gitt av Hiroki Nagase. DNA ble isolert fra haler eller milt fra SPRET /utav og NIH /Ola mus ved bruk av standardmetoder [18]. SPRET /eij og FVB /N DNA og vev ble kjøpt fra Jackson Laboratories. STF /PAS DNA var en gave fra Xavier Montagutelli, DVM, PhD av Institut Pasteur. C5N, ble et ikke-immunogent murine keratinocytt-cellelinje oppnådd fra Allan Balmain, opprettholdt i 1x Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin antibiotika.
Sekvens analyse
3’UTRs av 39 gener kartlegging til
Skts5
som vi ikke har sekvensdata for alle stammer som brukes i ledd analysene ble identifisert ved hjelp av Ensembl database, bygger 35-48 . Vi har utformet PCR primere som bruker Integrert DNA Technologys SciTools PrimerQuest web-basert program [https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest; San Diego, CA]. PCR-produktene ble behandlet med Ekso /SAP-IT (USB, Cleveland, OH) for å fjerne enkeltkjedet DNA. Automatisert sekvensering av PCR-produkter ble utført på en ABI 3700 (Applied Biosystems /Life Technologies, Carlsbad, CA) ved standardmetoder. Primerne anvendt for PCR ble også anvendt for sekvensering. Forover og omvendt rekkefølge leser ble analysert og sammenlignet ved hjelp Lasergene /DNAstar 3,0 (DNASTAR, Madison, WI). Sekvens spor ble inspisert visuelt når et bytte nucleotide ble indikert.
Identifisering av potensielle mikroRNA bindingssteder
3’UTR polymorfismer som ble observert bare mellom NIH /Ola og SPRET /outbred ble vurdert til finne ut om de forstyrret eller innføres
i silico
spådd mikroRNA bindingssteder. Fire programmer som ble brukt: Miranda (www.microRNA.org) [19], MicroInspector (https://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/) [20], Patrocles finder (www.patrocles.org) [21] og MicroSNiPer (https://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper/getSeqByNM.php) [22]. Miranda tillatt oss å forutsi om våre SNPs av interesse forstyrret miRNA bindingsseter i mus referansestamme, som var svært lik NIH /Ola 3’UTRs. De tre andre programmer kan unike sekvenser som skal analyseres for mikroRNA bindingsseter. For nettsteder spådd av MicroInspector, vi først ansett de som hadde en anslått minimum fri energi (MFE) på mer enn -15 kcal /joule i en form og en MFE på mindre enn -20 kcal /joule i annen form. Når revurdert, bare slike som ble anslått å ha en MFE på mer enn -18 kcal /joule i en form og en MFE av -22 kcal /joule eller mindre i annen form, som har vært brukt tidligere for
Mus musculus product: [20], ble ytterligere testet eksperimentelt. -22 Kcal /J eller mindre ble ansett sterk binding og -18 kcal /J eller høyere ble ansett ingen eller svært svak binding. Patrocles og MicroSNiPer tillate sammenligning av to unike sekvenser for forskjeller i spådd bindingssteder. MicroSNiPer krever SNPs inngås prediksjon programmet, så dette verktøyet var ikke i stand til å forutse nettsider opprettet eller forstyrret av innsettinger eller slettinger. Ved hjelp MicroInspector, Patrocles, og MicroSNiPer, plukket vi kandidat mirnas som ble spådd å binde seg til bare musestamme (NIH /Ola eller SPRET /outbred), som viste lavere uttrykk målt ved vår 3’UTR luciferase assay uttrykk og som inneholdt en polymorfisme i miRNA bindingssetet som passer med musen ledd resultater.
Kloning
En del av hver kandidat gen 3’UTR som inkluderte polymorfe områder som passer med musen sammenhengen og ble spådd å forstyrre miRNA bindende ble klonet inn i Clontech pGL3 kontroll vektor (Mountain View, California) (tabell S1). Vektoren ble linearisert ved invers PCR (IPCR) ved anvendelse av Advantage HD Polymerase Mix (Clontech) i henhold til produsentens protokoll. IPCR primere ble utformet ved hjelp av IDT PrimerQuest programvare. Tømmer ble skilt fra sirkulær vektor bruker QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Frederick, MD). PCR primere for kloning ved hjelp Clontech er I-fusion HD kloning kit-protokollen ble utformet ved hjelp av IDT PrimerQuest programvare (tabell S2). PCR-produkter ble amplifisert fra NIH /Ola og SPRET /utav DNA, renset og klonet inn i vektoren 3 «av luciferase-genet ved hjelp av rekombinasjon Clontech s In-Fusion HD-kloningssettet, i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Plasmid DNA ble analysert ved restriksjons fordøyelsen og kloner ble sekvensen verifisert av Sanger-sekvensering.
seterettet mutagenese
For gener der NIH /Ola eller SPRET /outbred 3’UTR var vanskelig å klone, polymorfe områder som passer med muse bindingen ble endret ved sete-rettet mutagenese (SDM) ved bruk av plasmider som inneholdt 3’UTR av den annen stamme som templat. SDM primere ble utformet ved hjelp Stratagene sin QuikChange Primer Design Program, og SDM ble utført ved hjelp Strategene sin QuikChange Lightning Multi seterettet mutagenese Kit per produsentens anbefalte forhold (Agilent, Santa Clara, CA). Muterte plasmider ble sekvensen verifisert.
transfections /luciferase analysene
C5N celler ble ko-transfektert med pGL3 In-Fusion-produkter, PRL-TK Renilla ildflue luciferase vektor (Promega, Madison, WI) og pre-mirnas eller Mirvana ligner miRNA forløpere (Ambion /Life Technologies, Grand Island, New York) for miRNA analyser. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine med Plus Reagent (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island NY) for 3’UTR DNA transfections og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for trans bruker plasmider (600 ng /brønn av hvert plasmid) og miRNA forløpere eller egge kontroller ( 13 pmol /brønn i en 12-brønns plate). Tjuefire timer etter transfeksjon, protein ble isolert ved hjelp av M-PER (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL), og RNA ble isolert ved hjelp Ribozol (ISC Bioexpress, Kaysville, UT). For luciferase-målinger, ble en D-Luciferin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blanding, inneholdende DTT og glycylglycin tilsatt til 30 pl isolert protein i en Vertias Microplate Luminometer ved hjelp av Veritas Luciferase Assay program (Promega, Madison, WI). For å aktivere reaksjonen en ATP mix, med DTT, glycylglycin, EGTA, magnesiumsulfat
4, og K2PO
4, ble lagt. En kontroll reporter analysen inkluderte mors Coelenterizine (NanoLight Technologies, Pinetop, AZ) med ATP, DTT, glycylglycin, EGTA, magnesiumsulfat
4, og K2PO
4, lagt til 30 ul isolert protein etter den Promega Renilla protokollen. Luciferase relativ lys enhet leser ble normalisert til Renilla luciferase. Luciferase forholdstall i forhold til mock-transfekterte celler er vist. Transfeksjoner og luciferase ble utført minst to ganger for hver 3’UTR sett av konstruksjoner og miRNA analysen med unntak av
MIR-3064-3p plakater (
Pik3cg
) som bare ble testet gang og viste overbevisende resultater av ingen forskjeller. Student t-test ble brukt for å beregne betydningen av uttrykket forskjeller.
Andre eksperimentelle forhold ble testet for trans med
Twistnb
3’UTRs sammen med
MIR-3074-5p
og /eller
MIR-691
. Forsøk ble utført som beskrevet ovenfor med unntak av at C5N Cellene ble høstet ved 24, 48 og 72 timer ved bruk av en høyere konsentrasjon av miRNA (26 pmol) eller begge mirnas sammen (26 pmol hver). En lavere dose av transfekterte miRNA (7 pmol) eller begge mirnas sammen (7 pmol hver) ble også evaluert for en effekt av
Twistnb
3’UTRs ved 24 og 48 timer. Andre eksperimenter for å vurdere virkningene av
MIR-3074-5p
på
Twistnb
isoformer inkludert transfections i C5N celler med en anti-miRNA for
MIR-3074-5p
eller en negativ kontroll inhibitor på 24 og 48 timer posttransfection på to konsentrasjoner (13 pmol og 30 pmol).
bekreftelse av miRNA transfeksjon av kvantitativ PCR (qPCR)
for å bekrefte miRNA transfeksjon, RNA var isolert som beskrevet ovenfor. Revers transkripsjon (RT) ble utført ved bruk av Applied Biosystems er Multiscribe RT kit i henhold til produsentens anbefalte protokoll (Life /Applied Biosystems, Carlsbad, California). Taqman qPCR prober for mirnas ble kjøpt fra Applied Biosystems.
Sno202
ble brukt til å beregne relative uttrykk. qPCR ble utført i triplikat for hver prøve. Eksperimenter inkludert no-RT og templat-kontroller. Cycle terskel (CT) verdiene ble i gjennomsnitt over tre paralleller og delta CT-verdiene ble beregnet mellom hver test miRNA og mock kontroll.
Identifikasjon av mikroRNA kandidater
For å avgrense listen over kandidat microRNAs (miRNAs) analyserte vi både NIH /Ola og SPRET /outbred former av disse bindingssteder i to minimum fri energi (MFE) prediksjon verktøy, RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) [23] og RNAcofold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAcofold.cgi) [24]. Vi raffinert ytterligere vår liste over kandidat 3’UTRs til dem som SNPs ble spådd å indusere en 5 kcal /J eller større forskjell i miRNAbinding MFE mellom NIH /Ola og SPRET /outbred av både prediksjon verktøy (Tabell S3).
Evaluering av mRNA uttrykk ved qPCR
for å identifisere gener som viser differensial uttrykk, RNA ble isolert fra haler av NIH /Ola og SPRET /outbred mus bruker Trizol (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalte forhold. Ett mikrogram RNA fra hvert dyr ble tilbaketranskribert ved bruk av iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad, Hercules, CA). For å vurdere mRNA uttrykk for kandidaten
Skts5
gener, TaqMan prober ble kjøpt fra Applied Biosystems (Life Sciences Technologies). Hver prøve ble målt in triplo. Tre kontroll gener,
L19
,
Ppia Hotell og
hprt
, ble brukt til å beregne relative uttrykk og gjennomsnittlig forskjell i uttrykket ble beregnet på alle tre kontroller. Eksperimenter inkludert vann blanks og ingen-RT kontroller. Betydningen av dette uttrykket ble bestemt av Student T-tester.
Resultater
Identifikasjon av kandidat 3’UTRs for studien
Skts5
er en hud svulst mottakelighet locus tidligere identifisert i F1 backcross mus mellom utsatt NIH /Ola og SPRET /outbred stammer [4], [25]. Kobling til dette locus ble ikke funnet i F1 tilbakekrysninger mellom NIH /Ola og STF /PAS eller mellom FVB /N og SPRET /eij, andre hud resistente stammer av Mus spretus som tyder på at potensielt funksjonelle sekvensvarianter som var til stede i SPRET /outbred, men ikke i STF /PAS eller SPRET /eij, kan anses som kandidat varianter. I tidligere studier, sekvensert vi koding eksoner for 54 gener på minimal
Skts5
kobling regionen stammer av mus utsatt for hudkreft (NIH /Ola og FVB /N) og mus motstandsdyktig mot hudkreft (SPRET /outbred , SPRET /eij, STF /PAS) [4]. I vår første studien har vi ikke full genotyping av hele 3’UTRs for alle gener i alle stammer av mus brukt i studien. For å generere mangler sekvensdata, sekvensert vi den lengste 3’UTR versjon av 39 gener for stammene som vi manglet data, primært STF /PAS. Av genene vurdert, var det 24 3’UTR polymorfismer fra ni gener som passer de mest konservative Heise data ved at de bare var polymorfe mellom NIH /Ola og SPRET /outbred, men var ikke polymorfe mellom STF /PAS og NIH /Ola eller mellom FVB /N og SPRET /eij (tabell 1).
Effekt av 3’UTR varianter på uttrykk
Vi forventet at bare en undergruppe av de 24 3’UTR polymorfismer ville forutsies å endre miRNA bindende. For å identifisere disse SNPs, gikk vi både NIH /Ola og SPRET /outbred sekvenser i to miRNA bindende prediksjon programmer, MicroInspector [20] og Miranda [19]. Femten polymorfismer ble spådd å påvirke miRNA bindende.
Cbll1
var den eneste gen med en 3’UTR variant som passer på en forbindelse som ikke har minst én kandidat SNP spådd å forstyrre eller innføre en miRNA området (tabell 2, Tabell S3, figur S1).
for å finne ut om 3’UTRs polymorfismer berørt uttrykk, klonet vi fragmenter av 3’UTRs av 245 til 1652 bp i størrelse som inneholdt varianter av interesse for de åtte gener med polymorfismer passer ledd data og spådd å forstyrre miRNA binding (tabell S1). Den 3’UTR for
Cbll1
ble også klonet. Etter kloning av 3’UTR fragmenter av
Bcap29
,
Cbll1
,
Dgkb
,
Hbp1
,
Meox2
,
Pik3cg
,
Stxbp1
,
Tspan13
, og
Twistnb
, inn i pGL3-kontroll luciferase vektor, vi tilført konstruksjonene i C5N normale keratinocytt celler og målt luciferase nivåer av de to isoformer. Vi antok at dersom varianten i 3’UTR ble spådd å vise miRNA binding bare i en stamme, bør det være mindre luciferase-ekspresjon sammenlignet med varianten ikke er forutsagt til å binde miRNA. De uoversatt regionene for
Bcap29
,
Dgkb
,
Hbp1, Pik3cg
,
Stxbp1
, og
Twistnb
hatt polymorfe nettsteder som ble spådd å både innføre og forstyrrer antatte miRNA bindingssteder. Dermed for disse seks gener, var det ikke klart hvordan polymorfisme kan påvirke uttrykk. Av de ni 3’UTRs vurdert, seks viste statistisk signifikant differensial luciferase-ekspresjon mellom stammene (figur 1 og data ikke vist). De mest markante forskjeller i luciferaseekspresjon var i 3’UTRs av
Hbp1 Hotell og
Bcap29 plakater (figur 1). For mange av genene, både 3’UTR isoformer viste redusert luciferase uttrykk i forhold til pGL3 vektor som tyder på at mirnas eller andre reguleringsmekanismer har effekter både 3’UTR former.
Representative relative luciferase enheter normalisert å spotte for den pGL3 luciferase vektor (mørk grå), NIH 3’UTR (svart) og SPRET /outbred 3’UTRs (lys grå) for seks gener vises. P-verdier av differensial uttrykk mellom NIH /Ola og SPRET /outbred indikeres. A.
Bcap29
; B.
Dgkb
; C.
Hbp1
; D.
Pik3cg
; E.
Twistnb
; F.
Tspan13
.
Identifikasjon av variantene som påvirker antatte mikroRNA bindingssteder
Som varianter i 3’UTR regioner har vist seg å påvirke miRNA binding og påfølgende gen og protein uttrykk [15], [16], hypotese vi at 3’UTR varianter montering av ledd data kan påvirke genregulering og derfor påvirke forskjellen i kreft mottakelighet mellom NIH /Ola og SPRET /outbred mus. Seks av de ni 3’UTRs evaluert,
Bcap29
,
Dgkb
,
Hbp1
,
Pik3cg
,
Twistnb Hotell og
Tspan1
, viste differensial luciferaseekspresjon mellom NIH /Ola og SPRET /outbred, men likevel så mange av disse hadde flere SNPs som ble spådd å påvirke binding, vi ønsket å prioritere hvilke SNPs og mirnas var mest sannsynlig å gjøre dette. I tillegg, som noen SNPs ble tidligere bestemt å både presentere og forstyrre potensielle bindingsseter, vi ønsket å bruke våre luciferasepreparater data til å velge mirnas som ville passe uttrykket data. For ytterligere å forbedre vår kandidat SNP listen og velge potensielle mirnas for studier, sekvens fra 3’UTRs av gener med kandidat varianter ble vurdert å bruke ekstra miRNA bindende prediksjon programmer Patrocles, og MicroSNiPer. Vi har også brukt MicroInspector, for å identifisere bindingsseter med MFE på mindre enn -22 kcal /J i en form (sterk binding) og større enn -18 kcal /J i annen form (svak eller ingen binding), som anbefalt for Mus musculus [20]. For alle spådde miRNA bindingsseter, vi fast bestemt på i hvilken grad polymorfisme ble spådd å påvirke styrken på bindingen. Bruke RNAhybrid og RNAcofold beregnet vi en fri energi av binding av de antatte miRNAs. Vi testet uttrykk forskjeller i alle miRNA interaksjoner som viste forutsagte forskjeller på mer enn 5 kcal /J mellom de to variantformer i begge prediksjon verktøy. Alle de seks gener med varianter som passer til ledddata og viste forskjeller i luciferase-ekspresjon hadde varianter med betydelige forskjeller i forutsagte fri energi binding av mirnas, hvorav noen inneholdt SNP i den forutsagte frøet region (tabell 2, figur S1).
Effekt av microRNAs på uttrykk
for å finne ut om den anslåtte mirnas kan påvirke luciferaseekspresjon forskjeller
Bcap29
,
Dgkb
,
Hbp1
,
Pik3cg
,
Twistnb Hotell og
Tspan13
, vi co-transfektert C5N celler med NIH /Ola eller SPRET /outbred luciferasepreparater konstruerer og en forløper miRNA spådd til å binde til de variantene i samsvar med sammenhengen og våre første luciferaseekspresjon data (tabell 2). Vi valgte 13 kandidater mirnas for evaluering. Vi begynte våre studier ved bare å vurdere isoform spådd å være bundet av miRNA og evaluert både isoformer da vi så en effekt i den forventede retningen av miRNA på luciferase nivåer. mirnas for
Pik3cg product: (
MIR-707
),
Hbp1 product: (
MIR-127
,
MIR-183
, og
MIR-873
),
Twistnb product: (
MIR-718
, og
MIR-691
), og
Dgkb product: (
MIR-489
) hadde ingen innvirkning på luciferaseekspresjon (figur 2A og data ikke vist).
MIR-1940
med
Tspan13
3’UTR og
MIR-31
med
Hbp1
3’UTR redusert luciferase uttrykk for begge isoformer tilsvar noe som tyder på at disse mirnas bandt 3’UTRs i samme grad (figur 2B og data ikke vist). Andre mirnas,
MIR-128 (Bcap29), MIR-3064-3p (Pik3cg)
,
MIR-3074-5p product: (
Twistnb
) og
MIR -485 (Dgkb)
reduserte luciferase-ekspresjonen av pGL3 styre tom vektor i samme grad som den vektor inneholdende det klonede 3’UTR (figur 2C og data ikke vist). Disse dataene antyder at mirnas vi valgte for analyse ikke var ansvarlige for de observerte forskjellene i luciferaseekspresjon mellom SPRET /outbred og NIH /Ola.
Representative eksperimenter som viser ingen effekt av miRNA på luciferase uttrykk og lignende effekter av miRNA på begge isoformer er vist. A.
Dgkb
3’UTR med
MIR-489
; B.
Tspan13
3’UTR med
MIR-1940; C. Dgkb med MIR-485
. pGL3, pGL3 luciferase vektor uten innsats; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /outbred 3’UTR; NC, eggekontroll miRNA; Mørk grå barer, pGL3 luciferase vektor; Svarte striper, pGL3 vektor med NIH /Ola 3’UTR; Lys grå barer, pGL3 vektor som inneholder SPRET /outbred 3’UTR.
For å utelukke muligheten for at vi manglet differensielle effekter av mirnas på luciferaseekspresjon grunn av de eksperimentelle betingelser som benyttes, vi evaluert
Twistnb
3’UTR bruke ekstra doser av mirnas
MIR-3074-5p Hotell og
MIR-691
og flere tidspunkter etter transfeksjon. Denne 3’UTR ble valgt for å vise mer detaljert studie fordi den inneholdt varianter forventes å binde til frøet region av begge disse miRNA (figur S1). Vi observerte ingen forskjell i effekten av mirnas sammenlignet med våre opprinnelige eksperimenter (figur 3A, 3B og data ikke vist). Som mirnas kan opptre i kombinasjon, også evaluert vi
MIR-3074-5p Hotell og
Mir-691
i kombinasjon på
Twistnb
3’UTR NIH /Ola og SPRET /outbred isoformer og funnet at resultatene for kombinasjonen av
MIR-691 Hotell og
MIR-3074-5p
var identiske med de av
MIR-3074-5p
alene (figur 3A, 3B og data ikke vist). Disse resultatene tyder på at våre data er ikke sannsynlig å være et produkt av de eksperimentelle betingelser som benyttes.
Representative eksperimenter viser uspesifikk effekt av
MIR-3074-5p
og /eller
MIR-691
på begge isoformer av
Twistnb
vises med en lav dose transfeksjon av miRNA forløpere. A.
Twistnb
3’UTRs på 24 timer etter transfeksjon med
MIR-3074-5p
,
MIR-691
eller begge miRNAs. B.
Twistnb
3’UTRs på 48 timer etter transfeksjon med
MIR-3074-5p
,
MIR-691
eller begge miRNAs. pGL3, pGL3 luciferase vektor uten innsats; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /outbred 3’UTR; NC, eggekontroll miRNA; Mørk grå barer, pGL3 luciferase vektor; Svarte striper, pGL3 vektor med NIH /Ola 3’UTR; Lys grå barer, pGL3 vektor som inneholder SPRET /outbred 3’UTR.
For å ytterligere evaluere effekten av
MIR-3074-5p
på pGL3 og NIH /Ola og SPRET /outbred
Twistnb
3’UTRs, transfektert vi en inhibitor for
MIR-3074-5p Hotell og sammenlignet uttrykk for en negativ kontroll hemmer og
MIR-3074-5p
. Hvis miRNA var direkte rettet mot den antatte SPRET /outbred
Twistnb
isoform og den observerte effekt på pGL3 vektor og NIH /Ola
Twistnb
var uspesifikke effekter (figur 3A og B) , ville man forvente at tilsetting av inhibitor vil ha størst effekt på pGL3 vektor med SPRET /outbred 3’UTR. Tilsetning av anti-
MIR-3074-5p
viste størst gangers økning i luciferase uttrykk for pGL3 vektor og viste uspesifikke økning i uttrykk for SPRET /outbred og NIH /Ola isoformene som tyder på at den reduserte luciferaseekspresjon er uspesifikk (data ikke vist).
Det er mulig at endogene mirnas kan utøve maksimal knock-down og tillegg av miRNA forløper til våre C5N cellene ville ikke fremkalle ytterligere nedgang i luciferase uttrykk. For å vurdere denne muligheten vi målte miRNA uttrykk for vår RNA høstet fra C5N celler som var mock-transfektert. Av notatet, alle de mirnas evaluert viste tegn til uttrykk i den ikke-transfektert med qPCR, men de fleste av disse ble uttrykt ved relative nivåer på 1% eller mindre av kontroll,
sno-202
. Derfor, for de fleste av miRNAs i denne studien, endogene nivåer av uttrykk i C5N cellene er usannsynlig å forårsake maksimal knockdown av den anslåtte mål 3’UTR. MicroRNAs viser høyere nivå av endogen uttrykk inkludert
MIR-31 plakater (252% av kontroll),
MIR-183 plakater (12,5% av kontroll),
MIR-675-3p
(2,2% av kontroll) og
MIR-3074-5p plakater (3,7% av kontroll).
mRNA uttrykk av kandidat målgener
En effekt av miRNA binding til mRNA er nedbrytning av mRNA produkt og redusert ekspresjon. Gener kartlegging til
Skts5
ble vurdert av qPCR for å finne ut om det var forskjeller i halen mRNA mellom NIH /Ola og SPRET /outbred. Av de testede genene inneholder kandidat 3’UTR varianter fant vi signifikante forskjeller i mRNA uttrykk i
Bcap29
,
Hbp1
,
Pik3cg
,
Twistnb og Tspan13
, men ingen signifikante forskjeller i uttrykket av
Dgkb Hotell og
Meox2 plakater (figur 4 og data ikke vist). Uttrykk for
Stxbp6
var for lavt for sammenligning. Gener som viste konsistente resultater mellom luciferaseekspresjon analyser og qPCR er
Bcap29 plakater (høyere uttrykk i NIH /Ola),
Hbp1 plakater (høyere uttrykk i SPRET /outbred),
Meox2 product: (ingen signifikant forskjell i uttrykket),
Twistnb plakater (høyere uttrykk i NIH /Ola) og
Tspan13 plakater (høyere uttrykk i SPRET /outbred).
Bcap29
viste den høyeste grad av forskjell, ca 15 ganger høyere uttrykk i NIH /Ola enn SPRET /outbred (figur 4).
Dgkb
viste ingen signifikant forskjell i mRNA-ekspresjon, men høyere luciferase-ekspresjon av NIH 3’UTR.
Pik3cg
viste høyere uttrykk av SPRET /outbred mRNA, men lavere luciferase uttrykk. Således, fem av de syv genene vurdert ved qPCR viste forenlig uttrykk mønstre mellom mRNA og effekten av 3’UTR på luciferase-ekspresjon. Som mirnas virker på to måter, en ved å øke mRNA degradering og den andre ved å forstyrre translasjon, er det mulig som ville bli observert noen forskjell i mRNA-ekspresjon, selv når differensial miRNA binding finner sted [26], [27].
Kvantitativ PCR sju gener evaluert for differensial luciferaseekspresjon mellom SPRET /outbred og NIH /Ola 3’UTR vises.
