Abstract
Bakgrunn
keratinocyte vekstfaktor reseptor (KGFR) er et spleisevariant av FGFR2 genet uttrykt i epitelceller. Aktivering av KGFR er en viktig faktor i reguleringen av fysiologiske prosesser i epitel-celler slik som proliferasjon, differensiering og sårheling. Endringer i KGFR signalering har vært knyttet til patogenesen av forskjellige epiteliale tumorer. Det har også vært en hypotese om at den spesifikke ligand, KGF, kan bidra til utvikling av resistens mot 5-fluorouracil (5-FU) i epiteliale kreftformer og tamoxifen i østrogen-positiv brystkreft.
Metodikk /hovedfunnene
Lie interfererende RNA ble transfektert inn i en human keratinocytt cellelinje (HaCaT), en brystcancer avledet cellelinje (MCF-7) og en keratinocytt primær kultur (KCs) for å indusere selektiv nedregulering av ekspresjon KGFR. En sterk og meget spesifikk reduksjon av KGFR ekspresjon ble observert ved både RNA (reduksjon = 75,7%,
P
= 0,009) og proteinnivå. KGFR stilnet celler viste en redusert respons til KGF behandling som bestemt ved å måle proliferasjon frekvens (14,2% mot 39,0% av kontrollcellene,
P
0,001), og cellevandring (24,6% mot 96,4% av kontrollen celler,
P
= 0,009). I mock-transfekterte MCF-7-celler, motvirker KGF kapasiteten av 5-FU til å hemme celleproliferasjon, mens i KGFR stilnet celler KGF svakt interfererer med 5-FU antiproliferativ virkning (11,2% mot 28,4% av kontrollcellene,
P
= 0,002). Kapasiteten av 5-FU til å indusere celledød oppheves ved samtidig behandling med KGF, mens i KGFR stilnet celler 5-FU induserer effektivt celledød, selv kombinert til KGF, som bestemt ved å evaluere cellelevedyktighet. På samme måte, til kapasiteten av tamoksifen inhibere MCF-7 og KCs spredning er sterkt redusert ved behandling KGF og er fullstendig gjenopprettet i KGFR stilnet-celler (12,3% mot 45,5% av kontrollcellene,
P
0,001) .
Konklusjon /Betydning
Disse funnene tyder på at selektiv hemming av KGF /KGFR sti kan gi et nyttig verktøy for å lindre effekten av terapeutiske strategier for visse epiteltumorer.
Citation: Rotolo S, Ceccarelli S, Romano F, Frati L, Marchese C, Angeloni A (2008) stanse av keratinocyte vekstfaktor reseptor Gjenoppretter 5-Fluorouracil og Tamoxifen Effekt på Responsive kreftceller. PLoS ONE 3 (6): e2528. doi: 10,1371 /journal.pone.0002528
Redaktør: Stefan Maas, Lehigh University, USA
mottatt: May 14, 2008; Godkjent: 27 mai 2008; Publisert: 25 juni 2008
Copyright: © 2008 Rotolo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra MIUR, Cofin 2005, og fra Regione Lazio stipend utstedt for Progetto di ricerca Finalizzata 2005. Oppdragsgivers var ikke direkte eller indirekte involvert i å utforme eller gjennomføre studien i noen del.
Konkurrerende interesser : forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
keratinocyte vekstfaktor reseptor (KGFR /FGFR2-IIIb) er en tyrosin kinase protein som tilhører familien av fibroblast vekstfaktor. reseptorer (FGFRs). KGFR representerer en spleising transkripsjon variant av FGFR2-genet og blir uttrykt på epitelceller i forskjellige organer. Den alternativt spleiset isoform, kjent som FGFR2-IIIc, er funnet i celler fra mesenkymale linjer [1], [2]. KGFR spiller en viktig rolle i kontrollen av epitelial vekst og differensiering, utfører sine biologiske virkninger på en parakrin måte [3] ved høy affinitetsbinding til sine spesifikke ligander, nemlig keratinocytt vekstfaktor (KGF /FGF7), FGF10 og FGF22 [4 ]. Blant dem, virker KGF ikke bare som et potent mitogen for primære humane keratinocytter, men også fremme deres differensiering program [5] og beskytte dem mot apoptose-induksjon [6], [7]. Videre er KGF involvert i både eksperimentelle [8], [9] og
in vivo product: [10] sårheling modeller, stimulerer migrering av keratinocytter [11], [12] og indusering av reorganisering av aktin cytoskjelettet, derfor økende epitelial cellemotilitet [13].
i det siste har det vært økende interesse om den potensielle rolle forandringer av KGF /KGFR signalanlegg i epitel tumorigenesis. Økt KGFR mRNA-ekspresjon er blitt detektert i et vidt spekter av tumorer av epitelisk opprinnelse, slik som lunge, tarm, mage, bukspyttkjertel og prostata cancer. I noen tilfeller, synes en slik økt ekspresjon for å være assosiert med celletransformasjon og, kanskje, ondartet progresjon [14]. Videre har KGF administrering vist seg å øke celle motilitet i østrogenreseptor (ER) -positive brysttumorceller [15], [16], for å være potensielt er involvert i brystkreft progresjon og metastase [17], og for å forbedre den invasive potensialet gastrisk karsinom avledede cellelinjer som overuttrykker KGFR [18].
Andre undersøkelser førte til hypoteser om at KGF kan utøve antiapoptotic aktivitet på enkelte kreftceller, så vel som inhibering av apoptose indusert av det kjemoterapeutiske legemiddel 5-fluorouracil (5-FU ) [19] – [22]. Utviklingen av kreftceller av resistens overfor tradisjonelle kjemoterapeutiske midler, så som 5-FU, blir ofte observert og er fortsatt en stor hindring for en vellykket behandling av kreft og en fremtredende årsak til tumor tilbakefall etter kjemoterapi [23].
Videre er det blitt foreslått at endringer av de veier som involverer FGF’er og beslektede reseptorer kan representere en av mekanismene for motstand mot tamoksifen som til slutt utvikles i mange eR-positiv brystkreft [24] – [27]. Imidlertid er denne hypotese ikke er helt fastslått og den spesifikke rolle spilt av den store familien av FGF er langt fra å bli forstått.
tilnærming basert på selektiv nedregulering av proteiner involvert i cellulære prosesser korrelert til tumorprogresjon representerer en lovende grense for kreftbehandling. Transfeksjon av spesifikke små interfererende RNA (sirnas) er et kraftig verktøy for å oppnå en gen-spesifikk knockdown og representerer en potent terapeutisk strategi for behandling av flere sykdommer, slik som virusinfeksjoner, nevrologiske lidelser og cancere [28].
Den eksklusive target spesifisitet av siRNA mot sykdoms relevant mRNA er en viktig forutsetning for utnyttelse av denne teknologien. I denne studien vi selektivt downregulated KGFR mRNA og protein ekspresjon i tre epitel-cellelinjer, HaCaT keratinocytter, MCF-7 brystkreftceller og primære dyrkede keratinocytter (KCS), etter en ny tilnærming for å siRNA konstruksjon, basert på utnyttelse av dicer endonuklease substrat 27-mer dsRNAs å utløse RNA interferens (RNAi). Denne teknikken gir forbedret effektivitet og lengre varighet av RNAi sammenlignet med tradisjonelle 21-mer sirnas, slik at bruken av lavere konsentrasjoner av RNAi i målceller, noe som reduserer bivirkningene. Videre gir det målretting av nettsteder som er motstandsdyktig overfor undertrykkelse med 21-mer sirnas [29].
Vi har analysert virkningene av KGFR siRNA på egenskaper bio-parametre som celle levedyktighet, spredning, apoptose og migrasjon av de testede cellelinjer. Til slutt, vurderte vi om nedregulering av KGFR uttrykk er i stand til å hemme 5-FU og tamoxifen motstand indusert av KGF i cellekulturer.
Resultater
Hemming av KGFR mRNA uttrykk av sirnas
Det er ingen klare regler for siRNA målområde utvalg for spesifikke mRNA sekvenser. Men innenfor en enkelt mRNA sekvens forskjellige siRNA-molekyler viser en dramatisk variasjon når det gjelder effekt og spesifisitet av genet demping. Her brukte vi laboratorie- og webbaserte programmer, i henhold til de tidligere beskrevne kriterier (https://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html), for å velge tre sirnas sekvenser rettet mot FGFR2 genet. Det er kjent at det samme genet koder for to alternative transkripter, betegnet som KGFR /FGFR2-Illb og FGFR2-Ille, som er forskjellige for en avvikende strekning av 49 aminosyrer i deres ekstracellulære domene, og viser forskjellige ligand-bindende karakteristika. Således, for å realisere en bestemt knockdown av KGFR transkriptet, valgte vi sirnas sekvenser målrettet i ekson 8 av FGFR2-genet, som er skjøtet bare i KGFR isoformen (Fig. 1A). Alle sirnas sekvensene ble inngått en BLAST søk for å sikre at det ikke var signifikant homologi med andre gener. Som om den relative ekspresjon av de to FGFR2 isoformer i våre eksperimentelle modeller, har HaCaT-celler er tidligere blitt vist å uttrykke FGFR2-IIIc variant av FGFR2 i to størrelsesordener mindre mengde enn den FGFR2-IIIb spleisevariant [30]; i MCF-7-celler, tidligere vist å uttrykke begge isoformer [31], demonstrerte vi at FGFR2-IIIb uttrykk er betydelig høyere enn den for FGFR2-IIIc (11 gangers økning) (Fig. 1B). Evnen til hver utformet siRNA og av en samlesett av de tre dupleksene for spesifikt å redusere nivåene av KGFR mRNA, uten å påvirke ekspresjonen av FGFR2-IIIc isoform, ble analysert i MCF-7 og HaCaT-celler. Transiente transfeksjoner ble brukt til å levere hver siRNA og celler inkubert med liposomal vektor alene (etterligning transfeksjon) ble anvendt som kontroll. Den optimale konsentrasjonen for siRNA transfeksjon var eksperimentelt bestemt til å være 5 nM (data ikke vist), i tråd med nyere observasjoner som indikerte giftige mekanismer, off-target effekter og stimulering av immunrespons indusert av høye doser av syntetisk RNAi
in vitro Hotell og
in vivo product: [32]. Evnen til de forskjellige siRNAs for å redusere mengden av KGFR mRNA ble bestemt ved Q-RT-PCR. I MCF-7 celler vurderte vi også spesifisiteten av de utformede siRNAs. KGFR og FGFR2-IIIc mRNA-nivåer ble normalisert til p-aktin mRNA-nivåer. 48 timer etter transfeksjon, MCF-7-celler transfektert med det samlede sett av siRNA-1, -2 og -3 uttrykte en statistisk signifikant redusert mengde av KGFR mRNA sammenlignet med mock-transfekterte celler (0,243 fold, reduksjon = 75,7%,
P
= 0,009) (fig. 2A). En mindre tydelig effekt ble oppnådd ved transfeksjon med de enkelte tomannsboliger: siRNA-1 (0,613 fold, reduksjon = 38,7%,
P
= 0,168), siRNA-2 (0,405 fold, reduksjon = 59,5%,
P
= 0,068) og siRNA-3 (0,406 fold, reduksjon = 59,4%,
P
= 0,061) (fig. 2A). Omvendt, verken individuelle siRNAs eller siRNA-bassenget viste noen hemmende effekt på FGFR2-IIIc mRNA nivåer (siRNA-1: 0,902 fold, reduksjon = 9,8%,
P
= 0,71; siRNA-3: 0,914 fold, reduksjon = 8,6%,
P
= 0,36; si-RNA-3: 0,943 fold, reduksjon = 5,7%,
P
= 0,52; siRNA-pool: 1.028 ganger, forskjell = 2,8%
P
= 0,85) (fig. 2B).
(A) Skjematisk tegning som representerer alternativ spleising av FGFR2-IIIc og KGFR /FGFR2-IIIb. Det innfelte (*) rapporterer cDNA-sekvensen (nukleotidene fra 1590 til 1698) som korresponderer til det hele exon 8, med sekvensene rettet av de tre sirnas (grå bokser). (B) Nivåene av KGFR og FGFR2-IIIc mRNA-ekspresjon ble bestemt ved Q-RT-PCR, og normalisert til p-aktin mRNA-nivåer. KGFR mRNA i MCF-7-celler ble bestemt som fold med hensyn til FGFR2-IIIc mRNA. Grafen viser interkvartile spekter av tre uavhengige forsøk (bokser), deres gjennomsnitts (horisontale stiplede søyler) og 95% konfidensintervall (CI) (værhår). Tosidig Student
t
test ble brukt for å sammenligne KGFR versus FGFR2-IIIc uttrykk: *
P
0,001. De vedlagte tabellrapporter bety uttrykk nivå, Standard Error (SE), og 95% KI for hver analyserte prøve.
(A, B) MCF-7 celler ble mock transfektert eller transfektert med 5 nM siRNA -1, -2, -3, eller med et samlet sett av dem, og total RNA ble ekstrahert 48 timer etter transfeksjon. Nivåene av KGFR (A) og FGFR2-IIIc (B) mRNA-ekspresjon ble bestemt ved Q-RT-PCR, og normalisert til p-aktin mRNA-nivåer. KGFR (A) eller FGFR2-Ille (B) mRNA i siRNA-transfekterte celler ble bestemt som folden i forhold til den uttrykt i mock-transfekterte celler. For hver behandling, grafene viser interkvartile spekter av tre uavhengige forsøk (bokser), deres gjennomsnitts (horisontale stiplede søyler) og 95% konfidensintervall (CI) (værhår). Tosidig Student
t
test ble brukt for å sammenligne siKGFR-transfektert versus mock-transfekterte celler: *
P
= 0,009. De etterfølgende tabellene inneholder bety uttrykk nivå, Standard Error (SE), og 95% KI for hver analyserte prøve.
Derfor ble alle etterfølgende eksperimenter utført ved trans siRNA-bassenget, som matcher de vanligste vedtatte kriterier av siRNA effektivitet ( 70% reduksjon i mål mRNA). Videre, siden bassenget viser en høy spesifisitet for KGFR isoform, det vil bli omtalt som siKGFR i resten av manuskriptet.
Tid løpet av siRNA-mediert KGFR stanse
For å vurdere varigheten og effekt av KGFR stanse, utførte vi tidsforløpseksperimenter på HaCaT-celler transfektert med siKGFR, å bestemme mengden av KGFR mRNA ved Q-RT-PCR ved 6, 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon (fig. 3A). En reduksjon av KGFR mRNA-ekspresjon ble observert 24 timer etter transfeksjon, sammenlignet med mock-transfekterte celler (1,127 versus 2,730 fold, forskjell = 58,7%,
P
0,001), mens fulle effekt ble oppnådd ved 48 og 72 h (1,127 versus 4,779 fold, forskjellen = 76,4%,
P
0,001 og 1,079 versus 4,463 fold, forskjellen = 75,8%,
P
henholdsvis 0,001,) fra transfeksjon . 96 timer etter transfeksjon, ble en sterk nedgang i KGFR ekspresjon observeres også i kontrollgruppen. Men i transfekterte celler, nedregulering av KGFR uttrykk var fortsatt signifikant (1,215 versus 1,963 fold, forskjellen = 38,1%,
P
= 0,017). På baser av tidsforløpet resultater og i henhold til tidligere rapporter som viser at toppen av KGFR protein uttrykk nås på 72 timer etter sult [30] vi bestemte oss for å utføre alle de påfølgende forsøkene på 72 timer etter siKGFR transfeksjon.
(A) HaCaT-celler ble transfektert uekte eller transfektert med 5 nM siKGFR, og total RNA ble ekstrahert fra de transfekterte cellene 6, 24, 48, 72 og 96 timer senere. Nivåene av KGFR mRNA uttrykk ble bestemt av Q-RT-PCR, og normalisert til p-aktin mRNA nivåer. Mengden av KGFR mRNA ved hvert tidspunkt ble uttrykt som ganger fra KGFR mRNA-nivå i forhold til 6 timer tidspunkt. For hvert tidspunkt, grafen viser interkvartile spekter av tre uavhengige forsøk (bokser), deres gjennomsnitts (horisontale stiplede søyler) og 95% konfidensintervall (værhår). De vedlagte tabellrapporter bety uttrykk nivå, Standard Error (S.E.), og 95% KI for hver analyserte prøve. Tosidig Student
t
test ble brukt for å sammenligne siKGFR-transfektert versus mock-transfekterte celler: *
P
0,001 (24 h); **
P
0,001 (48 h); †
P
0,001 (72 h); ‡
P
= 0,017 (96 h). (B) HaCaT celler var mock transfektert eller transfektert med 5 nM siKGFR. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 20 ng /ml KGF i 48 timer. Nivåene av KGFR mRNA uttrykk ble bestemt av Q-RT-PCR, og normalisert til p-aktin mRNA nivåer. Mengden av KGFR mRNA ble uttrykt som ganger fra KGFR mRNA-nivåer i forhold til ubehandlede mock-transfekterte celler. Graf og tabell rapport de samme datasett som i (A) for hver analyserte prøve.
P
verdier ble bestemt ved hjelp av tosidige Student
t
test: *
P
= 0,003 versus ubehandlet mock-transfekterte celler; **
P
= 0,018 versus KGF-behandlede mock-transfekterte celler. (C) HaCaT-celler ble transfektert og behandlet som i (B), og nivåene av KGFR proteinekspresjon ble bestemt ved Western blot analyse ved anvendelse av et polyklonalt anti-bek-antistoff. Det samme blot ble undersøkt for tubulin som kontroll for lik belastning. Mengden av KGFR protein ble vurdert ved densitometrisk analyse; verdiene fra en representant eksperiment ble standardisert til tubulin nivåer, uttrykt som fold av KGFR protein i forhold til ubehandlede mock-transfekterte celler og rapportert som en graf.
nedregulering av KGFR mRNA og protein uttrykk av siRNA i KGF-behandlede HaCaT-celler
det er kjent at behandling av epitelceller med KGF induserer flere hendelser, for eksempel celledeling og differensiering gjennom binding til KGFR og internalisering av reseptoren koblet til reduksjon av nivået av mRNA-ekspresjon KGFR . Således undersøkte vi effekten av siKGFR transfeksjon i cellekulturer i nærvær av 20 ng /ml KGF. mRNA og protein ekspresjonsnivåene ble testet ved Q-RT-PCR og Western blot-analyse. En kraftig reduksjon av KGFR mRNA ble observert i celler transfektert med siKGFR sammenlignet med mock-transfekterte celler (0,232 gangers reduksjon = 76,8%,
P
= 0,003) (Fig. 3B). I nærvær av KGF, observerte vi en downmodulation i uttrykket av KGFR også i mock-transfekterte celler. Imidlertid KGFR mRNA hemming av siRNA var fremdeles synlig (0,265 versus 0,598 fold, reduksjon = 55,7%,
P
= 0,018) (Fig. 3B). I det samme sett av eksperimenter, ble nivåene av KGFR proteinekspresjon også analysert ved Western blot. Som vist på fig. 3C, KGFR ekspresjon ble betydelig redusert i siKGFR-transfekterte celler sammenlignet med mock-transfekterte celler. Densitometrisk analyse bekreftet at siKGFR redusert protein ekspresjon i både ubehandlet og KGF-behandlede celler, med mer enn 50% med hensyn til mock-transfekterte celler (0,47 ganger sammenlignet med en fold, reduksjon = 53% og 0,20 versus 0,73 fold, reduksjon = 72.6 %, henholdsvis) (Graf fig. 3C).
siRNA-mediert nedregulering av KGFR hemmer celledeling og cellemigrasjon indusert av KGF
for å evaluere de biologiske effektene av KGFR stanse, vi undersøkte siKGFR kapasitet til å påvirke KGF-indusert proliferasjon ved å utføre en proliferasjonsanalyse på HaCaT-cellelinjen. Belagt celler ble transfektert med siKGFR og dyrket i 48 timer i standard medium supplert eller ikke med 20 ng /ml KGF. Celleformering ble bestemt ved å telle celler som var positive for Ki67-antigen, som identifiserer sykling celler, og rapportert i graf som prosent av positive celler (Fig. 4A). Som forventet, i mock-transfekterte celler ble det observert en økning av HaCaT-celler proliferasjon etter KGF behandling, sammenlignet med ubehandlede celler (39% mot 13,6%, 2,9 gangers økning,
P
0,001). Den nedregulering av KGFR uttrykk gjennom spesifikke siRNA avskaffet nesten helt KGF effekt på HaCaT celler spredning, med en spredning sats til bakgrunnsnivået (14,2% versus 39%, 2,7 ganger forskjell,
P
0,001) (Graf Fig . 4A).
(A) spredningsanalyse. HaCaT celler dyrket på dekkglass, ble mock transfektert eller transfektert med 5 nM siKGFR. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 20 ng /ml KGF i 48 timer. Deretter ble cellene fiksert og underkastet immunofluorescens-analyse med et polyklonalt antistoff rettet mot Ki67 (rød). Bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Scale bar, 10 mikrometer. Cellekjernene ble visualisert ved anvendelse av 4 «, 6-diamido-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI). Prosentandelen av Ki67-positive celler ble bestemt ved telling av antallet av Ki67-positive kjerner versus totale antall kjerner i ti forskjellige områder tilfeldig tatt fra tre forskjellige forsøk, uttrykt som middelverdi ± 95% CI og rapportert som en graf.
P
verdier ble bestemt ved bruk av Student
t
test: *
P
0,001 versus ubehandlet mock-transfekterte celler; **
P
0,001 versus KGF-behandlede mock-transfekterte celler. (B, C) sårhelende analysen. HaCaT (B) og MCF-7 (C) celler ble transfektert som i (A). 48 timer etter transfeksjon, ble et cellefritt område (sår) innført i konfluerende kulturer, som beskrevet i Materialer og Metoder. Cellene ble behandlet eller ikke med 50 ng /ml KGF og tillatt å migrere i 24 timer før fotografering i henhold til fasekontrastmikroskopi. Bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Skala barer, 10 mikrometer. Cellemigrering ble evaluert ved repopulation av det opprinnelige sår med celler: andelen av gjenvunnet område ble målt ved bildeanalyse, og verdiene i grafene er gjennomsnittet av tre plater for hver tilstand ± 95% CI.
P
verdier ble bestemt ved hjelp av Student
t
test: (B) *
P
0,001 versus ubehandlet mock-transfekterte celler; **
P
0,001 versus KGF-behandlede mock-transfekterte celler. (C) *
P
= 0,035 versus ubehandlet mock-transfekterte celler; **
P
= 0,009 versus KGF-behandlede mock-transfekterte celler.
Vi deretter analysert virkningen av KGFR stanse på celle migrasjon, en annen kompleks og strengt regulert cellulære prosessen sterkt indusert av KGF behandling. For å oppnå dette, utførte vi en sårhelende analysen. 48 timer etter transfeksjon med siKGFR et celle-fritt område ble innført i monolag av HaCaT-celler, som tidligere beskrevet [33]. Cellene ble behandlet eller ikke med 50 ng /ml KGF, konsentrasjonen rapportert å være mer effektiv i denne analyse [34], ble tillatt å migrere fra kanten av såret i 24 timer. Som vist på fig. 4B, såret-nedleggelsen var nesten ferdig 24 timer etter første såret i KGF-behandlede mock-transfekterte celler, mens ubehandlede mock-transfekterte celler viste en begrenset migrasjon med hensyn til T0 (96,4% versus 23,1%, 4,2 ganger økning,
P
= 0,035) (Graf fig. 4B). Transfeksjon med siKGFR signifikant hemmet cellemigrering indusert av KGF (Fig. 4B), og deretter reduseres den utvunnede området fra 96,4% av kontrollcellene til 24,6%, 3,9 ganger forskjell,
P
= 0,009) (Fig graf . 4B).
Den samme sårhelende analyse ble også utført på MCF-7 brystkreftceller, er kjent for å være responsive til KGF i form av motilitet [15], med lignende resultater (fig. 4C). KGF behandling fremmet en sterk repopulation, som sammenlignet med ubehandlede mock-transfekterte celler (83% versus 29,6%, 2,8 ganger økning,
P
0,001). I KGFR forstummet celler, ble KGF-indusert migrering nesten avskaffet, i forhold til å kontrollere celler (25,4% versus 83%, 3,3 ganger forskjell,
P
0,001). (. Graf fig 4C)
Disse resultatene antydet at KGFR stanse er effektiv til å inhibere KGF biologiske effekter, for eksempel stimulering av celleproliferasjon og migrasjon, enten i HaCaT keratinocytter eller brystkreft epitelceller.
KGFR stanse hemmer restaurering av celle spredning indusert av KGF på 5-FU stimulering
Ofte, kreftcellene utvikler resistens mot vanlige cellegifter, slik som 5-FU, og dermed utfordrende kjemoterapi effekt [23]. For å undersøke hvilken rolle KGFR i etableringen av resistens mot 5-FU, vi forbigående slått ned KGFR uttrykk av siRNA i MCF-7 brystkreft cellelinje.
transfeksjon med siKGFR ble utført i tilstedeværelse eller ikke av 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller en kombinasjon av dem. Først, vurderte vi effektiviteten av KGFR lyddemping ved å analysere både mRNA og protein ekspresjonsnivåene.
Som vist i fig. 5A, behandling med KGF av mock-transfekterte celler redusert ekspresjon av KGFR mRNA sammenlignet med ubehandlede celler, uavhengig av tilstedeværelsen av 5-FU i cellekulturer (0,555 gangers reduksjon = 44,5%,
P =
0,170 og 0,545 fold, reduksjon = 45,5%,
P
= 0,183, henholdsvis). Videre har 5-FU alene dårlig påvirkes KGFR mRNA ekspresjon (0,911 gangers reduksjon = 8,9%,
P
= 0,711). I siKGFR-transfekterte kulturer, ble det observert en sterk effekt på mRNA-ekspresjon (0,133 gangers reduksjon = 86,7%,
P
= 0,039), med små variasjoner som reaksjon på nærvær eller fravær av KGF og /eller 5 -FU. Disse data bekreftet at MCF-7-celler reagerer på samme måte som HaCaT-celler i respons til KGFR demping. Videre ble de oppnådde resultater på RNA-nivå bekreftes ved å analysere protein uttrykk, slik som vist i fig. 5B. Den spesifikke siRNA betydelig redusert KGFR protein i ubehandlede celler, så vel i KGF og /eller 5-FU-behandlede celler, med 60% -70% med hensyn til den samme behandling i mock-transfekterte celler (Diagram fig. 5B).
(A) MCF-7 celler ble mock transfektert eller transfektert med 5 nM siKGFR. 48 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller KGF pluss 5-FU i 24 timer. Nivåene av KGFR mRNA uttrykk ble bestemt av Q-RT-PCR, og normalisert til p-aktin mRNA nivåer. Mengden av KGFR mRNA i siKGFR-transfekterte celler ble uttrykt som ganger av nivået av KGFR mRNA i forhold til ubehandlede mock-transfekterte celler. For hver behandling, grafen viser interkvartile spekter av tre uavhengige forsøk (bokser), deres gjennomsnitts (horisontale stiplede søyler), og 95% KI (værhår). De vedlagte tabellrapporter bety uttrykk nivå, Standard Error (S.E.), og 95% KI for hver analyserte prøve.
P
verdier ble bestemt ved bruk av Student
t
test: *
P
= 0,039 versus ubehandlet mock-transfekterte celler. (B) MCF-7-celler ble transfektert og behandlet som i (A), og mengden av KGFR protein ble vurdert ved Western blot-analyse med et anti-bek polyklonalt antistoff. Tubulin fungerte som en lasting kontroll. Mengden av KGFR protein ble evaluert av densitometrisk analyse: verdiene fra et representativt eksperiment ble standardisert til tubulin nivåer, uttrykt som fold av KGFR nivå med hensyn til ubehandlede mock-transfekterte celler og rapportert som en graf
neste utførte en spredning analyse på MCF-7 celler, transfektert med siKGFR eller mock-transfektert og dyrket i 48 timer i standard medium supplert eller ikke med KGF, 5-FU eller en kombinasjon av dem, som ovenfor. Celleproliferasjon ble evaluert ved å telle cellene som var positive for Ki67-antigen, og rapportert i graf som prosent av positive celler (Fig. 6A). Også i MCF-7 har vi funnet en økning i celleformering etter KGF behandling, sammenlignet med ubehandlede celler (34,8% sammenlignet med 19,5%, 1,8 gangers økning,
P
= 0,004). Som forventet, behandling med 5-FU avslørte en antiproliferativ effekt (6,0% mot 19,5%, 3,3 ganger forskjell,
P
0,001), som ble nesten fullstendig opphevet ved samtidig behandling med KGF (28,4% vs. 6,0%, 4,7 ganger forskjell,
P
0,001). KGFR downregulation av siRNA avskaffet nesten KGF proliferativ effekt, både alene og i kombinasjon med 5-FU (15,7% versus 34,8%, 2,2 ganger forskjell,
P
0,001 og 11,2% versus 28,4%, 2,5 ganger forskjell
P
= 0,002, henholdsvis) (fig. 6A).
(A) MCF-7 celler, dyrket på dekk, ble mock transfekterte eller transfektert med 5 nM siKGFR og 48 timer senere de ble behandlet eller ikke med 20 ng /ml KGF, 25 ug /ml 5-FU eller KGF pluss 5-FU. Etter 24 timer ble cellene fiksert og underkastet immunofluorescens-analyse med et anti-Ki67 polyklonalt antistoff. Cellekjernene ble visualisert ved anvendelse av 4 «, 6-diamido-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI). Celleproliferasjon ble evaluert som i prosent av Ki67-positive kjerner versus totale antall kjerner i ti forskjellige områder tilfeldig tatt fra tre forskjellige forsøk, uttrykt som middelverdi ± 95% CI og rapportert som en graf.
P
verdier ble bestemt ved bruk av Student
t
test: *
P
= 0.004 og **
P
0,001 versus ubehandlet mock-transfektert celler; ***
P
0,001 versus 5-FU-behandlede mock-transfekterte celler; †
P
0,001 versus KGF-behandlede mock-transfekterte celler; ‡
P
= 0,002 versus KGF pluss 5-FU-behandlede mock-transfekterte celler. (B) MCF-7-celler ble transfektert og behandlet som i (A), og Western blot-analyse av fosforyleringen status av ERK ble utført ved anvendelse av en fosfo-spesifikt ERK-monoklonalt antistoff (p-ERK). Nivåer av total ERK ble vurdert ved blotting med en ERK2-spesifikt antistoff. Mengden av aktivert ERK ble evaluert ved densitometrisk analyse: verdier fra et representativt eksperiment ble standardisert til total ERK nivåer, uttrykt som fold p-ERK uttrykk med hensyn til ubehandlede mock-transfekterte celler og rapportert som en graf
Det er kjent at ERK /MAPK pathway spiller en stor rolle i celle spredning og overlevelse. Derfor, utførte vi en Western blot-analyse for å vurdere ERK-aktivering, ved anvendelse av antistoffer, enten spesifikke for den fosforylerte form av molekylet eller rettet mot total ERK. Som forventet, i mock-transfekterte celler ERK-aktivering ble betydelig indusert av KGF behandling (7,5 ganger). Omvendt, 5-FU var i stand til å redusere nivået av fosforylert ERK (2,5 ganger), som var nesten fullstendig restaurert ved administrering av KGF sammen med 5-FU (6,5 ganger). I siKGFR-transfekterte celler, i henhold til de ovenfor angitte resultater, den stimulerende virkningen av KGF på ERK-fosforylering ble sterkt inhibert (to ganger) (Fig. 6B).
Videre vurderte vi cellenes levedyktighet ved krystallfiolett farging, og dets etterfølgende absorbans ved 570 nm, noe som skyldes variasjoner i celleantall. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med KGF, 5-FU eller en kombinasjon av dem i 24 timer, som beskrevet ovenfor. Deretter ble de gjenværende cellene fiksert og beiset med 1% krystall fiolett (Fig. 7A). Vi sammenlignet effekten av KGF og 5-FU på celle nummer, ser på innflytelsen av KGFR stanse i denne prosessen. I mock-transfekterte celler KGF behandling var i stand til å øke celletall (1,55 ganger), 5-FU indusert en reduksjon av levedyktige celler (0,45 ganger), mens det i nærvær av KGF, 5-FU ikke var effektiv (1,49 ganger). På den annen side, i siKGFR-transfekterte celler, 5-FU-indusert celledød som forventet (0,56 ganger), mens behandling med KGF var ikke i stand til å indusere en økning i celletall (0,91 ganger). I dette tilfellet er 5-FU beholder sin evne til å bestemme celledød, selv i nærvær av KGF (0,49 ganger) (Diagram fig. 7A).
(A) MCF-7-celler ble transfektert uekte eller transfektert med 5 nM siKGFR og 48 timer senere ble de behandlet eller ikke med 20 ng /ml KGF, 25 mikrogram /ml 5-FU eller KGF pluss 5-FU. Etter 24 timer ble cellene fiksert, farget med 1% krystallfiolett og analysert ved en absorbans på 570 nm. Verdiene fra et representativt eksperiment ble uttrykt som relativ optisk tetthet og rapportert som en graf. (B) MCF-7-celler, dyrket på dekkglass, ble transfektert og behandlet som i (A). Etter 24 timer ble de faste og underkastet immunofluorescens-analyse med et antistoff rettet mot det spaltede form av caspase-3. Cellekjernene ble visualisert ved anvendelse av 4 «, 6-diamido-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI).
