Abstract
Bakgrunn og Mål
GLI1 er nøkkelen Transkripsjonsfaktor i Hedgehog signalveien i bukspyttkjertelkreft. RegIV er forbundet med regenerering, og cellevekst, overlevelse, adhesjon og resistens mot apoptose. Vi forsøkte å studere RegIV uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen og dens forhold til GLI1.
Metoder
GLI1 og RegIV uttrykk ble evaluert i svulstvev og tilstøtende normalt vev av kreft i bukspyttkjertelen pasienter og 5 bukspyttkjertelkreft celle linjer ved QRT-PCR, Western blot, og immunhistokjemi (IHC), og sammenhengen mellom disse. Den GLI1-shRNA lentiviral vektor ble konstruert og transfektert inn i PANC-1, og lentiviral vektor inneholdende GLI1 uttrykket sekvensen ble konstruert og transfektert inn i BxPC-3. GLI1 og RegIV uttrykk ble evaluert av QRT-PCR og Western blot. Til slutt viste vi RegIV å være målet for GLI1 av kromatin immunoprecipitation (CHIP) og elektromobilitet skiftanalyser (EMSA).
Resultater
Resultatene av IHC og QRT-PCR viste at RegIV og GLI1 uttrykk var høyere i kreft i bukspyttkjertelen vev versus tilstøtende normalt vev (p 0,001). RegIV uttrykk korrelert med GLI1 uttrykk i disse vev (R = 0,795, p 0,0001). Disse resultatene ble bekreftet for protein (R = 0,939, p = 0,018) og mRNA uttrykk (R = 0,959, p = 0,011) i 5 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. RegIV mRNA og protein uttrykk ble redusert (94,7 ± 0,3%, 84,1 ± 0,5%, henholdsvis) når GLI1 ble slått ned (82,1 ± 3,2%, 76,7 ± 2,2%, henholdsvis) av RNAi teknikk. GLI1 overekspresjon i mRNA og proteinnivå (924,5 ± 5,3%, 362,1 ± 3,5%, henholdsvis) indusert RegIV overekspresjon (729,1 ± 4,3%, 339,0 ± 3,7%, henholdsvis). Videre CHIP og EMSA analyser viste GLI1 proteinbundet til RegIV promotersekvensene regioner (GATCATCCA) i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Konklusjon
GLI1 fremmer RegIV transkripsjon ved binding til RegIV genet promoter i bukspyttkjertelkreft.
Citation: Wang F, Xu L, Guo C, Ke A, Hu G, Xu X, et al. (2011) Identifisering av RegIV som Novel GLI1 Target Gene i Human kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (4): e18434. doi: 10,1371 /journal.pone.0018434
Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA
mottatt: 10 oktober 2010; Godkjent: 04.03.2011; Publisert: 11 april 2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Natural Science Foundation of China (No. 81072065), Stiftelsen for Shanghai Science and Technology Committee (No. 09JC1412200, nr 09410705400), og doktorgrads Fund of Ministry of Education of China (No. 20090072110022). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er den fjerde vanligste kreftrelaterte dødsårsak i den vestlige verden [1] – [3] og har en forferdelig kamp prognose til tross for betydelig fremgang i ledelsen. Median overlevelse av PC er mindre enn 6 måneder; 5-års overlevelse er mindre enn 5% [1], [2]. Mer enn 80% tilstede med inoperabel sykdom; en tredjedel har lokal sykdom, mens resten har fjernmetastaser. Forskning de siste to tiårene har vist at PC er en genetisk sykdom fundamentalt, forårsaket av arve kimcellelinje og ervervet somatiske mutasjoner i kreftassosierte gener. Tumorprogresjon modell for PC der bukspyttkjertelen ductal epitel utvikler seg fra normal til økt graderinger av bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (PanINs) til invasiv kreft. Flere endringer i gener som er viktige i PC progresjon er identifisert, for eksempel K-ras, INK4A, p53, og SMAD4 /DPC4 [4], [5]. PC er preget av nær-universelle mutasjoner i K-ras og hyppig deregulering av avgjørende embryonale signalveier, inkludert the Hedgehog (HH) signalveien [6], [7]. En bedre forståelse av mekanismene bak utviklingen av PC kan bidra til å forbedre tidlig diagnostisering og potensielt identifisere molekylære terapeutiske mål.
pinnsvin (HH) signalveien ble først identifisert i den embryonale utviklingen av Drosophila [8] og har vist seg å være avgjørende for vekst og mønster i bukspyttkjertelen under embryonal utvikling. HH signale regulerer celledifferensiering og organdannelse under embryonal utvikling, og er uttrykt i bukspyttkjertelen epitelceller [9], [10]. Konstitutiv aktivering av HH-signalering blir detektert i en rekke humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [9] – [13]. Gitt sin misexpression i både metastatisk kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer og i forstadier (Panin) [14], kan HH signal aktivering være involvert i både tidlig og sent i bukspyttkjertelen tumorigenesis.
Av de tre pattedyr ligander i HH familie Sonic (SHH), Desert (DHH), og indisk (IHH) Hedgehog [15], den tidligere har blitt assosiert med både bukspyttkjertelen organogeneseperioden og bukspyttkjertelkreft. HH signaler overføres og modifisert av to trans proteiner, lappet (ptch) og glattet (SMO), og ved nedstrøms transkripsjonsfaktorer som er medlemmer av gliom-assosiert onkogen (GLI) familie (GLI1, 2 og 3). GLI2 og GLI3 har trans og undertrykkende domener, mens GLI1 sannsynlig fungerer bare som en transaktivatorprotein og transkripsjonen målet for HH veien selv [16] – [19]. Den regenererende gen (Reg) familien, er en gruppe av små sekretoriske proteiner, er involvert i celle-proliferasjon eller differensiering i fordøyelsesorganene [20] blir oppregulert i flere gastrointestinal kreft, og virker som trofisk eller antiapoptotic faktorer [21] – [23] . RegIV, et medlem av den regenererende genfamilien, er involvert i fordøyelseskanalen maligniteter, inkludert magen [24], colorectum [25], [26], og bukspyttkjertel [27], [28], samt i benigne sykdommer slike som ulcerøs kolitt [29]. RegIV overekspresjon i tumorceller har vært assosiert med cellevekst, overlevelse, adhesjon og resistens mot apoptose. Nylig ble RegIV overekspresjon rapportert å være assosiert med initiering og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen, og ble foreslått som en lovende tumormarkør for å screene tidlig stadium PC og mål for adjuvant terapi i PC [28], [30].
funksjonene GLI1 og RegIV syntes å være lik i vår gjennomgang av litteraturen; således, undersøkte vi uttrykket og korrelasjon av GLI1 og RegIV i PC-vev og cellelinjer. Vi har også utforsket mulig mekanisme mellom GLI1 og RegIV, ved hjelp av chip og EMSA analyser.
Materialer og metoder
cellelinjer og vev
Menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer, Panc -1, ASPC-en, BxPC-3, CAPAN-2 og SW1990, ble kjøpt fra Chinese Academy of Sciences komiteen Type Culture Collection cellen bank. PANC-1 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco BRL, USA), de andre typer av celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco BRL, USA), og alle medier var supplert med 10% FBS (Gibco BRL, USA), penicillin G (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml). Celler ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO2. Tolv par av PC og tilsvarende ikke-kreft bukspyttkjertelen vev ble hentet fra Shanghai Tenth Folkets sykehus med full skriftlig etisk samtykke. Ingen av disse pasientene hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før kreft reseksjon. En annen 9 sammenkoblede vev skiver ble hentet fra patologi avdeling av Shanghai tiende Folkets sykehus. Studien ble godkjent av etisk komité Tongji University School of Medicine og biovitenskap.
Kort hårnål RNA (shRNA) Design og Vector Produksjons
Forstyrrende sekvenser som tilsvarer forskjellige regioner av GLI1mRNA, som vel som negativ kontroll med ingen homologi for mennesker eller mus gener ble designet av Shanghai GeneChem Biotech (tabell 1). Tre siRNA tomannsboliger ble screenet for GLI1 knock-down med Western blot analyse i kotransfeksjon eksperimenter med GLI1 uttrykk plasmid i HEK 293T celler. Den mest vellykkede sekvens og en ikke-tie Luciferase-sekvensen ble utformet til en shRNA oligonukleotid mal bestående av forstand, hårnål sløyfe, antisens og terminatorsekvenser, som alle ble flankert av restriksjonsenzymseter for å lette retningsbestemt sub-kloning. De resulterende vektorer som kodet for GFP under transkripsjonen kontroll av promoteren EF1 og et H1 promoter oppstrøms for kloningsrestriksjonsseter (
Mlu I og
Clal
I) for å tillate innføring av oligonukleotider som koder shRNAs. Enten shRNA mot GLI1 eller en nonsilencing-Luciferase shRNA ble plassert under H1 promoter (figur 1). Den riktige innsetting av spesifikke shRNA ble ytterligere bekreftet ved direkte DNA-sekvensering.
For det GLI1-shRNA vektor, to enkelttråd DNA som koder for to linkere, mål-sekvenser og en løkke element, ble syntetisert. Disse ble glødet å doble DNA, og ligert inn i pLVTHM følgende
Mlu
jeg og
Cal
jeg fordøyelsen. Den korte hårnål form av shGLI1 uttrykkes under kontroll av human H1 promoter. Vektoren inneholder også et menneske EF1-α promoteren driver GFP-markørgenet for sporing av transduserte celler. Vektorene ble generert ved transient transfeksjon av pRSV-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G, og shRNA koding pLVTHM inn 293T celler. Forkortelser: RRE, Rev respons element; cPPT, sentral polypurine kanalen; EF1-α, human elongeringsfaktor 1-α promoteren; H1, den menneskelige H1 arrangøren; GFP, grønn fluorescerende protein; PRE, human hepatitt virus posttranskripsjonelt regulerende element.
For produksjon av lentiviral vektor, HEK 293T celler ble dyrket til 30-40% samløpet ved neste dag. Den neste dag ble mediet erstattet med DMEM /10% FBS uten antibiotika. Deretter 20 mikrogram shRNA plasmid DNA (tull shRNA eller GLI1 målretting shRNA, GeneChem Biotech, Shanghai, Kina), 7,5 mikrogram pMD2G, 10 mikrogram pRSV-Rev, og 15 mikrogram pMDLg-pRRE ble blandet med steril DDH
2o til et sluttvolum på 1800 pl, ble deretter blandet med 200 ul 2,5 M CaCl
2. DNA-blandingen ble oksygenert og 2000 ul 2 x PBS (pH 7,05) tilsatt i dråper, og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Transfeksjon Blandingen ble tilsatt til sine respektive plater og inkubert over natten. Mediet ble byttet ut etter 12 timer med DMEM supplementert med 10% FBS. Etter 48 timer ble det kondisjonerte medium inneholdende shRNA lentivirus oppsamlet og filtrert gjennom 0,45 um porestørrelse celluloseacetat filtre, og lagret på is. Viruset ble konsentrert ved spinning ved 70 000 G i 2 timer og resuspendert med 500 ul PBS. Transduksjon enhet (TU) titer ble vurdert på HEK-293T-celler i nærvær av polybren 8 mikrogram /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Titre av 2-5 × 10
8 TU /ml ble rutinemessig oppnådd.
Overuttrykte-GLI1 Lentiviral Vector Construction
Menneske GLI1 cDNA ble kjøpt fra Open-Biosystem (USA). Den komplette cDNA-sekvens av GLI1 ble generert ved PCR ved anvendelse av forover-primer, 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTCAACTCGATGACCCCAC-3 «; og revers primer, 5»-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGGCACTAGAGTTGAGGA-3 «; deretter satt inn i en PGC-FU-EGFP-3FLAG Vector (GeneChem Company, Shanghai, Kina). Transformanter ble analysert ved sekvensering. Det resulterende 3320 bp-fragmentet ble bekreftet ved sekvensering (figur S1) og sammenlignet med sekvensen av det GLI1 genekspresjon region i GenBank (NM_005269.2). For å produsere lentiviral lager, ble 293ft celler dyrket til 70-85% samløpet den påfølgende dagen. Den fullstendige kulturmediet ble fjernet. Cellene ble deretter utsatt til 5 ml medium (Opti-MEM, Invitrogen) med komplekser som inneholder emballasje helper konstruksjon (GeneChem Company, Shanghai, Kina), 20 mikrogram uttrykk plasmid DNA (PGC-FU-EGFP-3FLAG-GLI1), eller kontroll plasmid DNA (PGC-FU-EGFP-3FLAG) med 100 ul lipofektamin 2000 (Invitrogen, USA) i nærvær av polybren (8 ug /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Etter inkubering i 24 timer ble mediet erstattet infeksjon med komplett kulturmedium. Lentivirus-holdige supernatanter ble høstet 72 timer etter transfeksjon. Supernatantene ble sentrifugert for å fjerne rusk og pelleten lagret ved -80 ° C. Titre av 2-5 × 10
7 TU /ml ble rutinemessig oppnådd.
Lentiviral Transfeksjon
Cells (1 × 10
5) i en seks-brønns plate ble transfektert med lentiviral vektoren ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) = 5 (PANC-1) eller 20 (BxPC-3) i nærvær av 8 mikrogram /ml polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Etter 72 timers transfeksjon, ble mediet erstattet med 2 ml fullstendig dyrkingsmedium. 48 timer etter transfeksjon, ble GLI1 uttrykk etablert av sanntids-PCR og Western blot analyse.
flowcytometri
Celler ble justert til 1 × 10
6 celler /100 ul og brukt for flowcytometri. Totalt 10.000 hendelser ble analysert for å fastslå transfeksjon effektivitet ved hjelp av FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) Cell-Quest programvare.
QRT-PCR
Sanntids kvantitativ revers-transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) analyse ble utført med ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA). GLI1 og RegIV mRNA uttrykk ble analysert ved QRT-PCR bruker SYBR grønt fargestoff. β-aktin ble benyttet som husholdningsgenet. Target genekspresjon ble normalisert til p-aktin og analysert av 2
-ΔΔCT
formel. Primersekvensene er som følger: GLI1, fremover: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT, omvendt: CCCTATGTGAAGCCCTATTT, RegIV, fremover: CGCTGAGATGAACCCCAAG, omvendt: TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG. β-aktin, fremover: AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA, omvendt: CTGGAACGGTGAAGGTGACA. Alle reaksjoner ble utført minst tre ganger.
Western blot-analyse
Cellene ble skylt to ganger i PBS, deretter lysert i 2 timer i RIPA lysebuffer på is og sentrifugert ved 12000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved den standard BCA-metoden (BCA Protein Assay Kit ™, Pierce, USA). 50 ug av totalt protein ble separert ved SDS-PAGE ved anvendelse av 6% eller 12% polyakrylamidgel med Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad, USA). GLI1 og RegIV protein i gel ble overført til en 0,45-mikrometer nitrocellulose membran med Mini Transfer Cell og Trans-blot SD Semi-Dry Transfer Cell henholdsvis (Bio-Rad, USA).
De immunologiske reagenser som brukes for Western blot var kanin monoklonalt antistoff mot GLI1 (1:200, Santa Cruz, USA) og geitepolyklonalt anti-RegIV antistoff (1:100, Santa Cruz, USA). Mus polyklonalt anti-β-aktin-antistoff (1:5000, Santa Cruz, USA) ble anvendt som kontroll lasting. Blottene ble utviklet med en standard forsterket kjemiluminescens (ECL) metoden (Pierce, USA). Alle forsøk ble gjentatt flere ganger, og ga tilsvarende resultater.
Immunhistokjemi
tumorsnitt ble deparaffinized, rehydrert, og behandlet med 10 mM citratbuffer (pH 6,0) ved 95 ° C for å hente antigener. Etter bråkjøling av endogen peroksidaseaktivitet med H
2o
2 og blokkering med 10% normalt hesteserum, ble seksjonene inkubert sekvensielt med de primære antistoffer geit-anti-RegIV (1:100, Santa Cruz, California, USA), kanin anti-GLI1 (1:200, Santa Cruz, California, USA), biotinylerte sekundære antistoffer, og ABC reagens (Gene Tech, Shanghai, Kina). Den farging ble visualisert med 3,3-diaminobenzidin (Gene Tech, Shanghai, Kina). Seksjonene ble deretter kontra med hematoksylin. Negative kontroller ble utført i hvert tilfelle ved å erstatte den primære antistoff med PBS.
Chromatin immunoprecipitation (CHIP)
Vi endret tidligere rapportert protokollen [31] for kromatin immunoprecipitation (CHIP). I korte trekk, PANC-1-celler (3 x 10
7) ble kryssbundet med 1% formaldehyd. Fikseringen Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 10 ml glycin (0,125 M), deretter kromatin ble oppsamlet med 1 ml IP-buffer inneholdende protease inhibitor cocktail. Kromatin ble skåret ved anvendelse av en sonikator med en 4 mm spiss sonde 3 ganger i 10 sekunders pulser (60 W, 80 W og 100 W, henholdsvis 90 s intervaller) i en isboks. Tverrbinding ble reversert ved tilsetning av 20 ul av 5 M NaCl over natten ved 65 ° C. DNA ble ekstrahert ved hjelp av fenol /kloroform analysen. 20 ul av DNA ble underkastet elektroforese på en 1,5% agarosegel, og resten ble konservert ved -20 ° C som INPUT DNA. Løselig kromatin ble immunopresipitert med 2 ug anti-GLI1 kanin monoklonalt antistoff (Santa Cruz, California, USA). 2 ug muse IgG (Santa Cruz, California, USA) ble tilsatt som en tilfeldig kontroll, RNA polymerase II som en positiv kontroll, og β-actin-antistoff som en negativ kontroll. DNA-protein-immunkompleksene ble eluert og omvendt tverrbundet, og DNA ble ekstrahert med fenol /kloroform og utfelt. Nærværet av RegIV promoteren domene som inneholder GLI1 motivene i immunopresipitert-DNA ble identifisert ved PCR ved anvendelse av de følgende primere: RegIV-A for området 1 (118 bp), forover: 5′-5-TGGTCCCTTCCAGACTTA-3-3 «, omvendt: 5 «- TCCAGTATAGATGGCAAA -3». RegIV-B for området 2 (131 bp), frem: 5′-CTAACCCTTTGCCATCTA -3 «, omvendt: 5′-GACCTGGACACTGAACCTTG-3». RegIV-C i stedet 3 (70 bp), frem: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 «, omvendt: 5′-GTGTTACATAACGGGTTT-3». RegIV-D for site4 (70 bp), frem: 5′-TGTAACACACTCTGTTGATGTAAGC-3 «, omvendt: 5’CTATTTGAGCTTCTCCCGCAG-3». RegIV-E for nettsteder 3 og 4 (226 bp), frem: 5′-CTCGGAAGGTTTCTAATC-3 «, omvendt: 5’TTCAACATGCGTGAGTTT-3». RegIV-F for nettsteder 3 og 4 (481 bp), frem: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 «, omvendt: 5′-AGACGGCTTCAGAATGTA-3». RegIV-G for området 5 (315 bp), frem: 5′-TTCCTGAGGCAAGAAGAT-3 «, omvendt: 5′-CCAAGATTTAACCCAACA-3». PCR-betingelsene for RegIV promoter-regionen var: denaturering i 30 sekunder ved 94 ° C, annealing 30 s, forlengelse 1 minutt ved 72 ° C. Annealing temperaturer for RegIV-A-G var 55 ° C, 56 ° C, 56 ° C, 47 ° C, 56 ° C, 56 ° C, og 52 ° C, respektivt. Forsterkningen av den RegIV promoter-regionen ble analysert etter 35 sykluser. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
Elektro Mobility Shift Analyser (EMSA)
Nuclear ekstrakter ble tilberedt med NE-PER Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Pierce, Rockford, USA). EMSA og supershift EMSA med digoksin-merkede prober ble utført ved hjelp av DIG-Gel shift kit i henhold til produsentens instruksjoner (Roche, Basel, Sveits). Sekvensene til de oligonukleotider som ble anvendt var 5′-AGAACATGGATGATCATGTCA-3 «(bindingsmotiv understreket). Mutante oligonukleotider som ble anvendt var 5»-AGAACAAAAAATTTTATGTCA-3 «. I supershift studien ble 5 pg kanin-monoklonalt antistoff mot GLI1 inkubert med 5 pg av kjerneekstrakt på is i 30 minutter før tilsetning av den merkede probe, og ytterligere inkubert på is i 30 minutter. Hele 20 ul bindingsreaksjonen ble løst på en 7% polyakrylamidgel og overført til en positivt ladet nylonmembran (Bio-Rad, USA) i 0,5 x Tris-borat EDTA-buffer.
Statistisk analyse
Kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Real-time PCR data ble analysert i henhold til forskjellene i mål genuttrykk ved paret t-test og var 2
-ΔΔCT
transformert før analyse. Forholdet mellom GLI1 og RegIV ekspresjon ble analysert ved hjelp av Spearman. IHC data ble analysert ved anvendelse av Chi-kvadrat-test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
GLI1 og RegIV uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen vev
Å studere GLI1 og RegIV uttrykk i PC, QRT -PCR og IHC ble brukt på 12 parvise biopsi vev. GLI1 uttrykk var høyere i 9 tilfeller (9/12) sammenlignet med tilstøtende normale bukspyttkjertelen vev (p = 0,011; figur 2); RegIV uttrykk var høyere i 9 tilfeller (9/12) (p = 0,011; figur 2). Det var en positiv korrelasjon mellom GLI1 og RegIV i PC vev (R = 0,795, p 0,0001, figur 2). På IHC, fant vi RegIV å bli uttrykt bare i beta-cellene normale endokrine bukspyttkjertelen vev, som bekreftet Oue rapport [37]. På IHC, GLI1 og RegIV ekspresjon var høyere i de fleste PC sammenlignet med normale vev (15/21 versus 4/21, p = 0,001; 14/21 versus 5/21, p = 0,005, henholdsvis figur 3). 15 av 21 PC tilfeller hadde høy ekspresjon av GLI1 protein, blant hvilke 11 tilfeller uttrykte høye nivåer av RegIV protein (p = 0,001; figur 3).
ekspresjon av GLI1 RegIV mRNA i 12 par PC vev og tilstøtende normale vev (A-B). DNA fra prøvene ble samlet fra kirurgiske biopsier, og relativ GLI1 og RegIV mRNA-ekspresjon ble påvist ved QRT-PCR. Statistisk sammenheng mellom ekspresjonen av GLI1 og RegIV mRNA i 12 par PC vev og tilstøtende normale vev ble analysert ved hjelp av Spearman test (C). Alle resultater ble normalisert til p-aktin mRNA-ekspresjon. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD og ble beregnet ved hjelp av paret t-test. Signifikant forskjellig mellom to grupper: * p 0,05. ** P 0,01. NS. Uvesentlig
Alle prøvene ble samlet inn, formalinfiksert, parafininnebygd, og oppdaget av IHC. Representative bildene vises. Positiv farging av GLI1 ble observert ved PDAC cellekjernen (A); imidlertid tilstøtende normale vev viste ingen eller svak farging for GLI1 (B). I tilstøtende normale pankreatiske vev, bare øyceller viste positiv farging av RegIV (D), mens den positive farging av RegIV ble observert samt slimlignende cytoplasma granulat i PC vev (C). Alle mikrofotografier ble oppnådd ved 200 x forstørrelse. Skala barer, 100 mikrometer.
Sammenhengen mellom GLI1 og RegIV
Vi testet GLI1 og RegIV uttrykk i 5 PC-cellelinjer ved qPCR og Western blot. Det var en positiv korrelasjon mellom graden av GLI1 og RegIV mRNA og protein (R = 0,958, p = 0,011 og R = 0,939, p = 0,018, henholdsvis figur 4). GLI1 og RegIV ble overexpressed i PC versus normale bukspyttkjertelen celler.
Uttrykk for GLI1 og RegIV proteiner i 5 bukspyttkjertelkreft cellelinjer som oppdaget av Western blot analyse på celleekstrakter, ved hjelp av anti-GLI1 og anti-RegIV antistoffer ( EN). β-aktin ble benyttet som lasting kontroll i alle forsøkene. Resultatene ble kvantifisert ved å bestemme intensitetene for bånd sammenlignet med den for β-aktin (B). Statistisk sammenheng mellom ekspresjon av GLI1 og RegIV protein i 5 PC-cellelinjer ble analysert ved hjelp av Pearsons test (C). Relativ GLI1 og RegIV mRNA uttrykk ble undersøkt ved QRT-PCR (D). Ekspresjonen av GLI1 og RegIV mRNA ble normalisert til p-aktin mRNA-ekspresjon. Statistisk sammenheng mellom ekspresjonen av GLI1 og RegIV mRNA i 5 PC-cellelinjer ble analysert ved hjelp av Pearsons test (e). Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
RegIV uttrykk endres med GLI1 uttrykk i PANC-en og BxPC-3
For ytterligere å bekrefte forholdet mellom GLI1 og RegIV i PC-celler, har vi designet og konstruert shRNA-GLI1 lentiviral vektor, og transfektert den inn PANC-en, en PC cellelinje med det høyeste uttrykk for GLI1 (figur 4). 48 timer etter transfeksjon, ble effektiviteten av transfeksjon vist ved flowcytometri (FCM) til å være mer enn 95% (figur S2); stabil fluorescens kan fortsatt bli oppdaget selv etter 20 passasjer (Figur S3).
Etterpå ble QRT-PCR og Western blot brukes til å oppdage RegIV uttrykk i GLI1-shRNA-PANC-1 celler. Celler uten transfeksjon ble anvendt som kontroller, mens celler transfektert med krafse shRNA ble anvendt som negative kontroller. RegIV mRNA redusert med 94,7 ± 0,3% når GLI1 mRNA redusert med 82,1 ± 3,2%. RegIV protein redusert med 84,1 ± 0,5% når GLI1 protein redusert med 76,7 ± 2,2% (figur 5). Dette antydet at RegIV uttrykk redusert når GLI1 ble brakt til taushet av RNAi.
Panc-1 celler ble transfektert med GLI1-shRNA eller GFP-shRNA, BxPC-3 celler ble transfektert med LV-GLI1-EGFP eller LV-EGFP da ekspresjon av mRNA GLI1 forhold til den for β-aktin mRNA ble undersøkt ved QRT-PCR (A, D). Etter transfeksjon, ble ekspresjon av GLI1 proteiner analysert ved hjelp av Western blot (C, F). Det innfelte viser en betydelig nedgang i RegIV uttrykk ved real-time RT-PCT (B, E) og Western blot analyse (C, F). Resultatene ble normalisert til den av β-aktin ekspresjon. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Vi videre utformet og konstruert et lentivirus vektor som uttrykte GLI1, og transfektert den inn BxPC-3, med lavest GLI1 uttrykk i 5 cellelinjer (figur 4), for å avgjøre om RegIV uttrykk endres sammen med GLI1. 48 timer etter transfeksjon, ble QRT-PCR og Western blot brukes til å oppdage RegIV i LV-GLI1-BxPC-3 celler. Celler uten transfeksjon ble anvendt som kontroller, mens celler transfektert med tom vektor lentivirus ble anvendt som negative kontroller. RegIV mRNA økt med 729,1 ± 4,3% når GLI1 mRNA økt med 924,5 ± 5,3%. RegIV protein økt med 339,0 ± 3,7% når GLI1 protein økt med 362,1 ± 3,5% (figur 5). Dette innebærer at RegIV uttrykk øker når GLI1 ble overexpressed. Basert på disse resultatene, konkluderte vi med at GLI1, en transkripsjonsfaktor, kan regulere RegIV genuttrykk.
Identifikasjon av kandidat Gli1 bindingsseter i RegIV arrangøren
Den positive sammenhengen mellom GLI1 og RegIV i både PC vev og cellelinjer bedt oss om å søke på RegIV promoter for potensiell GLI1 bindingssteder til DNA konsensus sekvensen 5′-GACCACCCA-3 «[42]. Database-analyse viste fire mulige områder som ligger oppstrøms for transkripsjonsstartsetet (figur 6). Homologien av hvert GLI1 bindingssetet til den kanoniske konsensussekvensen varierte fra 67% (områder 1, 2, 3 og 5) til 78% (område 4), noe som antydet at RegIV genpromoteren kan bindes til GLI1.
(A) plassering av de potensielle GLI1 bindingsseter (sifre 1-5) i forhold til strukturen av genet. P representerer transkripsjonsstartsetet. Den grå ramme er den variable skjøting nettstedet. Blanke rammer representerer eksoner. (B) Plassering av bindingssteder på arrangøren i forhold til P transkripsjonen start området og sekvensen homologi til GLI1 konsensus bindende sekvens, GACCACCCA.
Bekreftelse på GLI1 proteinbundet til promoter-regionen RegIV genet ved CHIP
ultralydbehandlet kromatin løsning analysen viste at det totale DNA fragment dukket utflytende på 100 bp til en kb utvalg i 80 W gruppen (figur S4). Resultatet av DNA elektroforese viste spådd DNA bandet i INPUT, GLI1-Ab, og postive kontrollgrupper ved hjelp av menneskelig RegIV primer-D-F, og ikke i IgG og negative kontrollgruppene (figur 7). Bare INPUT og den positive kontroll viste det forutsagte båndet ved hjelp av human RegIV primer-A-C, G, men ikke i GLI-Ab, IgG, og negative grupper (data ikke vist). Resultatene av sekvensanalyse viste at sekvensene var de samme som for den RegIV genpromoteren fra stedet 4 (fig S5, S6, S7). Alle data antydet at GLI1 ble bundet til RegIV genet formidler av nettstedet 4 (GATCATCCA), og regulert RegIV i PC gjennom HH signalveien.
Lokaliseringen av RegIV primer-AG i promoter regionen RegIV genet . Tallene på skjematisk av RegIV genet (tall 1-5) tilsvarer de potensielle GLI1 bindingssteder. P representerer transkripsjonsstartsetet. Lysater fra PANC-1 celler ble underkastet immunoutfelling med anti Chromatin-GLI1 antistoff. Human RegIV primer-A-G ble anvendt for å amplifisere den RegIV promoter-regionen som inneholder den antatte GLI1-bindingssete. Ultralydbehandlet kromatin ble brukt som input DNA kontroll. IgG, RNA polymerase II, og β-aktin Ab ble anvendt som tilfeldige kontroller, positive kontroller og negative kontroller. (B) Kun INPUT, positiv kontroll, og GLI1-Ab viste det forutsagte bandet i etidiumbromid-farget agarosegel ved hjelp av CHIP-PCR-produktene som ble amplifisert ved RegIV primer-D (i), RegIV primer-E (ii), og RegIV primer-F (iii). Ingen påvisbar transkript ble observert i amplifisert mal IgG eller negativ-kontroll og en positiv kontroll kjørefelt bekrefter den forventede fragment. Molekylvekt standarder (Marker) ble brukt for å anslå størrelsen på de forsterkede band.
Bekreftelse på GLI1 bundet til RegIV arrangøren av EMSA
Som beskrevet ovenfor, GLI1 bindingssetet i promoterregionen av RegIV-genet ble bekreftet med Chip-PCR. Vi deretter brukt EMSA analyser for å direkte adresse om GLI1 binder RegIV
in vivo
. Vi syntetiserte spesifikke oligonukleotider som inneholder den GLI1 element som er tilstede i RegIV promoteren i EMSA eksperimenter med nukleære ekstrakter fra PANC-1-cellelinjer. Som vist i figur 8, inkubering av PANC-1-celler ekstrakter med den biotin-merkede GLI1-RegIV sekvens produsert et DNA-proteinbånd skift. Disse DNA-proteinkomplekser var spesifikk for GLI1 nettstedet ved vellykkede konkurranseanalyser med forskjellige folder av overskytende umerkede GLI1-RegIV og mutante merket GLI1-RegIV oligonukleotider. For å bekrefte bindingen av GLI1 til GLI1-RegIV sekvens, ble disse EMSA reaksjonene videre inkubert med anti-GLI1 antistoff. Som vist i figur 8, er tilsetningen av dette antistoff resulterte i en supershifted kompleks i tillegg til DNA-proteinbåndet. Disse dataene viste tilstedeværelse av GLI1 i atomproteinkompleks som binder GLI1 bindingssetet av RegIV promoter (-528~-520).
EMSA ble utført med kjernefysiske ekstrakter av PANC-1 celler (spor 2 til 7) eller uten nukleære ekstrakter (spor 1). Den RegIV sonde ble generert av annealing enkelt-strandet og slutt-merket oligonukleotider inneholder RegIV promoter-regionen (nukleotider -528-520). Konkurranse-forsøk ble utført ved anvendelse av 1-fold (spor 3), 10-fold (spor 4), og 100-fold (sporene 5) overskudd av umerkede oligonukleotider, henholdsvis (kolonnene 3 til 5) eller 100-ganger mutant merkede oligonukleotider (spor 6). For super-shift, anti-GLI1 antistoff (spor 7) ble inkubert med atom ekstrakter før de blir satt til reaksjonen.
Diskusjoner
I denne studien har vi bekreftet at GLI1 og RegIV ble overuttrykt i PC-vev og cellelinjer, bekreftet av andre rapporter [12], [20], [32]. Vi demonstrerte også en signifikant positiv korrelasjon mellom ekspresjonen av GLI1 og RegIV. RNA interferens og overekspresjon eksperimenter viste at RegIV uttrykk endret seg med GLI1 uttrykk i PC-cellelinjer; Dette ble bekreftet av CHIP og EMSA.
