Abstract
Bakgrunn
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft, og eggstokkreft klarcellet karsinom subtype (OCCA) demonstrerer en særlig dårlig respons på standard behandling. Forbedringer i eggstokkreft utfall, spesielt for OCCA, kunne forventes fra en klarere forståelse av den molekylære patologi som kan lede strategier for tidligere diagnose og mer effektiv behandling.
Metodikk /hovedfunnene
Cell -SELEX teknologien ble anvendt for å utvikle nye molekylære prober for ovarial cancer celleoverflatemarkører. Totalt tretten aptamerer med K
d’s til eggstokkreft celler i pico- å nanomolar utvalg ble oppnådd. Foreløpige undersøkelser av målene for disse aptamerer og deres bindende egenskaper ble også utført.
Konklusjon /Betydning
Vi har valgt en rekke aptamerer som binder seg til forskjellige typer eggstokkreft, men ikke livmorhals kreft. Selv om binding til andre kreftcellelinjer ble observert, kan disse aptamerer føre til identifisering av biomarkører som er relatert til kreft
Citation. Van Simaeys D, López-Colón D, Sefah K, Sutphen R, Jimenez E, Tan W (2010) Utredning av Molecular Anerkjennelse av aptamerer Valgt gjennom Ovarian Cancer Cell-SELEX. PLoS ONE 5 (11): e13770. doi: 10,1371 /journal.pone.0013770
Redaktør: Cameron Neylon, University of Southampton, Storbritannia
mottatt: 3 mai 2010; Godkjent: 06.10.2010; Publisert: 01.11.2010
Copyright: © 2010 Van Simaeys et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takke National Institutes of Health (NIH) for støtte (R01GM079359, R01 CA133086, R01-CA106414). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den femte vanligste kreftformen hos kvinner [1], og har den høyeste dødeligheten av noen gynekologisk kreft. Denne sykdommen er preget av få tidlige symptomer, presentasjon på et avansert stadium i de fleste tilfeller, og dårlig overlevelse [2] – [8]. Prognosen er spesielt dårlig for pasienter med eggstokkreft klart celle adenokarsinom (OCCA), som ofte er resistent mot standard platina-basert kjemoterapi [6] -. [10]
Den mest brukte serum biomarkør for klinisk diagnose og prognosen er kreft i eggstokkene antigen 125 (CA-125). CA-125 verdi er forhøyet i ca 90% av sene stadier av tilfeller av ovarialcancer (trinn 3 og 4). Det er imidlertid bare forhøyet i 50-60% av kvinner med tidlig fase sykdom og er også forhøyet i et antall av godartede tilstander [2], [5], [7], [11] – [13].
utnyttelsen av aptamerer har et stort potensial for identifisering av nye biomarkører. Aptamerer, som er prober som er i stand til spesifikt å binde til celleoverflatemarkører som uttrykkes av målrettede tumorceller [14] – [21], er korte enkelt-trådede oligonukleotider på omtrent 100 nt. De er valgt fra store kombinatoriske dammer av sekvenser ved Systematisk Utviklingen av ligander med eksponensiell Enrichment (SELEX) for deres evne til å binde til mål, som kan variere fra små molekyler til proteiner eller polysakkarider, så vel som tumor-celler [16] – [19 ], [21] – [23]. Aptamerer har veldefinerte tertiære strukturer som bestemmer selektiviteten til sine mål.
Målet spesifisiteten og affiniteten av aptamerer er lik de av antistoffer, men med flere fordeler i forhold til antistoffer for klinisk bruk. Aptamerer kan bli kjemisk syntetisert i løpet av kort tid ved forholdsvis lav kostnad, slik at bedre batch-til-batch-reproduserbarhet og lettere inkorporering av kjemiske modifikasjoner. Siden aptamerer for celler velges uten forutgående kjennskap til målmolekyler, kan valgte aptamerer brukes til å identifisere nye overflatemarkører på kreftceller [14], [16] – [18], [20], [24] – [27] .
i dette arbeidet ble det i alt 13 aptamerer valgt for to modell eggstokkreft cellelinjer: den OCCA linjen TOV-21G [28] (10 aptamerer) og eggstokkreft serøs adenokarsinom linje CAOV-3 [29 ] (3 aptamerer). De celleoverflate mål for de aptamerer ble også kort undersøkt. Foreløpige undersøkelser av aptamerer «mål og bindende egenskaper ble også utført
Resultater og Diskusjon
To modell eggstokkkreft cellelinjer ble valgt for valg av eggstokkreft aptamerer. Den OCCA cellelinje TOV -21G og eggstokkreft serøs adenokarsinom cellelinje CAOV-3. For å identifisere aptamerer som spesifikt bindes til eggstokkreft celler ble livmorhalskreft cellelinjen HeLa anvendt for motstrøms valg. Den SELEX prosedyre for TOV-21G er beskrevet kort nedenfor. En detaljert beskrivelse er gitt i den eksperimentelle delen.
For å starte utvelgelsesprosessen, 20 pmol naiv bibliotek ble beriket av sekvensielle bindende for TOV-21G cellemonolag. Sekvenser som viser ikke-spesifikk binding til generell celleoverflatemarkører ble fjernet ved inkubering av det anrikede basseng med HeLa-celler (runder 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 20, 21, 22). Den elueres basseng for hver runde av SELEX ble forsterket gjennom PCR, hvoretter ssDNA bassenger av interesse ble gjenvunnet og overvåket for berikelse mot TOV-21G ved flowcytometri. Som de valgte bassengene ble anriket med sekvenser som gjenkjenner og binder seg til mål-cellelinje, ble en økning i fluorescens-signal observert (Figur 1a). Men forsøk på å utelate mot valget i runder 13 til 19 førte til berikelse for HeLa-bindende sekvenser. Sekvensene binding til HeLa-celler ble fjernet ved disken utvalg i senere runder, mens berikelse mot målet cellelinjen ble opprettholdt (Figur 1b). Etter 22 runder med SELEX, et anriket basseng som spesifikt bundet til modellen OCCA cellelinje, men marginalt til HeLa-celler, ble erholdt (figur 2). Således bassenget var vellykket anriket for sekvenser bindende overflatemarkører som uttrykkes av den modell OCCA cellelinje, men ikke med cervikale kreftceller.
A) anrikning med TOV-21g-celler B) Den marginale binding av de respektive bassengene til HeLa celler. Ved å gjøre disken utvalget, ble sekvenser som binder til HeLa fjernet.
Den negative kontrollen i disse bindingsanalyser var PE /Cy5-merket tilfeldig bibliotek. C) Celler ble inkubert med varierende konsentrasjoner av PE-Cy5-merkede aptamer i duplikat. Fluorescens intensitet som stammer fra bakgrunnsbinding ved hver konsentrasjon ble trukket fra middelverdien fluorescens intensitet av den tilsvarende aptamer
Etter gjennomføring av utvelgelsesprosessen, tre bassenger ble valgt og presentert for sekvensering. Finale bassenget (runde 22), den tidligere pool (runde 21) og et basseng som viser minimal berikelse (rundt 13). Pool sekvensering ble brukt til å identifisere aptamer kandidater ved å generere store mengder sekvenser. Dette antallet av sekvenser (her et minimum av 2000 per pool) er stor nok til å tillate identifikasjon av aptamerer som bare har en liten representasjon i bassenget (det vil si mindre enn 1%). Som man kan se i tabell 1, er valgt aptamerer var faktisk til stede allerede i en minimal berikelse ble observert. AptTOV1 størrelse prosentvis redusert som SELEX fortsatte, noe som er bemerkelsesverdig gitt den høye affinitet dette aptamer. Dette problemet har også blitt observert i andre valg [30]. Andre aptamerer viser en konsekvent økning i størrelse i prosent som berikelse økt. Resultatene fra AptTOV6 er inkludert for å demonstrere at selv relativt små familier kan føre til aptamerer.
Sekvenser ble justert inn i familier i henhold til sekvens homologi. Antallet homologer ble sammenlignet på tvers av de ulike sekvensert bassenger å validere sin berikelse gjennom utvelgelsesprosessen ved hjelp av grunnleggende bio- informatikk. Ti sekvenser som viser den beste homologi gjennom bassengene ble valgt som aptamer kandidater, syntetisert og testet for binding til modell eggstokkreft cellelinjer. Alle kandidatene viste binding til TOV-21G, med bindende slektskap i pico- til nano-molar området (tabell 2). Dette viser mulighetene for neste generasjon sekvensering i SELEX til å bli en kraftig og reproduserbar metode for utvikling av aptamerer.
Som vist i tabell 2, aptamerer aptTOV1 (K
d = 0,25 ± 0,08 nM) og aptTOV2 (0,90 ± 0,25 nM) binder svært tett til TOV-21g celler. Som vist i tabell 2, kan begge aptamerer skille TOV-21G fra HeLa-celler.
Bindingen av de utvalgte aptamerer ble testet med forskjellige adenocarcinoma cellelinjer, så vel som andre typer av kreftcellelinjer, slik som vist i Tabell 2. Fem av de utvalgte mot TOV-21G aptamerer viste binding til CEM-celler (akutt lymfatisk leukemi), mens ingen av de aptamerer bundet til Ramos-celler (Burkitt lymfom) eller HL-60 (for akutt leukemi). Alle de oppnådde aptamerer bindes til kolorektal adenokarsinom (HCT-116) og glioblastom (A172). De aptamerer oppnådd fra TOV-21G ikke bindes til DLD-1 (Dukes «C colorectal typen adenokarsinom), mens aptamerer som kommer fra CAOV-3 ble bundet til denne cellelinje. Denne atferden er lik den som er observert i tidligere arbeid utført i vårt laboratorium.
Siden begge valg fant sted ved 4 ° C, ble de utvalgte aptamerer testet ved fysiologiske forhold. De aptamerer ble inkubert med mål-cellelinje ved 37 ° C og 4 ° C, og deres binding ble målt. Alle aptamerer viste lignende binding ved 4 ° C og 37 ° C (f.eks aptTOV1 i figur 2a), noe som tyder på at de har potensiale for in vivo-studier.
For å undersøke naturen av målmolekylet av hver aptamer, bindingen av hvert aptamer ble testet etter behandling av målcellene med proteasene trypsin eller proteinase K. Som det fremgår av figur 3a, viser aptTOV1 en tydelig tap av binding til TOV-21G etter protease behandling. Det samme atferd ble også observert med alle andre aptTOV aptamerer. Interessant, for den andre modellen cellelinje, CAOV-3, DOV3 og DOV4 beholdt deres binding etter protease behandling (figur 3b), hvilket antyder at disse aptamerer ikke kan binde til celleoverflatemembranproteiner, men snarere til en annen type markør celleoverflate (dvs. karbohydrat eller lipid). Hverken DOV3 eller DOV4 binder seg til de testede leukemi-celler (tabell 3).
A) Ingen binding ble observert for aptTOV1 til trypsinert TOV-21g-celler. B) Binding av DOV 3 og 4 til CAOV-3-celler ble ikke påvirket av protease behandling. Alle andre aptamerer viste samme oppførsel som er representert i en).
I konklusjonen, har vi valgt en rekke aptamerer med høy affinitet for eggstokkreft celler, inkludert OCCA (TOV-21G) og serøs adenokarsinom (CAOV-3). Ved disken utvalg mot HeLa-celler, ble aptamerer som kan skille eggstokkreft fra livmorhalskreft valgt. Spesielt AptTOV 1 viste svært høy affinitet mot TOV-21G, med en K
d på 250 pM.
Gitt den begrensede antall av biomarkører for eggstokkreft for tiden tilgjengelig, aptamerer oppnådd fra disse valgene ha potensialet for å forbedre diagnose og behandling av denne dødelige sykdom. Fordi aptamerer også binde godartede cyster (tabell 3), kan aptamerer ikke benyttes til å identifisere eggstokkreft
per se
. Men siden aptTOV apamers ikke binde seg til en kreft av tilsvarende etiologi (CAOV3) og heller ikke å HeLa, de har fortsatt potensial til å gi mer innsikt i patologi for eggstokkreft. Det har blitt observert at det er betydelige forskjeller i proteomet av serøs og klarcellet eggstokkreft [31]. Målene for disse aptamerer er mest sannsynlig ned regulert eller brakt til taushet i disse to cellemodeller. I tillegg er AptTOV aptamerer viser binding til kreftcellelinjer fra forskjellige ikke-relatert kreft (Tabell 3), og noen AptTOV aptamerer også binde CEM-celler. Dette resultatet tyder på at aptamerer som oppnås fra denne SELEX kan anvendes for profilering ekspresjon av membranproteiner av forskjellige kreftformer. Identifisere målene for de valgte aptamerer ventes å kaste lys over de underliggende mekanismene som er involvert.
Oppdagelsen av to aptamerer som var ufølsom for proteasenedbrytning er spennende. I tillegg er deres binding til alle testede adenokarsinomceller, men ikke til noen av leukemicellelinjer, foreslår muligheten for ytterligere å belyse de underliggende molekylære forskjellene mellom disse krefttypene. Videre undersøkelser er garantert å identifisere målene for disse aptamerer og vurdere sine resultater i kliniske prøver.
Materialer og metoder
Instrumentering og reagenser
Alle oligonukleotider ble syntetisert ved standard fosforamiditt kjemi ved anvendelse av en 3400 DNA-syntetisator (Applied Biosystems) og ble renset ved omvendt-fase HPLC (Varian Prostar). Alle PCR-blandinger inneholdt 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,0 mM MgCl
2, dNTP (hver ved 2,5 mM), 0,5 uM av hver primer, og Varmstart Taq DNA-polymerase (5units /ul ). PCR ble utført på en Biorad Thermocycler og alle reagenser ble anskaffet fra Takara. Overvåking av bassenget berikelse, karakteriseringen av de valgte aptamerer, og identifisering av målet proteinanalyser ble utført ved strømningscytometrisk analyse ved anvendelse av et FACScan-cytometer (BD Immunocytometry Systems). Trypsin og proteinase K ble kjøpt fra Fisher Biotech. Den avbildning av celler ble utført med et Olympus FV500-IX81 konfokal mikroskop (Olympus America Inc., Melville, New York). DNA-sekvensene ble bestemt av genomsekvense Services Laboratory ved University of Florida med bruk av 454-sekvensering (Roche).
Cell kultur og buffere
CAOV-3, HeLa, Hs832 (C) T og TOV-21G cellelinjer hvor innhentet fra American Type Cell Culture (ATCC). Den CAOV-3 og TOV-21G ovarian kreft cellelinjer der holdt i kultur med MCBD 105: Medium 199 (1:01); HeLa-cellelinjen ble dyrket i RPMI-1640; og den Hs832 (C) T-cellelinje ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Alle medier der supplert med 10% FBS og 100 UI /ml penicillin-streptomycin. Andre cellelinjer som benyttes for selektivitet analyser inkludert CEM (T-celle leukemi), Ramos (Burkitt lymfom), HCT-116, DLD-en, HT-29 (kolorektal adenokarsinom), NCI_H23 (ikke-småcellet lungekreft) og A172 (glioblastom ), som alle ble dyrket i henhold til ATCC spesifikasjonene. Alle cellelinjer hvor inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære.
I løpet av utvelgelse, ble cellene vasket før og etter inkubasjon med vaskebuffer (IM), inneholdende 4,5 g /l glukose og 5 mM MgCl
2 i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning med kalsiumklorid og magnesiumklorid (Sigma). Bindingsbuffer (BB) som brukes for seleksjon ble fremstilt ved tilsetning av gjær-tRNA (0,1 mg /ml) (Sigma) og BSA (1 mg /ml) (Fisher) i vaskebufferen for å redusere bakgrunnsbinding.
SELEX bibliotek og primere
HPLC-renset bibliotek inneholdt et segment av randomisert sekvens på 40 nukleotider (nt) flankert av 20-nt primer hybridisering sider:
(5’ATC CAG AGT GAC GCA GCA (N)
40 TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3 «) og (5»-ACT ACC AAC GAG CGA CCA CT (N)
40 AGA GTT CAG GAG AGG CAG GT-3′). De fremre primere ble merket med 5′-FITC og det reverse primere ble merket med 5′-biotin.
In vitro celle-SELEX
I denne studien ble TOV-21G ble anvendt som målrette cellelinje HeLa og ble anvendt for motstrøms valg. For første runde, ble cellene inkubert med 20 pmol naive ssDNA bibliotek oppløst i BB. For senere runder, ble 50 pmol beriket basseng som brukes for inkubasjon, også oppløst i BB. Før inkubering ble ssDNA bassenget denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter og ble hurtig avkjølt på is i 5 minutter, slik at hver sekvens for å danne den mest stabile sekundærstruktur.
Cellene ble vasket to ganger ( 2 min) med WB og inkubert med DNA-basseng på is i en orbital rystemaskin i 30 min. I senere seleksjonsrunder ble cellene vasket med øket stringens for å fjerne svakt bindingssekvenser (et større antall vaskinger og økt vaske tid, opp til 5 min). De bundne sekvenser ble eluert i 500 ul BB ved oppvarming ved 95 ° C i 15 minutter, avkjølt på is i 5 minutter og sentrifugert ved 14.000 rpm i 2 min.
Supernatanten som inneholdt DNA-sekvensene ble deretter inkubert med en negativ cellelinje for å utføre en subtraksjon av generell sekvenser, som beskrevet ovenfor. De resterende sekvenser ble amplifisert ved PCR ved å bruke FITC- og biotin-merkede primere. Amplifikasjoner ble utført ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av endelig forlengelse i 3 minutter ved 72 ° C. Den valgte forstand ssDNA ble separert fra den biotinylerte antisense-ssDNA av streptavidin-belagte Sepharose-kuler (Amersham Bioscience). SsDNA ble eluert fra Sepharose-kuler ved å smelte i en 0,2 M NaOH-løsning.
anrikning av spesifikke sekvenser ble analysert ved hjelp av flow cytometri som forklart nedenfor. Når nivået av berikelse nådd et platå, ble bassenger av interesse legges for sekvensering. Den aptamer utvalg for CAOV3 cellelinje ble utført ved anvendelse av den samme protokoll, men en 1 minutt trypsinering trinn ble benyttet for å suspendere cellene før tilsetning av bassengene. Supplerende data S1 og S2 inneholder Clustal data for justeringer av hvert valg (endelig pool)
Affinity studier:. Flyt cytofluorometriske analyse for bestemmelse av bindingsaffiniteten
For å bestemme bindende slektskap de aptamerer, målcellene (5 x 10
5) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av 5′-biotin-merkede aptamerer på is i 20 minutter i 100 mL av BB. Cellene ble deretter vasket to ganger med 500 mL av BB, og suspendert i 100 ul inneholdende BB streptavidin-PE-Cy5.5. Cellene ble deretter vasket to ganger med 500 mL av WB, og ble suspendert i 200 ul av BB for flowcytometrisk analyse, ved anvendelse av en 5′-biotin-merket tilfeldig sekvens som den negative kontroll. Alle eksperimenter for bindingsanalyser ble gjentas minst 2 ganger. Den spesifikke binding intensitet ble beregnet ved subtraksjon av den midlere fluorescens intensiteten av bakgrunnsbinding fra den midlere fluorescensintensitet av aptamerer. Likevekts-dissosiasjonskonstanten (K
d) av den fluorescerende ligand ble oppnådd ved å tilpasse en kurve av den spesifikke binding intensitet versus (Y) den aptamer konsentrasjon (X) til ligningen Y = B
maxX /(K
d + X) med Sigmaplot. (Jandel, San Rafael, CA). data Supplemental S3 inneholder strømningsdata for alle eksperimenter som presenteres i denne artikkelen.
selektivitet og spesifisitet
For å bestemme celle spesifisitet av de valgte aptamerer, cellelinjer inkludert HeLa, K562, H23, H69 , A172, HL-60. HT-29, ble Ramos og CEM anvendt i bindingsanalyser ved flow-cytometri som beskrevet ovenfor.
Effekt av temperatur på binding aptamer
aptamer utvelgelsesprosess, og alle bindingsanalyser ble utført på is. Det har blitt observert at noen av de utvalgte ved lavere temperaturer aptamerer ikke kan binde seg godt ved 37 ° C [26], noe som fører til dårlig ytelse under fysiologiske betingelser. For å bekrefte binding stabilitet, ble aptamerer inkubert med målet ved 37 ° C, og fluorescens-intensitet ble bestemt ved flow-cytometri. Aptamerer inkubert på is ble anvendt som positiv kontroll.
proteasenedbrytning assay
Målceller (5 x 10
5) ble løsnet ved hjelp av ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning. Etter resuspendering, ble cellene vasket med 3 ml PBS og deretter inkubert med 1 ml av 0,05% trypsin /0,53 mM EDTA i HBSS eller 0,1 mg /ml proteinase K i PBS ved 37 ° C i 1, 5, 15, 30 og 60 minutter. Pure FBS tilsatt for å stanse de proteinaser. Etter vasking med 2 ml av BB, ble de behandlede celler anvendt for bindingsanalyser, som beskrevet ovenfor.
Hjelpemiddel Informasjon
data S1.
allignment av den endelige TOV bassenget
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013770.s001 plakater (1,13 MB TXT)
data S2.
allignment av den endelige CAOV3 bassenget
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013770.s002 plakater (0,20 MB TXT)
data S3.
Denne filen inneholder strømningsdata fra det som presenteres i denne artikkelen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013770.s003 plakater (3,69 MB ZIP)
data S4.
Legend til mengden av positive. Dette tallet var vår rettesnor for å bestemme mengden av plusser for tabell 3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0013770.s004 plakater (0,04 MB PDF)
Takk
Vi takker legene. Parag Parekh og Tahir Bayrac for de mange nyttige faglige diskusjoner som bidro til dette arbeidet, Mr. George Ansoaunoor for teknisk hjelp. Vi takker også Dr. Kathryn Williams for hennes kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi takker DNA-sekvensering kjernen, ICBR, ved University of Florida.
