Abstract
Bakgrunn
Apolipoprotein A-II (ApoA- II) blir nedregulert i sera av pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC) pasienter, noe som kan skyldes øke utnyttelsen av high density lipoprotein (HDL) lipid med kreft i bukspyttkjertelen vev. Denne studien undersøkte påvirkning av eksogene ApoA-II på lipid opptak og cellevekst i bukspyttkjertelkreft (PC) begge
in vitro Hotell og
in vivo
.
Metoder
Cryo transmisjonselektronmikroskopi (TEM) undersøkte ApoA-II innflytelse på morfologien til SMOFLipid emulsjon. Påvirkningen av ApoA-II på proliferasjon av cancercellelinjer ble bestemt ved å inkubere dem med lipid +/- ApoA-II og anti-SR-B1-antistoff. Lipid ble merket med fluorophore, gjorde, for å spore lipid opptak av kreftceller
in vitro
av konfokal mikroskopi og
in vivo
i PDAC pasient avledet xenografttumorer (PDXT) av fluorescens bildebehandling. Scavenger reseptor klasse B type-1 (SR-B1) uttrykk i PDAC cellelinjer og i PDAC PDXT ble målt ved Western blotting og immunhistokjemi, henholdsvis.
Resultater
ApoA-II spontant omgjort lipid emulsjon inn i meget små unilamellære vesikler som rHDL (rHDL /A-II) og forbedret lipid-opptaks i PANC-1, CFPAC-1 og primær tumorceller, som vist ved konfokal mikroskopi. SR-B1 ekspresjon var 13,2, 10,6, 3,1 og 2,3 ganger høyere i PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 cellelinjer enn normalbukspyttkjertelcellelinje (HPDE6) og 3,7 ganger større i PDAC vev enn i normal pankreas . ApoA-II pluss lipid betydelig økt opptak av merket lipid og fremmet cellevekst i PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 celler som ble inhibert av anti SR-B1-antistoff. Videre økte ApoA-II opptak av lipid i xenografter med 3,4 ganger.
Konklusjon
Våre data tyder på at ApoA-II forbedre målretting potensialet av lipid i kreft i bukspyttkjertelen som kan ha bildebehandling og narkotika levering muligheter
Citation:. Julovi SM, Xue A, Thanh LE TN, Gill AJ, Bulanadi JC, Patel M, et al. (2016) Apolipoprotein A-II Plus Lipidemulsjonen Forbedre cellevekst via SR-B1 og Target bukspyttkjertelkreft
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 11 (3): e0151475. doi: 10,1371 /journal.pone.0151475
Redaktør: Yingmei Feng, Beijing Key Laboratory of Diabetes Prevention and Research, KINA
mottatt: 3. september 2015. Godkjent: 29 februar 2016; Publisert: 22 mars 2016
Copyright: © 2016 Julovi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering: en del av denne studien ble presentert og tildelt som beste poster på New Horizons 2014 og Scientific Research forsamlingen, 17 til 19 november, har ikke 2014. denne studien blitt publisert andre steder eller ikke er under vurdering for en publikasjon. Studien ble støttet av CanSur fundament og dels av Ramsay Forskning Undervisning fondet, men ikke har noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Kommersiell tilknytning av forfatterne på CSIRO ikke spille noen rolle i studien, og ikke har noen konkurrerende interesser knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling og markedsført produkter
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har ingen interessekonflikt. Kommersiell tilknytning av forfatterne på CSIRO ikke spille noen rolle i studien, og ikke har noen konkurrerende interesser knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling og markedsført produkter.
Innledning
serum apolipoprotein A-II (ApoA-II) ble funnet å være trykket inn i bukspyttkjertelcancerpasienter og var en potensiell diagnostisk biomarkør [1]. Dette arbeidet har blitt bekreftet av Honda og kolleger [2] og andre [3]. ApoA-II er en komponent av high density lipoprotein (HDL), hvor den har en viktig rolle i å styre skjebnen til metabolismen av lipidet i HDL. Den viktigste rolle for HDL er levering av kolesterol fra perifere vev til leveren hvor det metaboliseres til gallesalter eller utskilles i gallen. Den scavenger reseptor klasse B type-1 (SR-B1) er utbredt i hepatocytter og tiltrekker HDL hvor lipid er endocytose [4, 5] eller diffust [6, 7] i hepatocytter.
SR-B1 er en multi-ligand reseptor og sterkt uttrykt i en rekke forskjellige tumorceller, inkludert prostata, bryst, kolorektal og eggstokkreft celler [8]. Den lipoprotein på overflaten av HDL bindes til SR-B1and leverer sin lipid inn i cellen gjennom en pore dannet av SR-B1 øke opptak av HDL-kolesterylester (CE) [9], et essensielt næringsstoff for ondartet celle proliferasjon og metastase [10, 11]. Tretti prosent av HDL er forbundet med ApoA-II, som antas å gjøre det HDL mindre enn den med ApoA-I alene, og gjør det HDL /ApoA-II mindre tiltrukket til den hepatiske SR-B1 [12]. I tillegg, ApoA-II opprettholder HDL nivåer delvis av inhibisjon av hepatisk lipase [13]. Dette resulterer i en forholdsvis lengre halveringstid i sirkulasjonen for HDL /ApoA-II. ApoA-II automatisk korrigerer binding av HDL til SR-B1 på forskjellige vev, og er spesielt tiltrukket av steroidogenic vev [14] hvor kolesterol blir anvendt for hormonsyntese, men raskt voksende kreftceller krever kolesterol også for cellemembraner [15]. Kreftceller har en økt ekspresjon av SR-B1in forhold til uttrykk på deres ikke-maligne celler av opprinnelse [16, 17] og det er mulig at dette resulterer i øket opptak av HDL av kreftvev, som er en forklaring på reduksjonen i serum ApoA-II i PDAC tilfeller [1-3]. Interessant kreft i bukspyttkjertelen ikke akkumuleres fludeoxyglucose (FDG) sterkt nok til å være pålitelig som et kontrastmiddel for emisjontomografi (PET) [18] som sannsynligvis indikerer at bukspyttkjertelkreft har en preferanse for lipid som hoved kalori kilde [19]. Hvis lipid er den viktigste kilden til energi for kreft i bukspyttkjertelen vev er det mulig at HDL er en viktig kilde til denne lipid. Energi metabolisme av cellene som er involvert i komplekset karsinogenese [20, 21]. Rollen til kolesterolmetabolisme i ferd med å carcinogenesen er også rapportert [22-24] .Cancer og andre raskt prolifererende celler krever kolesterol og andre membrankomponenter for å optimalisere veksten [25]. HDL har vært implisert i kolesterol levering i visse maligniteter, inkludert brystkreft [26], eggstokk-kreft [8], adrenokortikale tumorer [27] og prostatakreft [28]. Det er sannsynlig at kreft i bukspyttkjertelen er også ivrig utilsing HDL.
Hypotesen testes i denne artikkelen er at ApoA-II vil fremskynde opptaket av fett til kreft i bukspyttkjertelen vev og vil dermed øke cellevekst. Videre hypoteser vi at nivået av ekspresjonen av SR-B1 korrelerer med opptaket av lipid med kreft i bukspyttkjertelen celler og vil være større enn den for normalt vev.
Materialer og metoder
Cell kultur
PANC-en, MIAPaCa-2, BxPC3 og CFPAC-1 bukspyttkjertelkreft cellelinjer var gaver fra professor Barry Allen (St George Hospital, NSW, Australia), og normal menneskelig bukspyttkjertel ductal epitel (HPDE6) celler [29] var fra Dr. Chris Scarlett (School of Environmental Life Sciences, University of Newcastle, NSW, Australia). A549 kreft celle lunge linje, T47D og MCF7 brystkreftcellelinjer ble vennlig levert av professor Ross Davey (Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, NSW, Australia). PC3 prostatakreft cellelinje ble vennlig levert av Prof. Qihan Dong (Central Clinical School, Bosch institutt, Universitetet i Sydney, NSW, Australia). Bortsett HPDE6 cellelinje, ble alle cellelinjer kjøpt fra ATCC. Cellelinjer ble skrevet av kort tandem repeat profilering og de dannet til ATCC referansestandarder (CellBank, Westmead, NSW, Australia). BxPC3, CFPAC-1, A549, T47D og MCF7 cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640, PANC-1 og MIAPaCa-2 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og PC3 prostata-celler ble dyrket i F-12K (Gibco, BRL) med 10% FBS inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; ICN, Aurora, OH, USA) i 75 cm
2 kolber ved 37 ° C i en fuktig 5% CO
2 atmosfære. HPDE6 celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt (KSF) medium supplert av epidermal vekstfaktor og bovint hypofyse-ekstrakt (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).
primær kultur
Humant pankreas vevsprøver ble oppnådd ved Royal North Shore Hospital (Sydney, Australia), med sin informert skriftlig samtykke, følgende protokoller godkjent av Nord Sydney Local Health District Menneskelig forskningsetiske komité (NSLHD HREC) (Protocol nummer~~POS=HEADCOMP: 0909-227M, Sydney , Australia). Primær tumorcellekulturer ble etablert ved eksplantat vekst av små fragmenter (≈1 mm) dissekert fra PDAC tumorvev, som er lagt inn i DMEM (pH 7,4) supplementert med 10% varme-inaktivert FBS med 50 enheter /ml penicillin /streptomycin. Kulturer ble brukt etter passasje 3 for å unngå gjenværende forurensning av makrofager [30]. Alle kulturer ble samlet under identiske vekst og serum forhold. Vi brukte 24 timer serum sultet celler for eksperimenter for å unngå tidlig genuttrykk indusert av serum.
Merking av SMOF lipid med fluorophore VISSTe
SMOF Lipidemulsjonen som inneholder soyaolje, medium chain triglyserid, olivenolje og fiskeolje {www.tga.gov.au/pdf/auspar/auspar-smoflipid.pdf}, og brukes for intravenøs ernæring, ble anvendt i våre forsøk etter merking med en 0,05% lipofil tracer fluoroforen, gjorde (DiD307, Invitrogen, Carlsbad, California). Den SMOF lipidemulsjon ble tørket under en rotasjonsfordamper, fryse-tørket før blanding godt med VISSTe lipid i en etanolisk oppløsning. Etanolen ble til slutt inndampet, og den gjenværende lipidfilmen ble rehydratisert ved tilsetning av sterilt Baxter vann for å gi den endelige konsentrasjon til 20% SMOFlipid, etterfulgt av harde virvling og 30 minutter ultrasonisk bad homogenisering.
Samling og rensing av ApoA -II
ApoA-II ble renset som beskrevet i tidligere studier [31-33]. HDL ble isolert fra ultracentrifugally sammenslåtte prøver av normalt humant plasma (1,063 d 1,21 g /ml) og delipidert. Den resulterende apoHDL ble underkastet kromatografi på en Q-Speharose Fast Flow-kolonne koblet til et Akta FPLC-system (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buck, UK). Fraksjoner inneholdende ApoA-II ble slått sammen og renhet ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE og farging Coommassie, som avslørte et enkelt bånd. De samlede prøver ble lyofilisert, rekonstituert med 3 M guanidinhydroklorid /10 mM Tris /0,01% (vekt /volum) EDTA-Na
2, og dialysert inn i endotoksin-fri PBS før bruk.
Cell proliferasjonsanalyse
Celleproliferasjon ble utført i forskjellige cellelinjer og kvantifiseres ved krystallfiolett analyse som beskrevet i tidligere [34], hvor MTT-analysen er ikke egnet i lipid-behandlede celler [35]. 4 x 10
4 celler /ml celler ble sådd på nittiseks brønners mikroplater, for alle cellelinjer med unntak av PANC-1 og MIAPaCa-2 hvor 2×10
4 celler /ml ble sådd til et sluttvolum på 200 ul. Serum-frie celler ble behandlet med eller uten SMOFlipid (lipid) alene, ApoA-II og alene eller i kombinasjon i forskjellige konsentrasjoner og inkubert i 24 timer, 48 timer og 72 timer. For å teste effekten av SR-B1, ble celler forbehandlet med anti SR-B1 (2,5 ug /ml) i 2 timer og vasket med media 3 ganger i 5 minutter hver. Deretter ble cellene behandlet med eller uten lipid pluss ApoA-II i 48 timer. Kulturmediet ble fjernet og farget med 1 pg /ml krystall-fiolett (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) oppløst i 25% metanol (v /v) og 75% destillert vann (v /v). Bundet krystallfiolett ble solubilisert med 0,1% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) i fosfatbufret saltvann (PBS). Den optiske tetthet i hver brønn ble bestemt ved bølgelengde 550 nm. Resultatene ble uttrykt som relativ til kontroll. Vi fant at 1:30 fortynning av lipid og 50 ug /ml av ApoA-II var de optimale konsentrasjoner etter 48 timer, og denne tilstanden ble anvendt i den etterfølgende undersøkelsen.
Immunoblotting
immunoblotanalyse ble utført som beskrevet tidligere [1]. I korthet, 4 x 10
5 celler av hver cellelinjer utsådd i 6-brønners plater og celler ble dyrket inntil sammenflytende. Like mengder av proteiner ble separert ved 10% SDS-PAGE under reduserende betingelser og overført til en membran polyvinylidendifluorid. Det primære antistoff som ble benyttet var kanin anti-SR-B1 (Novus Biologicals, Littleton, USA). Immunoreaktivitets ble oppdaget med elektrokjemiluminescens deteksjonssystemet (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Anti-human β-actin antistoff ble tatt med for å normalisere mot ulik belastning.
Konfokalmikroskopi
Opptaket av SMOFlipid merket med DID ble undersøkt av Konfokalmikroskopi. I korthet, 1×10
5-celler /brønn ble sådd ut på 8 brønners kulturglass (Falcon BD, BD Bioscience) for over natten og ble behandlet med lipid som er merket med VISSTe fargestoff på 1:30 fortynning med eller uten ApoA-II i 48 timer. I noen forsøk cellene ble pre-inkubert med the1: 40, 1:30 og 1:10 fortynninger av umerket SMOFlipid og anti SR-B1 på (2,5 ug /ml) i 2 timer, vasket med serumfritt medium og inkubert med det lipid pluss ApoA-II for 48t. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd (Univar, Redmond, WA, USA), permeabilised med 0,3% Tween 20 (Sigma Aldrich, Castle Hills, NSW, Australia) og inkubert med eller uten primært antistoff, geite-anti-humant ApoA-II ( Abcam, Abcam Inc., MA, USA) for 2 timer og deretter inkubert med grønn flurophore konjugert isotypematchende sekundært antistoff (AlexaFlour
a488 esel anti geit IgG (H + L) (Invitrogen, Carlsbad, California) for en annen en time ved romtemperatur. Celler ble montert med glyserol media med DAPI (Invitrogen, Carlsbad, California) og cellulært opptak ble undersøkt under Leica konfokalmikroskopi (Leica, Tokyo, Japan).
For levende celle bildebehandling, 1×10
5 celler /brønn ble sådd på μ- Slide 4 vel ibi Treat Mikros Chamber (ibidi GmbH, Martinsried, Tyskland) for natten og behandlet med lipid merket med DID fargestoff på 1:20 og 1:10 fortynning med eller uten ApoA- II i 24 timer. Cellular opptaket ble undersøkt under Leica konfokalmikroskopi (Leica, Tokyo, Japan). Lipid opptak intensiteten ble kvantifisert ved Leica Micro LAS AF (GmbH, Mannheim, Tyskland) og resultatene ble uttrykt som relativ intensitet.
Cryo transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
A laboratorie-innefuktighetskontrollert forglassing system ble anvendt for å fremstille prøver for Cryo-TEM. Fuktighet ble holdt nær 80% for alle eksperimenter og omgivelsestemperaturen var ~22 ° C. En 4 ul alikvot av prøven ble pipettert på en 300 mesh kobbergitter belagt med Lacy formvar-karbon film (Pro-SciTech, Thuringowa, Queensland). Etter 30 s adsorpsjon periode ble gitter blottet manuelt ved hjelp av Whatman 541 filterpapir, for mellom 2 og 10 sek. Rutenettet ble deretter kastet ut i flytende etan nedkjølt av flytende nitrogen. Frosne gittere ble lagret i flytende nitrogen inntil undersøkt. Prøvene ble undersøkt ved hjelp av en Gatan 626 cryoholder (Gatan, Pleasanton, CA, USA) og en Tecnai 12 transmisjonselektronmikroskop (FEI, Eindhoven, Nederland) med en driftsspenning på 120 kV, som er utstyrt med en FEI Eagle 4k x 4k CCD (FEI, Eindhoven, Nederland). Prøvene ble sett på 100 000-150 000 ganger forstørrelse.
Gel elektroforese
En vandig 0,5% m /m agarosegel ble utarbeidet og midt i en × TBE (Tris-borat-EDTA buffer , fremstilt ved fortynning av 10 x stamløsninger, pH 9) buffer [36, 37], drives i en horisontal elektroforese system (Mini Sub Cell-GT, Biorad, elektrodeavstand 15 cm) i 45 minutter ved 90 V. Gel bildene ble tatt med en Carestream MI ved bølgelengde på 650 nm eksitasjon og 700 nm emisjon.
ApoA-II pluss lipid ble rekonstituert ved inkubering av 2 ul ApoA-II (2 mg /ml) og 2 ul av merket SMOFlipid (10 mg /ml) ved 37 ° C i 24 timer. Før lasting av gelen med prøven, ble hver prøve fortynnet til 1: 5 i PBS (pH 7,4) og tilsatt 2 ul 6X lasting fargeløsning (# R0611, Fermentas, Life Science) inneholder 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,03% bromfenolblått, 0,03% xylencyanol FF, 60% glycerol 60 mM EDTA-buffer. 12 ul av prøven ble anbragt i hver brønn av gelen. Alle forsøkene ble utført ved romtemperatur.
generasjon av PDAC pasient avledet tumor xenograft (PDTX) i ikke-overvektige diabetikere /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus
Alle dyreforsøk dannet retningslinjene i den nordlige Sydney Local Health District (NSLHD) Animal etiske komité i denne studien, og holder til i Kearns anlegget, Kolling Institute of Medical Research, University of Sydney. Protokollen ble godkjent av NSLHD Animal etisk komité (Protocol nummer 1011-015A). Alle operasjoner ble utført under bedøvelse ved hjelp av isofluran med NO
2 og oksygen (2: 1), og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Vi har etablert PDTX modell som beskrevet av Wong MH og Xue A et al. [38, 39] under protokollen NSLHD HREC- 0909-227M. Kort, mannlig NOD /SCID mus, i alderen 6 til 8 uker, ble bedøvet ved hjelp isoflourane med NO
2 og oksygen (2: 1). Små biter av pasientens friske tumorvev ble xenopodet under subrenal kapsel (SRC) på en mus. På åtte uker etter xenograft, ble mus brukt for å undersøke
in vivo
lipid uptake.
Dyrene som bærer de første generasjons xenografter (F1) ble randomisert og fordelt i tre grupper (a) kjøretøy (saltvann); (B) lipid (c) lipid pluss ApoA-II og injisert via halevenen. For å homogenisere tumorvolumer noen av F1 tumorene var passasje inn i annen gruppe mus (F2) og deretter passasje til F3. Dyret peiling F3 generasjonen av xenografttumorer ble brukt for valideringsstudie. Lipid opptak ble målt ved ulike tidspunkt av Carestream Molecular Imaging (MI) (Carestream Molecular Imaging, USA). Ved slutten av hvert eksperiment organer og svulster ble høstet og analysert ytterligere.
In vivo bildeanalyse
For in vivo optisk avbildning, tumor-bærende mus ble injisert med DiD307 merket lipid med eller uten Apo-AII ved halevenen injeksjon. Imaging ble utført umiddelbart etter injeksjon, ved 4 timer, 24 timer, 48 timer og 96 timer etter in-vivo-Carestream MI Imaging System. Musene ble avlivet ved 48 timer etter injeksjon, nyre med tumoren, lever, milt, bukspyttkjertel, lunge, hjerne og muskel ble høstet og analysert ved Carestream MI ved bølgelengde på 650 nm eksitasjon og 700 nm emisjon.
Histologi og immunhistokjemi
Vevsprøver ble fiksert i 10% fosfat bufret formalin og innstøpt i parafin. Formalinfiksert, parafininnebygde seksjoner ble kuttet med 4 mikrometer tykke seksjoner og farget med Mayers hematoksylin og eosin (H E). For immunhistokjemi ble snittene inkubert med anti-ApoA-II (# ab 54796, Abcam, Abcam Inc., MA, USA) (1 i 4000), anti-SR-B1 (#NB 400-104, Novus Biologicals, Littleton, USA) (1 i 4000) og isotype-matchet IgG-antistoffer. Immundeteksjon ble gjort ved hjelp av Dako Envision + System-HRP merket polymer Detection kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll og kontra med Mayers hematoksylin og Scotts bluing løsning. Etter montering, ble seksjonene observert under et lysmikroskop (ECLIPSE 80i, Nikon, Tokyo, Japan).
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.). Den statistiske signifikans av gruppe forskjeller ble analysert ved hjelp av paret
t
-test og analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni post hoc test (om nødvendig). Statistisk signifikans ble akseptert på
p
0,05 nivå.
Resultatene
ApoA-II effekt på SMOF lipidemulsjon
Når ApoA-II ble tilsatt til den ugjennomsiktige lipidemulsjon, en faseovergang oppstått, og den emulgerte ugjennomsiktig løsningen transformert til en gjennomsiktig klar væske i løpet av mindre enn én time (S1 fig). Cryo TEM-bilder av SMOF lipid pluss ApoA-II viste at de emulgerte partiklene omdannet til unilaminar vesikler (fig 1B). Mer interessant er den lille størrelsen av disse strukturene, hvorav mange var 10-50 nm i diameter, mye mindre enn de opprinnelige partikler i emulsjonen. Denne morfologisk endring i struktur og størrelse er mest sannsynlig på grunn av samspillet og integrering av ApoA-AII innenfor de lipid-selv-sammenstillinger, og transformasjonen til en gjennomsiktig oppløsning inneholdende for det meste små unilamellære vesikler, som demonstrert ved Cryo-TEM (Fig 1A og 1B).
Cryo-TEM mikroskopibilde av den SMOFlipid emulsjonen uten ApoA-II (A) og etter tilsetning av ApoA-II (B). Legg merke til den bi-lags struktur av lipidet overflaten av nanopartikkelen lignende strukturer i nærvær av ApoA-II (sorte piler). (C) Spectral flourescence farge fotografi av en 0,5% agarosegel løpe i 45 minutter ved 90 V i 1 x TBE-buffer. SMOFlipid merket med DID ikke vandrer gjennom brønnen, men rekonstituert merket SMOFlipid med ApoA-II migrerte som et band.
Gel elektroforese viste at rekonstituert ApoA-II pluss lipidkomplekser migrert gjennom gelen som et band mens lipid alene fortsatt oppholdt seg i brønnen (figur 1C), som tyder på at ApoA-II forandret lipidemulsjonen og redusert partikkelstørrelse som tillater migrering inn i gelen. Dette er konsistent med resultatene de cryo TEM (Fig 1A og 1B).
Konfokalmikroskopi av kreftceller dyrket i lipidoppløsningene med og uten ApoA-II
Opptaket av fett hos CFPAC-en celler (figur 2A3), PANC-1 (fig S2A) og primær tumorcellelinjer (fig S2B) ble forbedret når rekonstituert lipid pluss ApoA-II ble tilsatt til kulturmediet. Lignende effekter ble også sett i A549 lungekreftceller (S2C Fig). I disse eksperimentene ApoA-II ble visualisert ved hjelp av ApoA-II-antistoffer som viste at det var lokalisert til cancercellemembraner (figur 2A og S2 Fig). Mens redusert fluorescensintensitet ble observert i CFPAC-1-celler når cellene ble pre-inkubert med anti-SR B1 blokkerende antistoff (figur 2A4). Når CFPAC-1 celler ble pre inkubert med umerkede stort overskudd SMOFlipid alene (Fig 2B1) og deretter inkubert med rekonstituert SMOFlipid /ApoA-II /gjorde (Fig 2B2) videre opptak av VISSTe skjedde og ApoA-II antistoff farget periferikomponenter av celler. Således selv om preinkubering redusert opptak av SMOFlipid /ApoA-II opptak likevel oppstått gjennom mekanismen av overflate tiltrekning til ApoA-II [4, 5]. I nærvær av ApoA-II lipid opptak er vesentlig større ved forskjellige konsentrasjoner sammenlignet med lipid alene (figur 2C og 2D). Disse resultater antyder at ApoA-II er tiltrukket av cellemembranen, mens lipid var transport til PC-cellene. Dette funnet er i en avtale med Fan Y
et al
. [4] og Silver
et al
. [5]. Til sammen disse resultatene støtter forslaget om at lipid nanopartikler kan endocytose.
SMOFlipid var merket med DID (rød), ble ApoA-II merket grønn med et sekundært antistoff og DAPI farget kjerner blå. (A1) celler behandlet med ApoA-II alene, (A2) celler behandlet med lipid alene, (A3) celler behandlet med rekonstituerte lipoproteiner etter tilsetning av ApoA-II til VISSTe merket SMOFlipid (SMOF /A-II), som viser øket opptak og (A4 ) celler behandlet med (SMOF /A-II) etter forbehandling med anti-SR-B1antibodies som reduserte fettopptaket (skala bar, 20 um). (B) Celler ble forbehandlet med umerket lipid ved 1:10 fortynning og (B2) etter 2 timer SMOF /A-II ble tilsatt, det syntes å være endocytose i cytoplasmatiske vesikler som vist i (b3) og (B4). ApoA-II (grønn) er festet med cellemembranen (gul pil hode) og også i cytoplasma i delen forbundet med lipid (rød pil hode) i Differential interferens kontrast (DIC) overlay-bilde (skala bar 25 mikrometer). (C) Levende celle bildebehandling eksperiment viste økt opptak av lipid i cellene når rekonstituert lipoproteiner etter tilsetning av ApoA-II til VISSTe merket SMOFlipid ble tilsatt til mediet for lipidkonsentrasjoner på 01:20 og 01:10 (målestokken 100 pm). (D) Intensiteten av VISSTe fargingen var større når 4 prøvene ble undersøkt med åtte til tolv områder av interesse for hver studie hvor ApoA2 økt opptak av lipid 25,6 ± 2,2,
P
= 0,02 og 54,8 ± 2,2
P
= 0,004 for fortynninger av henholdsvis 01:20 og 01:10.
SMOFlipid ApoA-II retter seg mot PDAC PDTX in vivo
for å vurdere svulsten målretting kapasitet på lipid pluss ApoA-II vi ansatt en PDAC PDTX modell i mus. Lipid /gjorde eller lipid /gjorde /ApoA-II ble injisert i halevenen av første generasjon svulst bærende mus. Antall dyr avbildning etter 48 timer avdekket lipid vekst i de PDAC xenoimplantater tumorer er begrenset i lipid pluss ApoA-II-injiserte mus sammenlignet med lipid alene (figur 3A og S3A figur), men også i leveren, mage og milt. Dette ble bekreftet på eksplanterte organer ved
ex vivo
avbildning men litt lipid ble sett i lungene og hjernen, men ikke sett i normal bukspyttkjertel (Fig 3B og S3b fig). Den relative fluorescens intensitet ble økt med 3,4 ganger i målrettede kreft vev, når så-lipid /ApoA-II ble injisert (Fig 3C) sammenlignet med DID-lipid, i samsvar med figur 2. Til sammen våre resultater tyder på at ApoA-II retter seg mot menneske PDAC.
(A) Spectral refleksjon fluorescens bilder av åtte uker gamle xenografter tatt 48t etter halevenen injeksjon av PBS, gjorde merket SMOFlipid uten eller med ApoA-II bruker Carestream molekylær avbildning. Legg merke til den omfattende distribusjon av gjorde er bedre lokalisert til svulster når ApoA-II følger med lipid. Pilene angir området av svulster. (B) Spectral fluorescens bilder av eksplanterte svulster og organer tatt 48t etter injeksjon fra mus etter en halevene injeksjon av enten PBS, lipid /gjorde (n = 2) (= n 2) panel eller lipid /hadde pluss ApoA-II (til høyre ) sammen med H E bilder mikrograf av svulsten fra to mus (venstre panel), beholdt de morfologiske egenskaper med den opprinnelige pasientens PC svulster i lipid og lipid pluss ApoA-II behandlet mus. Legg merke til opptak av fluorescens av tumorer, lever og milt. (C) Diagram representerer opptak i tumoren i forhold til opptaket av leveren som en brøkdel av området. Disse resultatene ble deretter normalisert til verdien for mus som mottok lipid bare (definert som 1) når tumoropptak for de mus som mottok lipid og ApoA-II hadde 3,4 ganger øket opptak. Verdier er gjennomsnitt ± SD;
n
= 3.
Scavenger reseptor B klasse type 1 (SR-B1) uttrykket er høyere menneskelig PDAC
Etter western blotting, for første gang, vi demonstrert at SR-B1-ekspresjon var 13,2, 10,6, 3,1 og 2,3 ganger høyere i PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 cellelinjer henholdsvis sammenlignet med normal pankreas-cellelinje (HPDE6) (figur 4A). Immunhistokjemi (IHC) viste at SR-B1-ekspresjon var 3,7 ganger større i PDAC vev sammenlignet med normal pankreas (figur 4B). I samsvar med figur 2, har vi funnet at ApoA-II-ekspresjon var høyere i tumorer når mus ble injisert med kombinasjon av lipid og ApoA-II-emulsjon (figur 4C), mens det ikke var noen forskjell i SR-B1-ekspresjon i tumorer i alle grupper ( figur 4C).
(A) HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 celler ble dyrket og SR-B1-ekspresjon ble målt ved western blotting. Bandet intensiteten av proteinene ble normalisert med β-aktin og HPDE6 ble definert som 1. Verdiene er gjennomsnittet av to separate eksperimenter. (B) Uttrykk for SR-B1 av IHC på normal bukspyttkjertelen (NP) og menneske PDAC vev. Inset, representerer IgG den isotypebestemt matchet primære antistoff mot anti SR-B1. Grafen viser kvantifisering av SR-B1 uttrykk ved prosentandelen av fargede celler X intensitet fra 3 separate pasienter og NP ble definert som 1. (C) Uttrykk for SR-B1 og ApoA-II ved IHC i tilsvarende xenopodet PDAC svulster på 48 timer etter haleveneinjeksjon av lipid med eller uten ApoA-II. Innfelt, representerer IgG den isotypebestemt tilpasset primære antistoff til anti-ApoA-II. (D) Effekt av anti SR-B1 alene i HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 cellevekst. (E) Celler ble forbehandlet med eller uten SR-B1-antistoff (2,5 ug /mL) i 2 timer og deretter behandlet med ApoA-II, lipid og lipid pluss ApoA-II i 48 timer. Proliferasjon ble målt ved krystallfiolett analyse. Verdier er gjennomsnitt ± SD;
n
= 4. *
, ‡, # og ± p 0,05 vs. kontroll, ApoA-II, lipid og lipid henholdsvis + ApoA-II, med bruk av analyse av varians.
ApoA-II forbedret celleproliferasjon i humane kreftceller
Fire PC cellelinjer Panc-1, MIAPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 vokste hurtigere (figur 4E) når de hadde lipid og ApoA-II tilsatt til sitt dyrkningsmedium, sammenlignet med kontroller, ApoA-II alene eller sammen med lipid alene (bortsett CFPAC-1 celler). Alternativt kan ApoA-II downregulated normale HPDE6 celler (figur 4E). Dette var mest tydelig etter 48 timer, og innebærer at en kombinasjon av lipid og ApoA-II øker opptaket av lipid og således energi slik at PC-cellene til å vokse raskere. Det var en lignende effekt på humane kreftcellelinjer fra lunge, bryst og prostata etter 48 timer (S4 Fig). Men den ApoA-II ikke fremme veksten av brystkreftcellelinje MCF7, som beholdt egenskapene til differensiering og vokser sakte [40]. I tillegg preinkubasjon med anti SR-B1-antistoff fullstendig omvendt lipid pluss ApoA-II-stimulert celleproliferasjon i PANC-1, CFPAC-1 og BXPC3 celler og delvis, men betydelig i MIAPaCa-2-celler (figur 4E). Interessant, inhibering av SR-B1 forbedret ApoA-II pluss lipid indusert nedregulering av cellevekst i HPDE6 (figur 4E). Anti SR-B1 alene ved 2,5 ug /ml hadde ingen signifikant effekt på HPDE6, PANC-1, MIAPaCa-2 og BxPC3 cellelinjer, mens signifikant nedregulert CFPAC-1-cellevekst (figur 4D). Dette kan skyldes forskjell tetthetsnivået til SR-B1 i PANC-1, MIAPaCa-2, BxPC3 og CFPAC-1-cellelinjer (figur 4A) i.
diskusjon
ApoA-II forandret den fysiske strukturen av SMOF lipid ved å redusere størrelsen av lipidpartikler og indusere dannelsen av et dobbeltmembranen nanoparticle- lignende struktur. Dette er i overensstemmelse med kjent struktur og funksjon av ApoA-II i HDL [41]. Kombinasjonen av ApoA-II og lipid i betydelig grad fremmet vekst av PC-cellelinjer og cellelinjer fra lunge, bryst og prostata cancer. I tillegg, ApoA-II forbedre lipid opptaket i PANC-1, CFPAC-1, primære tumorceller og i PDXT. Opptaket av eksogent lipid emulsjon med ApoA-II i PC-svulster kan benytte SR-B1-reseptoren (figur 2A4), fordi den danner en HDL lignende struktur som har en høy affinitet til SR-B1 [26].
