Abstract
epitel-mesenchymale overgang (EMT) indusert av EGF fremmer livmorhalskreft progresjon; Men mekanismene bak EGF-indusert EMT fortsatt uklare. I denne studien, rapporterte vi at miR155 overekspresjon trykt EGF-indusert EMT, redusert migrasjon /invasjonskapasitet, hemmet celledeling og økt chemo-følsomhet for DDP i menneskelige Caski livmorhalskreftceller. Videre overekspresjon av miR155 økt TP53 uttrykk, men redusert SMAD2, og CCND1 uttrykk nivåer. Disse dataene antyder at miR155 regulerer negativt EGF-indusert EMT. Vi konkluderer med at miR155 ikke opptrer som et onkogen, men som en tumor suppressor i Caski celler
relasjon:. Lei C, Wang Y, Huang Y, Yu H, Huang Y, Wu L, et al. (2012) oppregulert miR155 Snur Epitelial-mesenchymale Transition indusert av EGF og Øker Chemo-følsomhet for Cisplatin i Human Caski livmorhalskreftceller. PLoS ONE 7 (12): e52310. doi: 10,1371 /journal.pone.0052310
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 08.08.2012; Godkjent: 16 november 2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Lei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte for dette arbeidet ble gitt av Science Foundation Natural i Hubei-provinsen (Grant ingen. 2011CDB181), Uavhengig forskningsfond, Wuhan University (nr. 201130302020016). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser exsit
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største klassen av ondartede svulster for kvinner, og det truer kvinners helse, spesielt i utviklingsland. Metastase og invasjon er de viktigste årsakene til dødsfall i livmorhalskrefttilfeller, og dermed er det viktig å avklare de molekylære mekanismene for disse fenomenene. Det har blitt rapportert at den epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) er en viktig prosess som er involvert i tumormetastase og invasjon [1]. Hovedtrekkene i EMT inkluderer oppløsningen av epitelceller tett veikryss, ombygging av cytoskjelettet, tap av apikal-basal polaritet, og oppkjøpet av mesenchymale markører, slik som N-cadherin og vimentin. EMT endows tumorceller med høyere invasive /metastatisk kapasiteter, stamcellelignende egenskaper, motstand mot apoptose, og immuntoleranse [2].
EGF (epithelial vekstfaktor) er en av de viktigste EMT regulatoriske faktorer som utløser EMT i en rekke solide tumorer, inkludert livmorhalskreft. Det har blitt rapportert at tumorer med høy EGF-reseptor-ekspresjon har dårlig klinisk prognose, og EGF-indusert EMT kan være en årsak til dette [3] – [5]. Således hindrer EGF-indusert EMT kan være en passende metode for å hemme invasjon og metastase.
Nylige studier har antydet at mirnas spiller en viktig rolle i reguleringen av EMT [6], [7]. mirnas er 18- til 25-nukleotid lange ikke-kodende RNA som kan regulere genuttrykket ved å akselerere nedbrytningen og hemmer oversettelse av målet mRNA. Blant de mirnas identifisert til nå, er miR155 assosiert med tumor spredning og er overuttrykt i mange humane tumorer [8]. En studie viste at unormal ekspresjon av miR155 var en tidlig begivenhet i bukspyttkjertelkreft og nært knyttet til en lav overlevelse [9]. I livmorkreft, ble forekomsten av EMT ledsages av forhøyet miR155 ekspresjonsnivåer [10]. Det er ennå ikke klart om miR155 er involvert med forekomst av EMT i livmorhalskreft. I denne studien bruker EGF som en EMT-induserende faktor i humane livmorhalskreftceller, vi utforsket de regulatoriske roller miR155 i EMT prosessen, celleproliferasjon, celle følsomhet for cellegifter, og evaluert den potensielle verdien av miR155 som molekylære mål for tidlig forebygging av livmorhalskreft invasjon og metastasering.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Caski celler ble kjøpt fra Cell Bank of China (Wuhan) og ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 i RPMI-1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 ug /ml streptomycin, og 100 enheter /ml penicillin.
RNA Isolation og miRNA Detection
RNA fra de dyrkede celler ble isolert med Trizol reagens (Invitrogen) og ble deretter anvendt for å syntetisere første kjede cDNA. Påvisning av de modne miRNAs ble utført med PCR der SYBR Premiks Ex Taq
TM (TAKARA). U6 ble anvendt som en intern kontroll. Primerne benyttet i dette eksperiment er vist i tabell S1.
Plasmid Konstruksjon og staller /transient Transfeksjon av miR155
A-fragment humant genomisk DNA på ca. 400 bp inneholdende miR155 sekvens ble klonet inn i pcDNA3.1-GFP vektor. Det resulterende plasmid pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 bærer en rekombinant DNA-sekvens for GFP og den miR155-holdige fragment. For å generere en cellelinje som stabilt uttrykker miR155 ble Caski celler transfektert med pcDNA3.1-GFP-miR155 hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Etter valget med G418, singelen klone som over-uttrykt miR155 ble identifisert. For miR155 transient overekspresjon, ble miR155 ligner (RIBOBRO) pleide å transfektere de Caski cellene.
In vitro
migrasjon og invasjon Analyser
En Matrigel basert transwell analysen ble brukt til analyse cellemigrering og invasjon
in vitro
som tidligere beskrevet [11]. For analyse av de invasive egenskaper, 2 x 10
4 celler ble sådd på toppen av Matrigel-belagte celledyrkningsinnsatser i 200 ul RPMI-1640 medium uten FBS og inkubert i 24 timer. Innsatsene ble deretter vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og fiksert i 4% paraformaldehyd. Etter å ha blitt farget med haematin ble invasive cellene telles under mikroskop. Migrasjonen Analysen ble utført ved den samme måte som beskrevet ovenfor, bortsett fra at Matrigel ikke var belagt inn i innsatsene.
Western blot (WB)
Total-protein ble ekstrahert fra celler ved bruk av cellelyseringsbuffer (0,5 % NP-40, 0,5% SDS, 1,5 mM Tris-HCl, pH 7,4, og 15 mM NaCl). Proteinprøver (20 ug /felt) ble underkastet elektroforese, overført til PVDF-membraner og inkubert over natten med primære antistoffer mot E-cadherin (SC-7870, Santa Cruz Biotechnology), N-cadherin (BA0637, BOOSTER), MMP1 (130-1- 16, RayBiotech), og Annexin A2 (A2485, Sigma). Membranene ble behandlet med geite-anti-kanin HRP-konjugert sekundært antistoff (Invitrogen). Måltallene proteinbånd ble bestemt ved hjelp av reagenser som er gitt i ECL + pluss kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).
Immuno fl uorescence Analyse
Immuno fl uorescence analyse ble brukt for å analysere uttrykket nivåer av E-cadherin med antistoffer mot E-cadherin (SC-7558, Santa Cruz Biotechnology), og ekspresjon av N-cadherin med antistoffer mot N-cadherin (BA0637, BOOSTER) som tidligere beskrevet [12].
Cell Proliferation Assay
Caski og caski-miR155 ble sådd på 96-brønners kulturplater og dyrket til 70% konfluens. Cellene ble behandlet med DDP (cis-diamminedichloroplatinum, DDP) i 0-3 dager i RPMI-1640 medium. Mediet i hver brønn ble fjernet, og 100 ul (metyl tiazolyl tetrazolium, MTT) oppløsning (0,25 g /l i RPMI-1640 medium) ble tilsatt. Etter inkubering ved 37 ° C i 4 timer ble mediet fjernet og 200 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Absorbans (A) ved 570 nm ble registrert. Cellen vekst og hemmer hastighet ble beregnet som følger:
flowcytometri
Caski og Caski-miR155 cellene ble høstet i logaritmisk vekstfase og fast over natten med 80% etanol. Cellene ble deretter vasket med kald PBS, farget med propidiumjodid (PI, 0,05 mg /ml) og RNase A (0,5 mg /ml). Strømningscytometri-analyse ble brukt for å bestemme fordelingen av celler i cellesyklus underfaser, og for å måle den apoptose indusert ved toppen DDP (10 umol /ml) i 24 timer.
Statistical Analysis
alle data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistisk analyse mellom gruppene ble vurdert av Student tosidige t-test og ANOVA. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
EGF induserer EMT i Caski Cells
Det har blitt rapportert at EGF reseptoren er sterkt forhøyet i livmorhalskreftceller, noe som tyder på at EGF eksponering kan indusere EMT i livmorhalsen cellelinjer [13], [14], [15]. I dette eksperimentet, Caski ble cellene dyrket i rutinemessige betingelser med eller uten EGF (50 ng /ml) i 1, 3 eller 5 dager, og EMT messige endringer ble bestemt. Den morfologiske forandring ble først visualisert i denne prosessen. Etter EGF-stimulering, Caski celler ble mer fusiforme og forbindelsen mellom cellene redusert (figur 1A). Når E-cadherin (E-CAD) ekspresjon ble analysert ved WB, resultatene er vist som EGF eksponering downregulated E-CAD ekspresjon sammenlignet med kontrollceller (figur 1B). Den tilsvarende nedregulering av E-cad ekspresjon ble bekreftet ved en IF-analyse hvor Caski celler ble behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dager (figur 1C). Samtidig punkt, vi også oppdaget at ekspresjonen av andre EMT-relaterte faktorer (N-cadherin, MMP1 og annexin A2) ved å WB og funnet at alle de tre faktorer ble oppregulert (figur 1D). Disse data indikerer at EGF kan indusere EMT i Caski cellene.
Caski-celler ble rutinemessig dyrket under betingelser med eller uten EGF (50 ng /ml) i 1 til 5 dager. A. De morfologiske endringer forårsaket av EGF ble observert ved mikroskopi. B. nedregulering av E-cadherin av EGF behandling ble bestemt ved western blot. Densitometrisk analyse av tre uavhengige tredoble Western blot. C. E-cadherin nedregulering som respons på EGF (50 ng /ml) behandling i 3 dager ble verifisert ved IF. D. oppregulering av N-cad, MMP1 og annexin A2 i EMT prosessen som etterforsket av western blot. Densitometrisk analyse av tre uavhengige tredoble Western blot. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt. * P 0,05, ** P. 0,01, sammenlignet med kontrollgruppen
miR155 er oppregulert i EGF-indusert EMT
Total RNA ble renset fra EGF-indusert mesenchymal- som Caski celler og normale Caski celler. Uttrykket nivåer av miR155 eller miR200c ble oppdaget ved å utføre real-time PCR på følgende totale RNA. Resultatene viste at i forhold til de normale Caski celler, ble miR155 sterkt oppregulert i de mesenkymale Caski celler, men ble ikke observert noen endring av ekspresjonsnivået for miR200c, som ble funnet å bli nedregulert i løpet av EMT prosessen i mange faste tumorer av andre studier [ ,,,0],16], [17] (figur 2).
A. De relative uttrykk nivåer av miR155 og miR200c ble oppdaget av real-time PCR. miR155 ble oppregulert med 3 dagers behandling EGF (50 ng /ml), og ingen forandring ble funnet i miR200c ekspresjonsnivået i henhold til EGF-stimulering. Den relative miR155 uttrykk forholdet i EGF behandling /kontroll er 12.21. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger. T-test ble benyttet for statistisk analyse; ** P 0,01. B. oppregulert miR155 Ekspresjonsnivået ble bekreftet ved revers-transkripsjon PCR. U6 ble anvendt som en intern kontroll, bane 1 og 2 er EGF behandling, spor 3 er negativ kontroll, 4 lane markør, felt 5 og 6 er kontroll (uten EGF).
overekspresjon av miR155 hemmer EMT
Selv om miR155 var sterkt oppregulert i EGF-indusert EMT prosess, er det mulig at dette er bare en kompenserende hendelse eller en uavhengig fenomen. For ytterligere å klargjøre hvilken rolle miRNA155 i EMT prosess, en Caski cellelinje med over-uttrykt miR155 (Caski-miR155) ble opprettet ved trans pcDNA3.1-GFP-miR155 plasmid inn i Caski celler, med miR155 uttrykk blir verifisert av real -time PCR (figur 3A). Ved hjelp av denne cellelinjen som en modell, har vi funnet at overekspresjon av miR155 hemmet cellevekst og blandet med cellesyklusen ved å redusere celle-forholdet i S-fase (17% i Caski kontrollceller, 5,4% i Caski-miR155) men økende cellen forholdet i G1 fase (63,7% i Caski kontrollceller, 81,4% i Caski-miR155), som vist i figur 3B. EGF-indusert nedregulering av E-cadherin uttrykk ble delvis reversert av forbigående transfekterte miR155 ligner (Figur 3C). Med miR155 overekspresjon, morfologien av cellene ble mer cuboidal. Etter 3 dager med behandling med EGF (50 ng /ml), ble bare en liten del av Caski-miR155 celler transformert til fusiforme celler (Figur 3D). Disse resultater indikerer at overekspresjon av miR155 inhiberte EGF-indusert EMT.
A. Etter pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 transfeksjon økte miR155 uttrykk nivå mer enn 12 ganger, men ble ikke observert noen signifikant forskjell for miR200c uttrykk. Forsøket ble gjentatt 3 ganger uavhengig av hverandre. ** P 0,01 sammenlignet med kontrollceller. B. Celleformering ble testet ved MTT. Resultatene viser at miR155 overekspresjon vesentlig hemmet celleveksthastigheten. P 0,05 sammenlignet med kontrollceller. Strømningscytometri ble anvendt for å teste effekten av miR155 overekspresjon på cellesyklusen. Resultatene viser en redusert celleforhold i S-fase (17% i Caski kontrollceller, 5,4% i Caski-miR155) men en økning i celle-forhold i G1 fase (63,7% i Caski kontrollceller, 81,4% i Caski-miR155). Forsøket ble gjentatt 3 ganger uavhengig av hverandre. P 0,01 sammenlignet med kontrollceller. C. E-cad uttrykk ble testet av western blot. E-cadherin uttrykk nivået ble sterkt redusert etter 3 dager med EGF (50 ng /ml) eksponering i Caski celler. Densitometrisk analyse av tre uavhengige tredoble Western blot. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt. * P 0,05. Denne effekten ble delvis forhindret ved transfeksjon med miR155 etterligner. D. De morfologiske endringer forårsaket av miR155 overekspresjon. Caski-miR155 celler er mer kubiske enn normalt Caski celler. Når behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dager, ble bare en liten brøkdel av Caski-miR155 celler transformert inn i fusiform-lignende celler.
TP53 og SMAD2 har vært knyttet til EMT regulatorisk vei [18], [19]. Ved screening Targetscan (https://www.targetscan.org), ble TCF4, CCND1 og SMAD2 spådd til å bli målet gener miR155. Således, undersøkte vi TP53, SMAD2, TCF4, CMYC og CCND1 mRNA-ekspresjonsnivåer i Caski celler behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dager med eller uten transfeksjon av miR155 etterligner (figur 4). Resultatene viste at TP53 ble nedregulert i den EGF-induserte EMT prosess og oppregulert ved miR155 overekspresjon, men TP53 ekspresjon indusert av miR155 ble grundig reversert av EGF behandling. miR155 overekspresjon redusert SMAD2 uttrykk. Selv TCF4 ble bekreftet som en miR155 mål protein av en annen gruppe [20], ingen statistisk signifikante endringer ble observert i våre eksperimenter for TCF4 mRNA uttrykk i EGF-indusert og miR155 Mimic transfektert celler. I tillegg ble det ikke observert endringer for CMYC, som er et nedstrøms mål av og reguleres av TCF4. CCND1 (en cellesyklus regulatorisk protein og en annen nedstrøms målet for TCF4) mRNA uttrykk nivået ble nedregulert av miR155 overekspresjon og kan delvis reverseres ved EGF behandling. Dermed antok vi at miR155 reverseres EGF-indusert EMT ved oppregulering TP53, downregulating SMAD2 uttrykk nivåer, og besøksforbud cellevekst ved å hemme CCND1 uttrykk.
A. Forut miR155-bindingsseter i 3’UTR av SMAD2, TCF4 og CCND1 mRNA. B. TP53, SMAD2, TCF4, CMYC og CCND1 mRNA-ekspresjonsnivåene ble analysert ved sanntids-PCR i Caski celler behandlet med EGF (50 ng /ml) i 3 dager, med eller uten transfeksjon av miR155 etterligner. TP53 ble nedregulert av EGF behandling, men signifikant oppregulert ved miR155 overekspresjon. Denne økte TP53 uttrykket ble reversert av EGF behandling. SMAD2 ble nedregulert av både EGF behandling og miR155 overekspresjon. Behandling miR155-overekspresjon celler med EGF resulterte i en ytterligere nedgang på SMAD2. Det ble ikke observert signifikante endringer i TCF4 eller CMYC mRNA mellom EGF-behandlede og miR155 mimikk-transfekterte celler. CCND1 mRNA uttrykk ble nedregulert av miR155 overekspresjon, og dette downregulation ble delvis reversert av EGF behandling.
overekspresjon av miR155 hemmer migrasjon og invasjon evnene til Caski Cells
For å belyse effekter av miR155 om migrasjon og invasjon i Caski celler
in vitro
, transwell invasjon /migrasjonsanalyser ble utført (figur 5). Caski-miR155 og normale Caski celler ble sådd i innleggene. Etter 24 timer ble antallet av celler som var overført til den nedre side av membranen beregnet til å kvantifisere invasjon og migrasjons kapasiteter. Antall celler som passerte gjennom membranen var betydelig lavere i Caski-miR155 celler enn i de normale Caski celler. Dermed antok vi at miR155 hindrer invasive og migrasjon evner i Caski celler
in vitro
.
Caski-miR155 og Caski celler ble sådd i Transwell innsatser med eller uten Matrigel. Innleggene ble fiksert og farget etter 24 timer, og deretter trekk /invaderende celler ble talt under et mikroskop. Antallet Caski-miR155-celler som passerer gjennom membranen var signifikant lavere enn i de normale Caski celler, enten detektert av migrasjons eller invasjon analyser. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt. * P. 0,05
miR155 Økt Chemo-følsomheten Caski Cells å DDP
MTT metoden ble brukt til å påvise effekten av miR155 overekspresjon på cellegift-følsomheten Caski celler til DDP. Resultatene indikerte at inhiberingen frekvensen av Caski-miR155 ved behandling med DDP var mye høyere enn for de normale Caski cellene på en doseavhengig måte. Formeringshastigheten av Caski-miR155 celler som behandles med DDP var mye lavere enn for de normale Caski celler i en tidsavhengig måte (figur 6 A, B). Behandling med DDP (10 umol /l) i 24 timer resulterte i en mye høyere apoptotisk celle-forholdet i de Caski-miR155 celler enn i de normale Caski celler (figur 6C). Ekspresjonsnivået av annexin A2, et protein involvert i apoptose motstand, ble bestemt ved WB. Resultatene viste ikke at annexin A2 ble nedregulert av miR155 overekspresjon (figur 6D).
A. Caski og Caski-miR155 celler ble behandlet med forskjellige doser av DDP i 24 timer, og graden av inhibering ble evaluert av et MTT-assay. Mean ± SD, n = 4, P 0,05 av ANOVA. B. Celleproliferering ble evaluert med en MTT analyse. Caski og Caski-miR155-celler ble behandlet med DDP (10 umol /L) i 0-3 dager. Mean ± SD, n = 4, P 0,05 av ANOVA. C. Mikroskopi ble benyttet for å observere apoptose av Caski og Caski-miR155 celler indusert med DDP (10 umol /L) i 1 dag. Cellene ble høstet, og FCM ble anvendt for å bestemme apoptose. Pilene indikerer plasseringen av apoptose topp. D. Annexin A2 ble bestemt ved western blot. Den Annexin A2 uttrykket ble ikke regulert av miR155 overekspresjon og kan bli oppregulert ved EGF behandling. Densitometrisk analyse av tre uavhengige tre eksemplarer Western blots.P 0,05, miR155- forhold til miR155 +, * P 0,05, EGF- forhold til EGF +
Diskusjoner
EMT er en. dynamisk prosess som kan reguleres og reversert av mange faktorer, inkludert miRNAs. I denne studien brukte vi den menneskelige Caski livmorhalskreft cellelinje som modell for å undersøke hvilken rolle miR155 i EGF-indusert EMT og prøvde å svare på spørsmålet om hvorvidt miR155 regulerer EMT og har en rolle i metastase og chemo-følsomhet.
Vi først brukt EGF å indusere EMT i Caski celler, som ble bekreftet av E-cadherin, N-cadherin, uttrykk og celle morfologi. Den miR155 Ekspresjonsnivået ble bestemt ved RT-PCR. En 12-gangers økning av miR155 ekspresjon nivået ble observert etter EGF-behandling, men ingen forandring ble funnet for miR200c, som hadde blitt rapportert å bli nedregulert i bukspyttkjertelkreft og andre faste tumorer [16], [17]. Dermed har vi konkludert med at miR155, men ikke miR200c, er involvert i EGF-indusert EMT i Caski celler. Lignende data publisert av en annen gruppe indikerer også at miR155 er oppregulert i EMT observert i livmor carcinosarcoma [10].
For å belyse hvilken rolle miR155 i EMT, Caski cellelinjer overekspresjon miR155 overekspresjon ble konstruert av stabile og forbigående trans . Interessant, avvikende overekspresjon av miR155 dramatisk hemmet celledeling, hemmet migrasjon /invasjon, og fremmet chemo-følsomheten Caski celler til DDP
in vitro
. Samtidig, har vi funnet at cellene som overuttrykker miR155 ble mer kubisk, og bare en liten del av cellene var transformert inn fusiform celler etter 3 dager av EGF behandling. Den nedregulering av E-cadherin forårsaket av EGF behandling ble også delvis reversert ved miR155 etterligner i Caski cellene.
Tidligere undersøkelser har antydet at MIR-155 var en onko-MIR og at den overuttrykkes i en rekke humane maligniteter , inklusive B-cellelymfom og karsinomer i bryst, tykktarm, lunge, eggstokk og [8], [9]. Det har blitt rapportert at MIR-155 trykt P53-induced kjernefysiske protein 1 (TP53NP1) og førte til bukspyttkjertelen svulst utvikling [21]. I brystkreft, miR155 forbedret JAK2 /STATISTIKK signalveien og transfeksjon av miR155 ligner fremmet MDA-MB-231 og MCF-7 celleproliferasjon [22]. Våre data tyder imidlertid på at miR155 overekspresjon inhiberer celleproliferasjon i Caski celler og hindrer EMT. Lignende holdning på miR155 funksjon ble godkjent av en annen gruppe [20], viste de at miR155 forhindret EMT ved å redusere TCF-fire uttrykk nivået i 4T1 brysttumorceller.
For å belyse den eksakte mekanismen for miR155 i celleproliferasjon og EMT i Caski celler, vi analysert uttrykket nivåer av visse faktorer som er relatert til cellevekst og EMT (figur 7). Resultatene viste at TP53 uttrykk ble oppregulert ved miR155 overekspresjon og nedregulert av EGF. Interessant, EGF-indusert E-cadherin downregulation ble grundig reversert ved transfeksjon med miR155 etterligner. Fersk studie antydet at vill TP53 kontrollert effektiviteten der mammary epitelceller gjennomgå EMT i respons til TGFB [23]. Dermed har vi ment miR155 reverseres EMT gjennom upregulating TP53 uttrykk.
SMAD2 signalveien er involvert i reguleringen av spredning, differensiering, apoptose og EMT [23]. I denne studien fant vi at med miR155 overekspresjon, ble SMAD2 uttrykk nedregulert. Fordi det er to miR155 bindingssteder innenfor 3’UTR av SMAD2 mRNA, foreslår vi at miR155 regulerer negativt EMT gjennom hemming av Smad2 uttrykk.
Våre resultater indikerer at miR155 trykt migrasjons og invasjons evner Caski celler
i
vitro
. Et lignende resultat har blitt rapportert hos en annen studie med 4T1 brysttumorceller, hvori miR155 ble funnet å undertrykke direkte ekspresjon av TCF4 og negativt regulere EMT [20]. I vår studie ble det ikke observert noen statistisk signifikante endringer i TCF4 uttrykk nivå i Caski celler behandlet med eller uten EGF og miR155 etterligner. Fersk studie antydet at CCND1 økte vandrende evne og årsaken EMT i brystkreft [24]. CMYC og CCND1 er nedstrøms gener reguleres av TCF4 transkripsjonsfaktor. I motsetning CMYC, er det en miR155-bindingssete i CCND1 3’UTR. I samsvar med dette funnet, miR155 overekspresjon åpenbart downregulated CCND1 nivå, men hadde ingen effekt på CMYC uttrykk. Denne oppdagelse indikerte at, i tillegg til den TCF4 vei, CCND1 kan også oppnås direkte regulert av miR155.
Annexin A2 ble ansett for å være en potensiell faktor for regulering av cellevekst, invasjon og kjemoterapi-motstand [25 ]. Våre data viser at EGF behandling fører til en økning i Annexin A2 uttrykk. Og det er ingen endring i Annexin A2 til uttrykk under miR155 overekspresjon. Videre studier er nødvendig for å avklare mekanismen av Annexin A2 regulering av EGF.
I sammendraget, vi har vist at i Caski celler, gjorde miR155 ikke opptre som en onkogen, men som en tumor suppressor. miR155 negativt regulert EGF-indusert EMT, redusert spredning, hemmet migrasjon /invasjon og økt chemo-følsomhet i Caski celler in vitro. I EGF-indusert EMT er oppregulering av miR155 en hendelse som cellene kan kompensere for. Vår studie viser en ny side ved miR155 og sine roller i tumor spredning og metastase i livmorhalskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Grunning for Real-time PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0052310.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Dr. Changbai Liu og Zhaoqi Liu for deres tekniske råd og teknisk bistand utføre real-time PCR. Vi takker også Ma Jielan for hennes assistanse i å utføre plasmid transfections og gi GFP DNA fragment. Vi takker de ansatte ved Institutt for molekylær biologi of Three Gorges University.
