Abstract
Bakgrunn
Patogenese og faktorer for å bestemme utviklingen av alkoholholdige og alkoholfrie steatose til steatohepatitis med risiko for ytterligere progresjon til skrumplever og kreft er dårlig forstått. I denne studien ønsket vi å identifisere potensielle molekylære signaturer for diskriminering av steatohepatitis fra steatose.
Metode og resultater
Globalt microarray analyse av genuttrykk ble brukt til å rakne differensielt uttrykte gener mellom steatohepatitis forhold til steatose og kontrollprøver. For funksjonell annotering samt identifisering av sykdoms relevante biologiske prosesser av differensielt uttrykte gener genet ontologispråk (GO) database ble anvendt. Valgte kandidat gener (n = 46) ble validert i 87 prøver humane lever fra to prøve kohorter av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR). GO analyse viste at genene nedregulert i steatohepatitis var hovedsakelig involvert i metabolske prosesser. Gener oppregulert i steatohepatitis prøver ble assosiert med kreft progresjon og spredning. I kirurgisk leverreseksjon prøver, 39 gener og perkutane leverbiopsier, 30 gener var signifikant oppregulert i steatohepatitis. Videre immunhistokjemisk undersøkelse av menneskelige leveren vev viste en signifikant økning av AKR1B10 protein uttrykk i steatohepatitis.
Konklusjoner
Utviklingen av steatohepatitis er preget av forskjellige molekylære endringer. De mest slående eksemplene i så måte var
KRT23 Hotell og
AKR1B10
, som vi har funnet å være svært forskjellig uttrykt i steatohepatitis sammenlignet med steatose og normal leveren. Vi foreslår at
KRT23 Hotell og
AKR1B10
kan tjene som fremtidige potensielle biomarkører for steatohepatitis samt markører for progresjon til HCC
Citation. Starmann J, Fälth M, Spindelböck W, Lanz KL, Lackner C, Zatloukal K, et al. (2012) Gene Expression Profilering avslører kreft-relaterte Lever Molecular signaturer i steatohepatitis men ikke i Steatose. PLoS ONE 7 (10): e46584. doi: 10,1371 /journal.pone.0046584
Redaktør: Wing-Kin Syn, Institute of Hepatology London, Storbritannia
mottatt: 5 april 2012; Godkjent: 02.09.2012; Publisert: 10. oktober 2012 |
Copyright: © Starmann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av finansieringen av Østerrike Wirtschaftsservice GmbH (AWS) og den østerrikske Nationalstiftung gjennom rammen av IMGuS forskningsprogram (institutt for medisinsk og Genome Research and Systems Biology, Wien). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Østerrike Wirtschaftsservice GmbH er en ikke kommersiell offentlig finansiering etat organisert som en non profit GmbH. Det var verken involvert i alle beslutninger om retning finansiert forskning eller i studien design; innsamling, analyse og tolkning av data; skriving av papir; og beslutningen om å sende inn for publisering. Finansiering gjennom Østerrike Wirtschaftsservice GmbH endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Fatty leversykdommer omfatter et spekter av alvorlighetsgrad fra enkle steatose løpet steatohepatitis til skrumplever og leverkreft (HCC) [1], [2]. Det er to viktige årsaker til fettleversykdom, nemlig alkohol og metabolsk syndrom-assosierte lidelser så som fedme og type 2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2). På grunn av sin høye forekomsten og potensialet for alvorlige lever utfall som skrumplever og HCC i en betydelig del av berørte enkeltpersoner, har fatty leversykdom blitt et stort problem for folkehelsen. Opptil 30% av befolkningen er berørt av alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD), som strekker seg opp til 70% blant diabetikere [3], [4]. Forekomsten av steatose og steatohepatitis hos overvektige pasienter som gjennomgår fedmekirurgi er så høyt som 76% og 37%, henholdsvis [3], [5]. Steatohepatitis utvikler seg i omtrent 20% av alkoholikere og opp til 50% av diabetes mellitus type 2 som også er overvektige (BMI 30). Dette plasserer fatty leversykdom som den vanligste leversykdom av 21
århundre regnskap for de fleste av skrumplever og HCC i vestlige land. Dens utbredelse er forventet å ytterligere øke i lys av den pågående epidemi av diabetes og fedme [1], [2].
Mens enkel steatose har en relativt godartet kurs og er i hovedsak reversible, bærer steatohepatitis en dårlig prognose og kan føre til alvorlige leverskader med progresson til skrumplever og HCC. Konvensjonelle ikke-invasive markører som serumtransaminaser korrelerer dårlig med risiko for utvikling samt progresjon av leversykdom, og tilgjengelige rutineleverprøver kan også være dagligdags i en betydelig andel av pasienter med steatohepatitis [6]. Derfor i dagens standard klinisk praksis, har ikke-invasive serum og bilde markører ikke tillate forskjellsbehandling av relativt godartet fettlever fra progressiv steatohepatitis. Dette resulterer i underdiagnostikk og underbehandling av disse lidelsene. Utviklingen av effektive diagnostiske, prognostiske og terapeutiske strategier har blitt vesentlig hemmet av det faktum at vår forståelse av den molekylære patogenesen av steatohepatitis er fremdeles ufullstendig. Flere studier viser at de ulike formene for steatohepatitis (alkoholiker – ASH, alkoholfrie – NASH) kan ikke være morfologisk skilles, noe som tyder på en felles patogenetisk mekanisme tross for ulike årsaker til sykdommen [7]. Et stort uløst problem er markert forskjell i den individuelle risikoen for å utvikle steatohepatitis og å utvikle seg til skrumplever (f.eks bare 20% av stordrikkere eller 50% av overvektige type II diabetikere utvikle steatohepatitis, latinamerikanere og kaukasiere er mer utsatt enn Afro- amerikanere [8], [9]). Imidlertid er de faktorer som er ansvarlige for sykdomsprogresjon over hele spekteret av fettleversykdom dårlig forstått. Hvorfor noen pasienter er beskyttet mot å utvikle steatohepatitis eller enkle steatose, mens andre ikke er det, er fortsatt uklart [10]. Det er i dag også diskutert om steatose og steatohepatitis representerer to påfølgende sykdomsstadier; alternativt enkeltpersoner kan
a priori
være forhåndsinnstilt til å utvikle enten en ganske godartet steatose eller prognostisk ugunstig steatohepatitis [4].
I denne studien, utførte vi microarray-baserte genuttrykk profilering analyse av steatose og steatohepatitis og sammenlignet dem med normale prøver humane lever. Vi har fokusert på å analysere transkripsjons endringer av gener relevante i steatohepatitis men ikke i steatose og normal leveren til å identifisere potensielle signaturer som grunnlag for videre utvikling av biomarkører i diskriminering av steatohepatitis som en prognostisk mer relevant sykdom enhet. Spesielt, vi tar sikte på å undersøke molekylære endringer mellom steatohepatitis og steatose, snarere enn å skille mellom sykdom etiologi ved NALFD. Totalt sett validert vi uttrykket av 46 målgener i prøver humane lever fra to kohorter. Vi viser en hittil ukjent molekylær signatur for kreftrelaterte forandringer i steatohepatitis men ikke i steatose. Flere gener ble svært betydelig uttrykt i steatohepatitis sammenlignet med steatose og normal leveren. Den tilhørende protein av ett gen (
AKR1B10
) ble uttrykt i steatohepatitis vev. Genet signatur rapportert i denne studien kan tjene som et verdifullt verktøy for å skille mellom steatose og steatohepatitis samt for fremtidig utvikling av diagnostiske og prognostiske biomarkører. Videre resultatene gir viktig innsikt i patogenesen av sykdommen, som også kan være relevant for utformingen av fremtidige terapeutiske strategier.
Metoder
Pasient vevsprøver
Den detaljerte kliniske, biokjemiske og histologiske data av de studerte pasientene er gitt i tabell 1, 2 og 3. studien ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Graz (EK-nummer: 20-119 ex 08/09). De diagnoser av alle prøvene som ble brukt var histologisk validert av et styre sertifisert patolog (C.L.) før molekylær analyse. For histologisk analyse, hematoxylin og eosin (H E) og chromotrope anilin blå (CAB) farget seksjonene ble brukt. En histologisk diagnose av steatosis ble gjort hvis mer enn 5% av parenchymal området var okkupert av steatose hjelp av rutine H steatose, n = 30; steatohepatitis, n = 10, av disse 8/2 cirrhose /non-cirrhose) oppnådd fra pasienter som gjennomgikk lever resections grunn av HCC (n = 7), andre ondartede leverkreft (n = 33, 20/33 tykktarmskreft) eller godartede svulster (n = 7) (tabell 1 og 2 ). Åtte pasienter fra hvem ble hentet steatose prøvene hadde fått en platin-holdig kjemoterapi (7/8 FOLFOX) tre måneder før reseksjon. Selv steatose kan være en bivirkning av FOLFOX behandling, var det ingen indikasjon på at disse sakene var knyttet til kjemoterapi. I tillegg ble vevsprøver fra eksplanterte donor lever ikke benyttes til transplantasjon (n = 11) inkludert.
Den andre kohort ( «Biopsi kohort», n = 29) omfattet perkutane leverbiopsiprøver inkludert steatose (n = 13), steatohepatitis (n = 11, av disse, 5/6 cirrhose /ikke-cirrhose), og kronisk hepatitt C (CHC, n = 5, alle genotype 1) som sykdomskontroller med fravær av steatose. I Biopsi kullet ble CHC prøvene anvendt som kontroller siden pasienter med normalt levervev ikke gjennomgår perkutan leverbiopsi (tabell 3). Informert samtykke ble oppnådd fra alle pasienter før bruk av en alikvot av leverbiopsi vev for molekylær analyse.
RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll
Total RNA ble isolert fra prøvene ved hjelp av TRI Reagent® (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) i henhold til produsentens protokoller. RNA kvalitet ble analysert ved hjelp microcapillary elektroforese (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Böblingen, Tyskland). Bare prøver med RIN (RNA integritet nummer) på 5,0 eller høyere ble utsatt for genekspresjon rekke analyse.
Illumina microarray eksperimenter og dataanalyse
Global genekspresjon screenings ble utført ved hjelp av Biobank prøver bare ( steatohepatitis n = 8 (6/2 cirrhose /non-cirrhose), steatose n = 14 og kontroller n = 10). For genekspresjonsanalyser, brukte vi hele genomet uttrykk microarray Sentrix® Human-6 v3 uttrykk perle chips (Illumina®, San Diego, CA, USA) som omfatter 49577 funksjoner. Forsøkene ble utført ved Genomics og proteomikk Kjerne Facility av DKFZ Heidel å bruke 300 ng /mL RNA og protokoller anbefalt av leverandøren.
Rådataene ble log2-transformert og quantile-normalisert. Principal Components Analysis (PCA) ble utført for å undersøke den interne datastruktur på en måte som best forklares variansen i data og for å identifisere potensielle utliggere. R-pakke «limma» ble brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener [14]. Med «limma», en lineær modell er montert for hvert gen, og en t-test blir anvendt for å identifisere differensial uttrykte gener. P-verdiene ble justert for multippel testing med Benjamini-Hochberg (BH) prosedyre. I tillegg ble en fold endring av i det minste 30% kreves for å utpeke et gen som uttrykkes differensielt. Resulterende data ble importert til Oppfinnsomhet Pathway analyse (IPA) programvare (Oppfinnsomhet Systems, Redwood City, CA, USA) for å identifisere over- eller underrepresentert veier så vel som potensielle biomarkører.
De data som er omtalt i denne publikasjonen har vært avsatt i NCBI Gene Expression Omnibus [15] og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE33814 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=nrmdhyayykcgavo acc=GSE33814).
Quantitative real-time PCR
Kvantitativ analyse av genuttrykk ble utført med 87 humane lever vevsprøver (Biobank prøver: 10 steatohepatitis, 8/2 cirrhose /ikke-cirrhose, 30 steatose og 18 kontroller, biopsiprøver: 11 steatohepatitis, 5/6 cirrhose /ikke-cirrhose, 13 steatose, 5 sykdom kontroller fra pasienter med kronisk hepatitt C) ved hjelp av real-time PCR (LightCycler®480 real-Time PCR System, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Vi søkte genet spesifikk primer og sonde TaqMan® genuttrykk analyser (Applied Biosystems, Weiterstadt, Tyskland) og utført relativ kvantifisering av alle gener.
HPRT1
ble brukt som en vaktmester genet for å normalisere dataene. Den Cp verdien ble hentet fra Lightcycler®480 programvare 1.5.0 og uttrykket nivået ble beregnet med to
-ΔCp metoden [16], [17].
Immunohistochemistry
for immunhistokjemisk analyse 3 mikrometer tykke parafinsnitt av levervev av kronisk hepatitt C, NAFLD forbundet steatose (NAFL) og steatohepatitis ble avvokset og rehydrert følgende standard prosedyrer. For antigen gjenfinning ble seksjonene varmes i mikrobølgeovn i Target Retrieval løsning, pH 9,0 (Dako REAL ™ S2367; Dako, Glostrup, Danmark) i 40 minutter ved 160 W etterfulgt av avkjøling i 20 min ved RT. Snittene ble deretter vasket i vann og PBS. Blokkering ble gjennomført med Dako REAL ™ blokkering løsning i 10 min før inkubasjon med antistoffer mot aldosereduktase AKR1B10 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) fortynnet 1:500 i Dako REAL ™ antistoffdiluent i 60 min ved RT. Binding av antistoffene ble påvist med Dako REAL ™ EnVision ™ Detection System Peroxidase /DAB
+, Kanin /mus fører til en rødbrun reaksjonsprodukt.
AKR1B10 protein uttrykk oppdaget i cytoplasma av hepatocytter ble bedømt semikvantitativt som beskrevet nedenfor. Intensiteten av farging ble klassifisert som mild til moderat (poengsum A) eller markert (poengsum B), og mengden av positive hepatocytter ble estimert ved bruk av numeriske score som ble definert som:
Score A eller B 0 : – AKR1B10 farging i hepatocytter ikke oppdaget
Score A eller B 1: – AKR1B10 positive hepatocytter utgjør mindre enn 10% av leveren parenchyma
ScoreA eller B 2: – AKR1B10 positive hepatocytter utgjør mellom 10 -30% av leveren parenchyma
Score A eller B 3: – AKR1B10 positive hepatocytter utgjør mer enn 30% av leveren parenchyma
AKR1B10 Poengsummen ble deretter avledet fra summen av scorene A og B og representerer et estimat av mengden og intensiteten av immunohistochemically påviselig AKR1B10 protein uttrykk i leveren parenchyma (tabell 5).
Resultater
genuttrykksmønstrene klart skiller steatohepatitis fra steatose og kontroller
for å screene for endringer i lever genekspresjon skille steatohepatitis fra steatose, leverprøver fra pasienter med både alkoholholdige og alkoholisk fettleversykdom oppnås ved kirurgi (Biobank) ble utsatt for Illumina genekspresjon perle chip-basert analyse. Totalt 32 Biobank prøvene ble undersøkt (tabell 1). For analyse av microarray data, ble ASH og NASH tilfeller gruppert sammen i en «steatohepatitis» gruppe. Viktigere, vi tar sikte på å undersøke de molekylære endringer mellom steatohepatitis og steatose, ikke mellom deres årsaker. Dette synes hensiktsmessig siden begge sykdommene , ASH samt NASH, er preget av en stor grad overlappende spekter av morfologiske endringer [18]. genuttrykk data ble deretter undersøkt av to dataanalyse prosedyrer, bestående av (i) identifisering av differensielt uttrykte gener ved hjelp limma og (ii) utvalg . av 1000 gener med høyest varians i hele datasettet i de parvise sammenligninger, identifiserte vi 4963 og 2543 gener som signifikant (FDR 0,05). uttrykt forskjellig mellom steatohepatitis og kontroller, og steatohepatitis og steatose, henholdsvis de to sammenligninger, delte 1931 differensielt uttrykte gener. forskjellene mellom genuttrykk profiler av de normale og steatose prøvene er små. Variansen i gruppene er høy og på grunn av det, er ikke tilstrekkelig til å identifisere vesentlig forskjellig uttrykt gener mellom de to gruppene kraften i den statistiske testen. Antallet av differensielt uttrykte gener tyder på at steatohepatitis, når sammenlignet med normale levervev, kjennetegnes ved mer dyptgripende molekylære endringer enn steatose.
Hierarkisk clustering ble anvendt for å visualisere de vanlige 1931 genene i et varmekart (figur 1A ). Med to unntak, steatose og kontrollprøver gruppert sammen mens steatohepatitis prøver samlet i en egen gren. Spesielt gjorde kombinasjonen av NASH og ASH ikke påvirke hierarkisk clustering. Den vanlige gener ble delt i to grener, nedregulert gener i steatohepatitis forhold til steatose og kontroller (figur 1A, klynge 1) eller oppregulert i steatohepatitis forhold til steatose og kontroller (figur 1A, klynge 2).
A. Vanlige differensielt uttrykte gener ble brukt for tilsyn clustering. B. Unsupervised clustering ble utført med de 1000 mest variable gener i de tre gruppene av leverprøver (steatohepatitis, rød, steatose oransje, kontroller, grønn).
De 1000 gener med høyest varians var brukes for en ukontrollert gruppering og en visualisering av resultatene i et varmekart (figur 1B). Igjen, med ett unntak, steatohepatitis prøver samlet i en gren atskilt fra steatose prøver og kontroller. Den svært variante gener falt i to klasser, karakterisert ved opp- og nedregulering in steatohepatitis i forhold til de øvrige prøvene. Tatt sammen, begge typer analyser ga differensiell genekspresjon signaturer, som tydelig adskilt fra steatohepatitis steatose og kontrollprøver.
Gene ontology [19]-analyse ble utført i klynge 1 og klynge 2 (tabell 6 og 7, respektivt ) for å identifisere sykdoms relevant biologiske prosesser fra forskjellig uttrykt gener. Spesielt, cluster 1 (oppregulert i kontroller og steatose) var preget av metabolismen bare (oksidasjon reduksjon, metabolske prosesser, og biosyntese). I motsetning til flere GO klasser i klynge 2 (oppregulert i steatohepatitis) tilhørte molekylære prosesser, som er karakteristisk for ondartede sykdommer og tumorprogresjon (celle adhesjon, ekstracellulære matrise, celle bevegelse, intesignal). Dette funnet tyder på at steatohepatitis er ledsaget av helt andre genuttrykk programmer sammenlignet med steatose og kontroller. Spesielt programmene oppregulert i steatohepatitis er karakteristisk for maligne sykdommer.
QRT-PCR validering av microarray data
I alt 87 prøver humane lever ble brukt for PCR basert validering av matrisedata (tabell 8 og 9). Å optimalt velge kandidat gener for validering, ble tre strategier ansatt. Først ble 265 vanlige gener mellom 1931 differensielt uttrykte gener og 1000 gener med den høyeste variasjon identifisert. Denne gruppen av felles gener ble analysert av web-basert programvare IPA® (Ingenuity® systemer). IPA-Biomarker® ble brukt til å identifisere relevante biomarkører kandidater som kan være nyttig å skille mellom steatohepatitis og steatose. Totalt 126 genene ble detektert etter filtrering. Fra denne gruppen ble 13 gener valgt for ytterligere validering, på grunn av deres betydelige ganger endring i microarray analyse. For det andre, GO vilkår fra de to definerte klynger ble systematisk analysert for potensielle mål og tre genene ble valgt. Tredje, ble 17 differensielt uttrykte gener identifisert av en betydelig p-verdi og brett endring fra microarray data. Dessuten ble fem gener anvendt som positive kontroller og i tillegg, åtte gener ble valgt på grunn av kjente funksjon på proteinnivå i steatohepatitis (tabell 8). Innenfor utvelgelsen av aktuelle kandidater, vi hovedsakelig fokusert på gener knyttet til metabolisme, oksidativt stress, betennelser, og deres relevans i fatty leversykdom. Oppsummert ble 46 gener valgt for ytterligere validering av QRT-PCR.
HPRT1
ble brukt som en husholdningsgenet. Figur 2 oppsummerer de brette forandringer i ekspresjon av utvalgte gener. Satsene for verifisering av differensial genuttrykk var høye: Endringene – som bestemmes av QRT-PCR – av differensial uttrykk for 39 gener i Biobank steatohepatitis prøvene var betydelig. Bare tre gener ble ikke signifikant deregulert. I biopsier, 30 gener var betydelig, og tolv gener ble ikke signifikant deregulert. Årsakene til den nedre verifisering hastighet i biopsier kan være at de fleste av de analyserte prøvene Biobank allerede hadde blitt brukt for hele genomet microarray eksperiment (ingen selvstendig prøve kohort). Fire gener (
DCDC2
,
EEF1A2
,
GSTM1 Hotell og
STMN2
) kunne ikke måles pålitelig i noen av prøvene.
uttrykket av utvalgte mål gener ble bestemt i kirurgisk innsamlede prøvene (A) og i leverprøver tatt ved biopsi (B). Flippen endringen ble beregnet ved å sammenligne de tre grupper av leverprøver mot hverandre.
Genene
ACSL4
,
ATF3
,
CAT
,
GSTM5 Hotell og
NR0B2
ble tidligere beskrevet i fatty leversykdom [20], [21] og tjente som positive kontroller for kvantitativ validering av kandidatgener i den foreliggende undersøkelsen. Den betydelige oppregulering av disse positive kontrollgener ble validert i enten en eller begge av de analyserte kohorter (tabell 8 og 9).
Den store funn støtter tanken om en slående endring av molekylære programmer i steatohepatitis når sammenlignet med steatose og kontrollprøver. De mest påfallende deregulert gener i så måte var
AKR1B10 Hotell og
KRT23 plakater (figur 3) siden våre data viste en svært signifikant overekspresjon av både gener i steatohepatitis.
HPRT1
ble valgt til å normalisere genuttrykk i de analyserte prøvene. Mean normaliserte uttrykk nivåer er gitt i log2.
Immunhistokjemisk analyse av AKR1B10 uttrykk i steatose, steatohepatitis og kronisk hepatitt C
Svak til moderat eller markert cytoplasma og noen ganger atom reaktivitet med antistoffer mot AKR1B10 ble påvist i hepatocytter til nesten alle de lever vevsprøver fra pasienter med steatose og steatohepatitis av begge, alkoholholdige og ikke-alkoholholdige etiologi, så vel som kronisk hepatitt C-kontroller (figur 4 A-F, tabell 5). AKR1B10 uttrykk i tilfeller med steatohepatitis som vurderes av immunhistokjemiske AKR1B10 stillingen var betydelig høyere sammenlignet med AKR1B10 uttrykk i steatose og kronisk hepatitt C tilfellene (p = 0,003 og 0,006, henholdsvis). Imidlertid AKR1B10 ekspresjon i levervev med steatose og kronisk hepatitt C var ikke forskjellig (p = 0,351) (tabell 5). AKR1B10 uttrykk ble også påvist i epitel av noen av de store eller mellomstore galleganger (data ikke vist).
Bare representative områder vises. (A) ved kronisk hepatitt C med en betent portal kanalen med lymfatisk infiltrerer og mild inter hepatitt (sentral vene merket med stjerne, H E farget avsnitt). (B) Fortløpende delen av området som er vist i (A). Bare en gruppe av noen sentrilobulær hepatocytter vise cytoplasma og kjernekraft AKR1B10 farging (sentral vene merket med stjerne). (C) Tilfelle av fettlever med merket makro- og mediovacuolar steatose hovedsakelig av sentrilobulær og mid-sone hepatocytter (sentral vene merket med stjerne, H E farget avsnitt). (D) Fortløpende delen av området som er vist i (C) av hepatocytter med fett endring showet farging av felgen av cytoplasma ikke okkupert av fett med AKR1B10 antistoffer (sentral vene merket med stjerne). (E) Case of steatohepatitis i en levercirrhose med parenkymatøs nodule abuting en fiber septum med mild ductular reaksjon. Mange hepatocytter viser fet endring og noen av dem er preget av en forstørret, lett farget cytoplasma (ballong hepatocytter) og uregelmessige eosinofil cytoplasma slutninger (Mallory-Denk organer, MDBs, innfelt med høyere forstørrelse viser ballong hepatocytter inneholder MDBs H E farget seksjon ). (F) Fortløpende delen av området som er vist i (E). Mange av normal størrelse samt ballong hepatocytter viser moderat cytoplasma farging med AKR1B10 antistoffer mens de MDBs forbli unstained (innfelt med høyere forstørrelse viser ballong hepatocytter med MDB).
Diskusjoner
Denne studien avslører genekspresjonssignaturer dypt skille steatohepatitis fra steatose og normal leveren. Spesielt, normalt vev og steatose gruppert tettere sammen i forhold til steatohepatitis prøvene. Siden den hierarkiske clustering tydelig demonstrert vanlige uttrykk profiler for NASH og ASH prøvene, ble ikke lenger skille mellom de ulike årsaker. Videre begge etiologies manifest med en bredt overlappende spekter av histologiske viktige funksjoner (f.eks sentrilobulær basert funksjonene steatose, betennelse og leverballong samt pericellulær fibrose) [7], [18].
genuttrykk data tyder på at steatohepatitis viser molekylære profiler som er karakteristiske for prosesser som er relevante i maligne svulster og kan derfor gjenspeiler en premalign tilstand av leversykdom allerede på precirrhotic stadium (tabell 7.). Faktisk støtter økende bevis for at steatohepatitis kan utvikle seg til HCC allerede i precirrhotic scenen [22]. Fedme og diabetes er ikke bare etablert risikofaktorer for utvikling steatohepatitis og skrumplever, men har også vært innblandet i dannelsen av HCC. Andre viktige risikofaktorer for HCC i steatohepatitis er avanserte alder og vev fibrose. Mekanismene bak utviklingen fra steatohepatitis til HCC er fortsatt uklart, og målene for behandling av steatohepatitis og HCC mangler. Men signalveier involvert i betennelse og insulinresistens fremme steatohepatitis, kan bidra til dets karsinogenitet.
genuttrykket av de 46 utvalgte gener ble validert ved QRT-PCR for begge de testede prøve kohorter. Selv om de analyserte prøvene ble samlet opp ved forskjellige metoder, og for biopsiprøver kronisk hepatitt C-prøver ble anvendt som kontroller (siden perkutan leverbiopsi ikke er utført i personer med normal lever) ble mange betydelig deregulerte gener som finnes i alle de tre testede grupper prøvene lever i både uavhengige prøve gruppene (tabell 1-3). Til tross for en forskjell i andelen cirrhosepasienter tilfeller mellom de to kohortene (80% i kirurgiske prøver, og 45% i biopsier),
AKR1B10
samt
KRT23
ble betydelig høyt uttrykt i både prøve kohorter. Dette indikerer felles patogenetiske mekanismer i både alkoholholdige og alkoholfrie steatohepatitis. Blant de forskjellig uttrykte gener,
AKR1B10 Hotell og
KRT23
var de mest fremtredende seg. AKR1B10 hører til de aldose-reduktaser og ble først beskrevet i human HCC [23], [24]. Det er et monomert enzym som reduserer aldehyder og ketoner til de tilsvarende alkoholer. Proteinet er uttrykt i livmorhalskreft og ikke-småcellet lungekreft, hvor det er ansett som en potensiell diagnostisk biomarkør [25], [26], [27]. Flere funn støtter også hypotesen om at
AKR1B10
kan være en nyttig markør for differensiering og proliferasjon av lever, tykktarm, lunge og bryst kreft [28], [29], [30]. I tillegg spiller AKR1B10 protein en rolle i avgiftning av giftige aldehyder. Frie radikaler som genereres av reaktive oksygenforbindelser oksyderes fettsyrer av lipidmembranen som resulterer i dannelse av reaktive aldehyder, som hurtig reduseres av AKR1B10 for derved å beskytte cellene mot forgiftning [31], [32]. Lipotoxicity av fettsyrer og fett mellomledd metabolitter kan være en viktig begivenhet i utviklingen av fettlever sykdom ved å indusere lever død. I denne studien rapporterer vi den betydelige overekspresjon av
AKR1B10
i steatohepatitis som kan være forårsaket av økt behov for å inaktivere giftige komponenter i hepatocytter. Dette tyder på at
AKR1B10
kan være en molekylær markør som følger utviklingen av steatohepatitis til HCC.
gener involvert i lipid partisjonering ved å holde potensielt lipotoxic fettsyrer som er lagret i nøytrale triglyserider (TG) kan motvirke /beskytte mot lipotoxicity som en potensielt viktig faktor i utviklingen av NAFLD til steatohepatitis [33]. Spesielt noen av genene som ble funnet skal dereguleres inkludert enzymer involvert i FA homeostase som DGAT2 (ansvarlig for FA esterification til TGS) og PNPLA3 (adiponutrin), nylig identifisert som en viktig faktor for patogenesen og progresjon av alkoholholdige og ikke- alkoholisk fettleversykdom [34], [35].
Videre beskriver vi stor betydning overekspresjon av
KRT23
i steatohepatitis sammenlignet med steatose og normal leveren.
KRT23
er påvist i ulike krefttyper. I mikro stabil tykktarmskreft,
KRT23
uttrykket er sterkt økt, og dette kan ha en beskyttende funksjon motvirke spredning og overlevelse av celler [36]. En annen studie identifisert KRT23 som HCC-assosiert antigen i pasientsera [37].
KRT23
har ennå ikke blitt beskrevet å være uttrykt i lever eller leversykdom. Rollen til KRT23 under fysiologiske betingelser og i steatohepatitis er ukjent. Imidlertid mutasjoner av andre medlemmer av keratin multigen familie, nemlig keratiner 8 og 18, ble funnet å være assosiert med kronisk human leversykdom.
