Abstract
Den stimulerende NKG2D reseptor på lymfocytter fremmer svulst immunovervåkning ved å målrette ligander selektivt indusert på kreftceller . Utvikler svulster motvirke ved å bruke taktikk for å deaktivere lymfocytt NKG2D. Denne negative dynamisk eskaleres som noen menneskelige kreftceller co-opt uttrykk for NKG2D, og dermed utfyller tilstedeværelse av sine ligander for autonom stimulering av onkogen signalering. Kliniske foreningen data antyde sammenhenger mellom kreft celle NKG2D og metastatisk sykdom. Her viser vi at NKG2D fremmer kreft celle plastisitet ved induksjon av fenotypiske, molekylær og funksjonelle signaturer diagnostiske av epitel-mesenchymale overgang, og stilk-lignende egenskaper
via
induksjon av Sox9, en nøkkel transcriptional regulator av brystkreft stamcelle vedlikehold. Disse funnene oppnådd med modell brystsvulst linjer og xenotransplants ble rekapitulert av
ex
vivo
kreftceller fra primær invasive brystcarsinomer. Dermed kan NKG2D har kapasitet til å kjøre høye malignitet trekk underliggende metastatisk sykdom
Citation. Cai X, Dai Z, Reeves RS, Caballero-Benitez A, Duran KL, Delrow JJ et al. (2014) Autonomous Stimulering av Cancer Cell Plastisitet av Human NKG2D lymfocyttkontroll Receptor kouttrykte med sine ligander på kreftceller. PLoS ONE 9 (10): e108942. doi: 10,1371 /journal.pone.0108942
Redaktør: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Univ. Méditerranée, Frankrike
mottatt: May 16, 2014; Godkjent: 27 august 2014; Publisert: 07.10.2014
Copyright: © 2014 Cai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data (bortsett fra microarray data – se nedenfor) er i avisen og dens saksdokumenter filer. Microarray data er tilgjengelig på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under tilgangskode GSE53961
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend P50 CA083636 og National Institutes of Helse stipend R01 CA174470. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft celle plastisitet innebærer utvikling av egenskaper slik at kreftceller til å distansere seg fra primærtumor, spre, og utvide clonally på fjerne områder. Denne prosessen er regulert av epitel-mesenchymale overgang (EMT) og innbyrdes oppkjøpet av regenerativ kreft stamceller (CSC) attributter [1], [2]. Kjente førere av kreftcelle plastisitet inkluderer heterotypic signaler fra tumor-assosiert stromal og /eller immunsystemceller [1]. Vi har tidligere identifisert en ukonvensjonell homotypisk reseptor-ligand interaksjon på kreftceller [3], og viser her at resulterende signal induserer omprogrammering mot trekkende og stilk-lignende evner.
reseptoren er involvert, NKG2D (natural killer gruppe 2-medlem D ), er en aktiverende lymfocytt-reseptor hovedsakelig på NK-celler og CD8 T-celler og er best kjent for formidling av immun overvåkning av virusinfiserte og ondartede celler [4]. Menneske NKG2D signaler
via
DAP10 (DNAX aktiverende protein 10) adapter, som binder enten PI3K (phosphoinositide 3-kinase) eller GRB2 (vekstfaktor reseptor-bundet protein 2), og dermed aktivere PKB /AKT (protein kinase B) eller MAP (mitogen-aktivert protein) kinasekaskader [5]. Ligander for NKG2D i mennesker inkluderer MICA og MICB (MHC klasse I-relaterte kjedene A og B) og seks medlemmer av ULBP (UL-16 bindende protein) familie [6]. NKG2D ligander er stort sett fraværende fra overflaten av normale celler, men kan induseres ved onkogenese assosierte stressresponser hos kreftceller [7]. Dette selektiv ligand uttrykk gjør at NK-celler og CD8 T-celler til å målrette kreftceller, i hvert fall på tidlige kreft stadier før immunsuppressive taktikk som utvikler svulster kvele denne armen av immunrespons [4], [8].
I tillegg til å motvirke immunresponser, noen kreftceller co-opt NKG2D for sin egen fordel, sammenfallende med tilstedeværelse av sine ligander for selvstimulering av tumorigenesis [3]. Variable andeler av brystkreft, eggstokkreft, prostatakreft og tykktarmskreftceller uttrykker signaliserer dyktige NKG2D-DAP10 komplekser, som aktiverer PI3K-AKT-mTOR (mammalian target of rapamycin) signalaksen og nedstrøms effektorer. Videre, som i lymfocytter, NKG2D-DAP10 stimulerer fosforylering av ERK (ekstracellulært signal-regulert kinase) og JNK i MAP kinase kaskader [3]. Patofysiologisk betydning av NKG2D-DAP10 signalering støttes av en klinisk forening studie som etableres positive korrelasjoner mellom prosenter av kreftceller med overflate NKG2D og tumorstørrelse og spre [3]. Disse forholdene ble forlenget med signifikant sammenheng med lymfeknutemetastase, og ved trend korrelasjoner med klasse og lymphovascular invasjon, noe som tyder NKG2D-DAP10 virkninger i tumor celle spredning og metastasedannelse [3]. Denne studien tar for seg antall NKG2D-DAP10 å fremme kreftcelle plastisitet underliggende metastatisk sykdom.
Resultater
Induksjon av EMT omprogrammering av ligand stimulering av NKG2D
Epithelial tumorlinjer vanligvis uttrykker NKG2D ligander men er enten negativ for deres NKG2D-DAP10 reseptor eller, som med MCF-7, BT-20, og MDA-MB-453 brystkreft linjer, neppe positiv reflektert ved minimale forskyvninger av flowcytometri-profiler og aller lav NKG2D og DAP10 mRNA og protein uttrykk (Figur S1 A og S1B, også se Figur 2B og 2C i referansene 3 og 9, henholdsvis). Denne mangelen av reseptoren i tumorlinjer er i motsetning til relativ overflod, både av mRNA og protein uttrykk, på positive
ex
vivo
kreftceller (figur S1C-E; se også figur 1C -E i referanse 3). For å teste i en
i
vitro
modell om NKG2D induserer EMT, vi dermed undersøkt MCF-7 celler som ble stabilt transfektert med NKG2D-DAP10 (MCF-7-TF-celler) som resulterer i overflaten uttrykk på nivåer tilsvarende
ex
vivo
kreftceller (sammenligne figur S1C og Figur S1F). Ved fasekontrastmikroskop, MCF-7-TF celler vises morfologiske forandringer i forhold til mock-transfektert kontrollceller, som utstilt tett gruppert brosteinslignende former. MCF-7-TF-celler, i motsetning til dette viste fibroblast-lignende morfologi (figur 1A). Disse endringene skyldtes ektopisk uttrykk for NKG2D-DAP10 som foreldre fenotype ble restaurert av rekombinant lentivirus-mediert RNAi målretting av NKG2D i MCF-7-TF-KO celler (figur 1A, for flowcytometri profiler av disse modellseriene se Figur S1A og S1F). Disse observasjoner antydet at ligand-mediert stimulering av NKG2D resulterte i induksjon av EMT, som innebærer koordinerte molekylære og cellulære endringer som fører til tap av epitelial celle-celle-adhesjon, polaritet, og cytoskeletal integritet, samtidig med kjøpet av mesenchymale protein signaturer, spindelcelle former og invasive og trekk evner [10], [11]. Diagnostisk av EMT er redusert ekspresjon av cellekoplings forbundet E-cadherin, og induksjon av N-cadherin og cytoskeletal mellomliggende filament vimentin. Ved immunfluorescens mikroskopi, vises MCF-7-TF celler disse endringene i epiteliale og mesenkymale markørproteiner, som ble reversert av RNAi målretting av NKG2D (figur 1A). Tilsvarende resultater ble oppnådd ved immunblot og RT-PCR profilering (figur 1B). Utvidelse av data til flere markørproteiner og deres tilsvarende mRNA, herunder de epiteliale stramme synaptiske zona okkludens-1 (ZO-1) og occludin, cytokeratin 19 (CK19) og mucin 1 (MUC1), og fibroblastoid α-glattmuskel aktin (α -SMA), ga samsvar resultatene (figur 1A og 1 B) [12]. EMT er orkestrert av transkripsjonsfaktorer som inkluderer Snail1 /2, Twist1 /2, Zeb1 /2, og LSF-1 [1]. Induksjon av mRNA for alle disse faktorene unntatt Zeb1 ble registrert med MCF-7-TF, men ikke MCF-7-TF-KO-celler (figur 1B). Preinkubasjon av MCF-7-TF-celler med en cocktail av antistoffer mot relevante NKG2D ligander inhiberte alle registrerte protein og mRNA-forandringer, noe som bekrefter ligand involvering (figur 1 B) [3]. Vår tidligere studie etablert kravet om celle-celle-kontakt for ligand-mediert stimulering av NKG2D-DAP10 signalering i kreftceller [3]. Følgelig, sett med flowcytometri var andelen overflate E-cadherin
-. /N-cadherin
+ mesenchymale MCF-7-TF celler korrelert med cellekultur konfluens (figur 1C)
(A) fasekontrastmikroskop viser overgangen fra epithelial til fibroblastoid former av MCF-7-TF versus mock-transfektert kontroll, og fenotypiske hjemfall av MCF-7-TF-KO celler som uttrykker NKG2D RNAi. Ved immunfluorescens mikroskopi, MCF-7-TF celler viser redusert E-cadherin, ZO-1, occludin, og MUC1, og induserte N-cadherin og vimentin. (B) Tilsvarende immunoblot (øverst panel) og RT-PCR (midtre panelet) data inkludert ekstra CK19 og α-SMA markører. Tap av epitel og gevinst på mesenchymale markører dempes når MCF-7-TF cellene inkuberes med antistoff cocktail til NKG2D ligander. Nedre panel viser EMT-assosiert transkripsjonsfaktor RT-PCR profiler av MCF-7-TF og styreledninger og demping av tap og vinning hendelser ved antistoff maskering av NKG2D ligander. (C) Flowcytometri av MCF-7-avledet linjer vokst til lav eller høy samløpet for E-cadherin og N-cadherin. Tall i kvadranter indikerer celle proporsjoner i prosent. Legg merke til at denne oppdagelsen er mer følsom da fremgangsmåten anvendt i (A). (D) Eksemplarisk data som viser økt
i
vitro
migrasjon og invasjon av MCF-7-TF versus mock transfekterte negativ kontroll og MCF-7-TF-KO celler. Nærvær av anti-ligand-antistoff cocktail reverserer motilitet gevinster. Tallene indikerer celletall i tilfeldig utvalgte mikroskopiske felt. (E) Grafisk visning av motilitet data med barer som representerer gjennomsnitts celle tall (+/- SD) utledet fra tre uavhengige forsøk med hver fire mikroskopiske felt teller. Stjernene betegne
p
0,005. (F) Imaging av MCF-7-TF cellemigrasjon versus kontroll-linjer i sårhelende assays ved fasekontrastmikroskopi over tid. (G) RT-PCR av Snail1, Snail to, og Sox9 fra foreldre, NKG2D-utarmet eller scrRNAi-omsatte MCF-7 celler.
(A) Ved fasekontrastmikroskop, MCF-7- TF cellene tilbake til epitelial morfologi når de utsettes for hemmere av PI3K (LY294002) eller pan-AKT (AKTV), men ikke fra MEK1 /2 (U0126) eller JNK (SP600125). (B, C) Hemming av PI3K eller AKT reverserer EMT protein markør og transkripsjonsfaktor profiler i MCF-7-TF og Dox-induserte MCF-10AT-TF-celler, vist ved immunoblot og /eller RT-PCR. (D, E) Hemming av PI3K eller AKT reduserer trekkende og invasive aktiviteter MCF-7-TF og Dox-indusert MCF-10AT-TF celler. Barer representerer bety celle tall (+/- SD) utledet fra tre uavhengige
i
vitro
migrasjon og invasjon eksperimenter med hver fire mikroskopiske felt teller. Stjernene betegne
p
. 0,005
EMT-forbundet ombygging av celle-celle og celle-matrix adhesjon endows kreftceller med trekkende og invasive egenskapene [10]. Vi testet for økt bevegelighet av MCF-7-TF celler i standardtester scoring migrasjon gjennom mikro membran eller traversion rekonstituert basalmembran (Matrigel). Ved sammenligning med MCF-7 mock-transfekterte kontroll, disse eksperimentene viste omtrent seks-og 12-gangers økning i trekkende og invasive aktiviteter, henholdsvis av MCF-7-TF-celler, som ble undertrykt i NKG2D-utarmet MCF-7 -TF-KO celler (Figur 1D og 1E). For en alternativ tilnærming, skrap sårlukking ved konfluente monolag av MCF-7-TF og kontrollceller ble fotografert ved fasekontrastmikroskopi. Mens MCF-7-TF celler oppnådd fullstendig lukking av sår i løpet av 72 timer, liten eller ingen endring ble sett med negative kontrollcellene (Figur 1F). Til sammen disse resultatene fullført
i
vitro
studier av MCF-7-TF celler som tyder på at NKG2D-DAP10 har kapasitet til å aktivere kreftcelle EMT.
MCF- 7 er en luminal brystkreft linje med epitel-funksjoner, så vel som noen konstitutive epithelial til mesenchymale plastisitet, som er typisk for de fleste brysttumorlinjer [13], [14]. Derfor Snail1 og Snail2 mRNA kunne påvises ved høy-syklus (36 runder) RT-PCR i utransfekterte MCF-7 ordnede celler (Figur 1G). I samsvar med en involvering av endogen NKG2D i Snail1 /2 induksjon, NKG2D uttømming i MCF-7-NKG2D RNAi cellene ført til reduksjon eller tap av disse transkripsjoner i forhold til egge RNAi kontroll Transduktantene (MCF-7-scrRNAi celler, figur 1G, for flowcytometri profiler av disse modellseriene se Figur S1 A og S1G). Endogen NKG2D kan således i prinsippet ha en evne til å fremme differensiering mot mesenchymale signaturer, men disse effektene kan ikke trenge inn på grunn av den knappe uttrykk. Følgelig, tilstedeværelse eller mangel på endogen NKG2D-ekspresjon i brystkreft linjer, for eksempel den epiteliale MCF-7 (NKG2D
+) eller mesenkymale SUM149PT (NKG2D
-), er uinnrettet med deres hovedsakelig epitelial versus mesenchymale representasjoner [3- ], [9], [14], [15].
Induksjon av kreftcelle EMT er en generell kapasitet på NKG2D-DAP10
for bekreftelse av hovedfunnene på tvers av ulike kreft linjer, vi testet NKG2D-DAP10 transfektanter av SUM149PT brystkreft [9], A375 melanoma [3], og MDAH-2774 eggstokkreft celler, og i flere detalj MCF-10AT premaligne mammary epitelceller, som var co-transduced med lentiviral konstruksjoner for doksycyklin (Dox) -inducible NKG2D og DAP10 uttrykk (Figur S2A og S2B). Til forskjell fra MCF-7-celler, alle disse fire linjer mangler endogen NKG2D (figur S2A og S2B) [3], [9], men har evnen til å gjennomgå EMT [13], [16] – [19]. Som med MCF-7-TF celler, signal ferdighet av ectopically uttrykt NKG2D-DAP10 har blitt vist for SUM149PT-TF og A375-TF linjer [3], [9], og ble bekreftet med den nylig genererte MDAH-2774-TF og MCF-10AT-TF celler ved immunoblot påvisning av phosphokinases
P
-Akt
S473 og
P
-ERK1 /2
T202 /Y204 etter anti-NKG2D antistoff kryssbinding ( Figur S2C).
Med alle fire tumorlinjer, ektopisk NKG2D-DAP10 uttrykk (konstitutiv eller Dox-indusert) trykt morfologiske (vises bare for MCF-10AT-TF celler), markør protein, og transkripsjons EMT signaturer registrert med MCF-7-TF celler (Figur S3A-D). Videre flowcytometri av Dox-indusert MCF-10AT-TF celler for overflate E-cadherin og N-cadherin bekreftet at aktivering av EMT var celle kontakt- og dermed antagelig ligand-avhengig (figur S3E). Alle kreft linjer med konstitutiv eller Dox-indusert ektopisk NKG2D-DAP10 uttrykk viste markant økt
i
vitro
trekkende og invasive aktiviteter (Figur S3F).
Avhengighet av EMT omprogrammering ved aktivering av PI3K-AKT
for å presisere NKG2D-DAP10 signal krav til EMT aktivering, MCF-7-TF og Dox-indusert MCF-10AT-TF celler ble utsatt for farmakologiske hemmere av PI3K (LY294002), pan -AKT (AKT Inhibitor V), MAP-kinase kinase (MEK1 /2) oppstrøms av ERK (U0126), og JNK (SP600125). Induksjon av alle tidligere undersøkt EMT kriterier, inkludert morfologiske endringer (vises bare for MCF-7-TF celler), diagnostisk protein markør og transkripsjonsfaktorer signaturer og bevegelighet, var avhengig av PI3K-AKT signale aksen med ingen merkbar bidrag ERK og JNK (figur 2A-E). I en komplementær tilnærming, ble NKG2D uttrykt i MCF-10AT celler ved transduksjon sammen med DAP10 mutert på enten sin PI3K /P85 (M88Q *) eller GRB2 (N87Q *) bindingssetet [20]. Etter bekreftelse av riktig ekspresjon og funksjon av varianten NKG2D-DAP10 komplekser (figur 3A og 3B), testing for induksjon av EMT parametere konstatert deres avhengighet av rekruttering av PI3K /P85, men ikke fra GRB2 (figur 3C-E).
(A) Immunpresipitasjon (IP) og immunoblot (IB) av NKG2D og /eller DAP10 (N87Q * eller M88Q *) i omsatte MCF-10AT celler (topp to paneler). Tre nederste panelene viser primær påvisning av DAP10 og gjensidig utelukkende sammenslutning av sin N87Q * og M88Q * varianter med P85 og GRB2 hhv. (B) Signa funksjonalitet DAP10 N87Q * og M88Q * varianter. Merk at ERK er nedstrøms PI3K. EGF ble tilsatt for kontroll aktivering, DMSO for løsningsmiddelkontroll. (C, D) Tilbakeføring av EMT protein markører og markør transkripsjon profiler ved ekspresjon av DAP10 (M88Q *) med nedsatt binding av P85, som er vist ved immunoblot og /eller RT-PCR. (E) DAP10 variant M88Q * men ikke N87Q * reduserer trekkende og invasive aktiviteter Dox-indusert MCF-10AT celler som uttrykker de respektive NKG2D-DAP10 mutante komplekser. Barer representerer gjennomsnitts celle tall (+/- SD) utledet fra tre uavhengige
in vitro
migrasjon og invasjon eksperimenter med hver fire mikroskopiske felt teller. Stjernene betegnes som
p
. 0,005
Association of NKG2D-DAP10 med EMT signaturer av
ex vivo
kreftceller
Signale ferdighet av den NKG2D-DAP10 reseptoren i brystcancerceller er blitt dokumentert [3] og ble bekreftet her med to ekstra brystkreft prøver (figur S1H). Antistoff-mediert reseptor-kryss indusert AKT fosforylering nedstrøms PI3K i brystkreftceller sortert for fraværet av CD45 (blodkreft eksklusjon celle), uttrykk for EpCAM (kreftcelle inkludering), og NKG2D. Utseende av fosfor-AKT (
P
-AKT) var følsom for Ly294002 og dermed avhengig av PI3K. For å fastslå biologisk relevans NKG2D-DAP10 i EMT omprogrammering, ble nylig isolerte cellesuspensjoner fra 12 primære invasive brystkreftprøver (referert til som BT1 å BT12) undersøkt av multi-parameter overflaten flowcytometri for CD45, EpCAM, NKG2D, og E -cadherin
– /N-cadherin
+ EMT signatur. EpCAM er en
bona fide
kreftcelle markør selv om nedregulering kan oppstå under EMT [12], [21]. Faktisk EpCAM uttrykk blant CD45
– cellepopulasjoner var heterogen i alle bortsett fra én (BT8) av de 12 tumorcellesuspensjoner (Figur 4A). Vi undersøkte derfor CD45
-EpCAM
høy og CD45
-EpCAM
lave celler separat for overflate NKG2D og E-cadherin /N-cadherin mønstre. I samsvar med våre tidligere funn [3], NKG2D
+ kreftceller var tilstede i alle 12 brystkreftprøver, varierer mellom 0,5 og 27,8% (gjennomsnitt 9,7 +/- 9,1%) av totale CD45
-EpCAM
høye celler (tabell S1). EMT representerer et kontinuum med epitel /mesenchymale hybrid og fullt overført mesenchymale-lignende tilstander [10], [11], [21]. Basert på våre funn med modellen tumorlinjer, bør kreftcelle NKG2D dermed bli assosiert med både hybrid (E-cadherin
+ N-cadherin
+) og ytterligere differensiert (E-cadherin
N-cadherin
+) fenotyper. I ni av de 12 tumorcellesuspensjoner testet (BT4 til BT12), mest NKG2D
+ mellom CD45
-EpCAM
høye celler hadde E-cadherin /N-cadherin mønstre i samsvar med enten delvis (E- cadherin
+ N-cadherin
+) eller mer utviklet (E-cadherin
N-cadherin
+) EMT (Figur 4A og 4B). Med unntak av BT8, BT11 og BT12 suspensjoner, forvrenger mot de fenotyper var ikke tydelig mellom matchet NKG2D
– kreftceller. I tre tilfeller (BT1, 2 og 3), kreftceller med blandede eller mesenchymale signaturer ble begrenset til NKG2D
+ undergruppe, men ble ikke dominerende (figur 4B).
(A) Eksempler (bryst kreftprøvene BT4 og BT5) av multiparameter flowcytometri dot plots som viser kreftcelle gating basert på fravær av CD45 og nærvær av EpCAM (høy eller lav) og påfølgende visning av E-cadherin /N-cadherin fenotyper av NKG2D
+ eller NKG2D
– kreftcelle undergrupper. Tall i kvadranter indikerer celle proporsjoner i prosent. Quadrant porter er basert på fluorescens-minus-en isotype Ig kontroll stainings. (B, C) grafisk visning av data utledet fra 12 brystkreft prøver (BT1-BT12) som ble analysert som i (A). E
+ N
-, E
+ N
+, og E
N
+ referere til E-cadherin og N-cadherin status. Fargene tilsvarer prikkplott kvadranter i (A). Se hovedtekst for nærmere forklaring.
NKG2D
+ celler ble også bemerket blant CD45
-EpCAM
populasjoner lave tumorcelle, bestående av mellom 0,3 og 59,3% (gjennomsnitt 12,6 + /- 18,9%) (tabell S1). I alle men BT1 prøven, NKG2D
+ CD45
-EpCAM
lave bestander også fortrinnsvis vises EMT fenotyper. Spesielt i enkelte prøver (BT3, BT5, BT6, og BT12), andeler av mesenchymale (E-cadherin
N-cadherin
+) celler var betydelig større blant NKG2D
+ CD45
– EpCAM
lav i forhold til NKG2D
+ CD45
-EpCAM
høye celler, noe som tyder på at EpCAM downregulation kan oppstå sent i EMT prosessen (figur 4B og 4C). Til sammen disse observasjonene bekreftet de funn som er gjort med modellen tumorlinjer, som støtter en fremtredende rolle NKG2D som en naturlig aktivator av EMT i kreft. Dette er konsistent med det faktum at den NKG2D
+ celler bestående vesentlige andeler når registrert som prosent av totalt antall hybrid og mesenchymale markør profil-positive celler (tabell S1). Alle 12 tumorcellesuspensjoner inneholdt varierende mengder av CD45
-EpCAM
– celler som manglet E-cadherin og N-cadherin og dermed kunne ikke være knyttet til en bestemt celletype. Med unntak av fire vevsprøver (BT2, BT3, BT11 og BT12), NKG2D
+ celler var fraværende blant de befolkninger.
NKG2D induserer EMT i en svulst xenotransplantat modell
utfyllende bevis for en rolle NKG2D i EMT er innhentet fra svulster som stammer fra SUM149PT-TF eller negative kontrollceller orthotopically xenopodet inn melkefettputer av NOD /SCID-mus, en modell eksperiment som var instrumental i å etablere NKG2D drevet tumorigenicity [9]. Mer direkte
in vivo
bevisene var ikke mulig siden spontane eller kreftfremkallende-indusert kreft i mus mangler NKG2D uttrykk [3]. Den SUM149PT linjen er fenotypisk heterogen, husing betydelige undergrupper av celler med mesenchymale markør profiler [14]. Derfor kan immunhistokjemi utgjøre vanskeligheter i vurderinger av EMT-tilknyttede endringer. Undersøkelse av xenograft tumor-avledede cellesuspensjoner ved hjelp av strømningscytometri eksponerte sterkt økte representasjoner av hybrid /mesenchymale fenotyper i alle fem NKG2D
+ SUM149PT-TF i motsetning til NKG2D
– mock kontrolltumorer (figur 5). EMT-forbundet trekkfugl aktivitet xenotransplanted SUM149PT-TF-celler kan ha bidratt til økt tumorcelle formidling tidligere observert i denne dyremodell [9].
Cell suspensjoner fra svulster avledet fra immunsvikt mus orthotopically xenopodet med brystkreft SUM149PT- TF-celler (øvre søylediagram) er sterkt forskjøvet mot hybrid E-cadherin
+ /N-cadherin
+ og videre overført E-cadherin
– /N-cadherin
+ fenotyper i forhold til kontroll mock-transfektert SUM149PT celle svulster (nedre bar graf). E
+ N
-, E
+ N
+, og E
N
+ referere til E-cadherin og N-cadherin status; MID, mus identifikasjonsnummer.
Opplæring av stemness omprogrammering av NKG2D
I tillegg til overdragelse trekk evner, EMT transkripsjon faktorer Snail1 og Twist regulere overflate markør profiler som definerer brystkreft cellepopulasjoner anriket for celler med stem-lignende egenskaper [22] – [24]. I samsvar med induksjon av Snail1 og Twist, ektopisk NKG2D-DAP10 uttrykk (konstitutiv eller Dox-indusert) var assosiert med brystkreft stamcelleliknende CD24
– /CD44
+ profil skift i MCF-7-TF , MCF-10AT-TF og SUM149PT-TF linjer (figur 6A) [22], [25]. Imidlertid kan bare en liten brøkdel av celler med CSC-lignende fenotyper betraktet som funksjonelle cscs [2]. Mer relevante for EMT-stemness sammenhengene kan være det faktum at EMT transkripsjonsfaktorer, som for eksempel Snail2 eller Zeb1, i samarbeid med separate genetiske kretser, også regulere funksjonelle bryst CSC stater [2], [26] – [28]. Ved microarray genekspresjon profilering, identifiserte vi en fremtredende induksjon av Sox9 transkripsjonsfaktor i MCF-7-TF sammenlignet med mock-transfektert kontrollceller (se microarray data på http: //www.ncbi.nlm.nih/geo/under tiltredelse kode GSE53961), som ble uavhengig bekreftet ved kvantitativ RT-PCR og immunoblot (figur 6B og 6C).
(A) To-farge flowcytometri av CD24 /CD44 mønstre i stabilt transfekterte MCF-7-TF og SUM149PT-TF, og Dox-indusert omsatte MCF-10AT-TF-celler (alle vist i rødt) sammenlignet med negative kontroller (markert med blått). Fargede tall i kvadranter indikerer tilsvarende celle proporsjoner i prosent. Viste data er representative for tre forsøk. (B) Kvantitativ RT-PCR av Sox9 i MCF-7 og MCF-10AT-avledet modellseriene. Eksperimentelle datalinjer representerer brette øker over negative kontroll datasett på en. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Stjernene betegne
p
0,005. (C) Tilsvarende Immunoblotanalyse data for Sox9 og aktin kontroll. (D) fasekontrastmikrografer av mammospheres dannet av MCF-7-TF og induserte MCF-10AT-TF versus negative styrelinjer. Stolpediagram ved rette (grå søyler) oppsummerer data som antall organoids (mer enn 100 um diameter) regnet i tre sett av triplikatbrønner hver podet med 10
3 MCF-7-TF-celler. Svarte striper representerer eksperimenter utført med MCF-7-TF celler under de samme betingelser i nærvær av hemmere av PI3K (LY294002), pan-AKT (AKTV), MEK1 /2 (U0126), eller JNK (SP600125). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. DMSO fungerer som løsemiddel kontroll. (E, F) som i (D), med MCF-7-celler som uttrykker TF Sox9 eller Snail2 RNAi eller scrRNAi kontroller. (G) fasekontrastmikrografer av mesenchymal versus epiteliale celler morfologier av cellelinjer som er presentert i (E, F). (H) Grafisk visning av proporsjoner Sox9
+ /Snail2
+ celler blant NKG2D positiv eller negativ CD45
-EpCAM
+
ex vivo
brystkreftceller (prøver BT13 til BT18) bestemt av multi farge flowcytometri.
Sox9 fungerer samarbeide med Snail2 (Slug) og i mindre grad Snail1 som en mester regulator av melkestamcelle tilstand [28]. Således, ved positivt å regulere Sox9 i tillegg til Snail2 og Snail1 (se figur 1B), NKG2D kan ha kapasitet til å fremme funksjonell stamcelle-lignende egenskaper. Denne forestillingen ble støttet av tredimensjonale Matrigel organoid kulturer og klassiske mammosphere analyser. I begge typer forsøk, MCF-7-TF-celler dannet tallrike stor (mer enn 100 pm) organoids mens mock-transfekterte kontroll eller MCF-7-TF-KO-celler generert bare noen få cellegruppene som var vanligvis liten (figur 6D). Som med EMT omprogrammering, organoid formasjon var avhengig PI3K-AKT med ingen åpen involvering av ERK eller JNK (figur 6D). Tilsvarende bevis for kapasiteten til å indusere NKG2D Sox9 og organoid dannelse ble oppnådd med Dox-induserte MCF10AT-TF-celler (figur 6B-D).
Sox9 og Snail2 er begge nødvendige for mammary epitelceller for å gå inn og stabilt opprettholde en funksjonell stamcelle tilstand [28]. Følgelig RNAi-mediert uttømming av Sox9, og hver av Snail2, opphevet organoid formasjonen i MCF-7-TF mammosphere kulturer [Figur 6E og 6F). I motsetning Snail2, som er tenkt å bidra til stamcelle induksjon
via
aktivering av en EMT, er effekten av Sox9 i EMT omprogrammering anses mindre [28]. Derfor EMT-forbundet morfologiske endringer av MCF-7-TF celler ble dermed reversert av RNAi-mediert uttømming av Snail2 men ikke fra Sox9 (figur 6G).
Den definerende kjennetegn på høyeste plastisitet kreftceller er deres effektiv startfasen på xenografting i immunsvikt mus. Vår tidligere musemodell studien viste en markert reduksjon av ventetider og forbedret svulst tilfeller med orthotopically transplantert MCF-7-TF versus kontroll linjer [9]. Disse resultatene er i samsvar med NKG2D-mediert induksjon av Sox9 og Snail2 og tilhørende oppkjøp av CSC kapasiteter. Denne induksjon også gitt en forklaring på den observerte forbedret startfasen av utransfekterte MCF-7 celler som uttrykker minimal endogen NKG2D (figur 1G, for flowcytometri profiler av foreldre MCF-7, MCF-7-NKG2DRNAi, og MCF-7-scrRNAi linjer se fig S1A og S1G) [9]. Å sondere for relevans i kreft hos mennesker,
ex vivo
kreftceller fra seks primære invasive brystkreftprøver (BT13 å BT18) ble testet for assosiasjoner mellom NKG2D og Sox9 og Snail2 av polykromatisk flowcytometri. I alle svulster, andeler av CD45
-EpCAM
+ celler samtidig uttrykte Sox9 og Snail2 var betydelig større blant NKG2D
+ sammenlignet NKG2D
– celler (Figur 6 H). Til sammen disse resultatene støtte tumorigent betydningen av NKG2D
via
Sox9- og Snail2-mediert induksjon av CSC trekk.
Diskusjoner
Høy plastisitet kreftceller anses hovedårsakene til tumor formidling og rebounding etter konvensjonell kreftbehandling [2], [29]. Denne studien viser at co-valgt uttrykk for, og signaliserte med, NKG2D på kreftceller fremmer kreftcelle plastisitet med differensiering mot mesenchymale fenotyper og formidlings-aktivering og tumor-initiering kapasiteter. Fysiologisk betydning støttes av reprisen av EMT og Sox9 signaturer registrert med modelltumorlinjer primær invasiv brystkreft. Det er sannsynlig at rollen NKG2D som en driver av kreftcelle plastisitet er bredt anvendelig, som strekker seg til minst eggstokkene, tykktarm og prostata carcinoma celler [3].
Relevansen av EMT, og ved slutning av stemness omprogrammering, i menneskelig svulst utvikling er ikke ukontroversiell [30]. Imidlertid siste flowcytometri-baserte demonstrasjoner av sirkulerende tumorceller med epitelial, mesenchymal, eller hybrid signaturer, og tilhørende metastase initiere kapasiteter, danner direkte bevis for human kreftcelle plastisitet og dets patofysiologiske betydning [21], [31]. Vårt multi-parametrisk encellet analyse av
ex vivo
tumorcellesuspensjoner strekker dette bevis for primær brystkreft og avdekker at blandet epitel /mesenchymale og mesenchymale-lignende brystkreft celle fenotyper er mer utbredt og antagelig mer komplisert enn tidligere antatt.
