Abstract
Bakgrunn
Mange ulike genetiske endringer er observert i kreftceller. Individuelle kreftgener vise punktmutasjoner eksempel base endringer, innsettinger og slettinger som initierer og fremmer kreft vekst og spredning. Somatisk hypermutasjon er en kraftig mekanisme for generering av forskjellige mutasjoner. Det ble vist tidligere at somatisk hypermutability av proto-onkogener kan indusere utvikling av lymfomer.
metodikk /hovedfunnene
Vi har funnet en usedvanlig høy forekomst av single-base mutasjoner i tumorsuppressorgener
RASSF1 Hotell og
RBSP3 (CTDSPL)
begge ligger i 3p21.3 regioner, henholdsvis LUCA og AP20. Disse regionene inneholder klynger av tumorsuppressorgener som er involvert i flere krefttyper så som lunge, nyre, bryst, cervix, hode og hals, nasopharyngeal, prostata og andre karsinomer. Til sammen i 144 sekvensert
RASSF1A
kloner (eksoner 1-2), 129 mutasjoner ble oppdaget (mutasjonsfrekvens, MF = 0,23 per 100 bp) og i 98 kloner av eksoner 3-5 har vi funnet 146 mutasjoner (MF = 0,29). I 85 sekvensert
RBSP3
kloner, ble 89 mutasjoner funnet (MF = 0,10). Mutasjonene ble ikke cytidin-spesifikke, som ville være forventet fra endringer som genereres av AID /APOBEC familie enzymer, og dukket opp
de novo
under celledeling. De redusert evne til tilsvarende transgener for å undertrykke celle og tumorvekst innebærer et tap av funksjon. Disse høye nivåer av somatiske mutasjoner ble funnet både i kreft biopsier og kreft cellelinjer.
Konklusjon /Betydning
Dette er den første rapporten av høye frekvenser av somatiske mutasjoner i
RASSF1
og
RBSP3
i ulike kreftformer som tyder på det kan underlag den mutator fenotype av kreft. Somatiske hypermutations i tumorsuppressorgener involvert i store menneskelige kreftformer har en ny innsikt i kreftutvikling, progresjon og spredning
Citation. Kashuba VI, Pavlova TV, Grigorieva EV, Kutsenko A, Yenamandra SP, Li J, et al. (2009) Høy mutability av tumorsuppressorgener
RASSF1 Hotell og
RBSP3 (CTDSPL)
i Cancer. PLoS ONE 4 (5): e5231. doi: 10,1371 /journal.pone.0005231
Redaktør: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 9. desember 2008, Godkjent: 18 mars 2009; Publisert: 29. mai 2009
Copyright: © 2009 Kashuba et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra den svenske Cancer Society, Vetenskapsrådet, den svenske Stiftelsen for internasjonalisering av forskning og høyere utdanning (stint), det svenske instituttet, det kongelige svenske vitenskapsakademiet, Intas og Karolinska Institutet. A.K. ønsker å takke det svenske Vetenskapsrådet for prosjektstipend for unge forskere. EB ble støttet med den russiske Foundation for Basic forskning (Grant 07-04-00097-en). IK og MIL ble finansiert av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. VNS og LLK ble støttet av russiske stiftelsen for grunnforskning og av departementet for utdanning og vitenskap (stipend for støtte av ledende russiske vitenskapelige skoler). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vi har gjennomført en omfattende undersøkelse av 3p sletting på mer enn 400 av lunge, nyre, bryst, livmorhalsen og eggstokkene karsinomer (store epiteliale kreftformer) med en definert sett med markører, kombinerer konvensjonell LOH med kvantitativ real-time PCR (QPCR), komparativ genomisk og Notl mikromatriser hybridiseringer [1], [2], [3], [4], [5]. Vi identifiserte to mest berørte 3p21.3 regioner, LUCA (lungekreft) på centromeric og AP20 på telomeric grensen til 3p21.3. Aberrasjoner av enten region ble oppdaget i mer enn 90% av de studerte tumorer som tyder på at de multiple tumorsuppressorgener (TSG) [5], [6], [7].
En av dem er
RASSF1
genet (fra LUCA region) som kan eksistere i forskjellige alternativ spleising former (minst 7 forskjellige isoformer). I dette arbeidet studerte vi det viktigste
RASSF1A
, den største skjøting formen [8]. Flere studier har vist at tap av
RASSF1A
ekspresjon oppstår på grunn av tumor ervervet promotor-DNA-metylering i mange forskjellige kreftformer. For eksempel
RASSF1A
er brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i over 90% av småcellet karsinom (SCLC) og klarcellet nyrecellekreft (RCC) og i ca 40% av ikke-småcellet karsinom (NSCLC ). Genet er i stand til å undertrykke veksten av lunge- og nyre-kreftceller i kultur og tumordannelse hos mus [6]. I tillegg sporadiske missense mutasjoner i
RASSF1A
har blitt rapportert.
RASSF1A
koder for 340 aminosyrer. Aminosyresekvensen av
RASSF1A
inneholder en forutsagt diacylglycerol (DAG) -bindende domene og et Ras krets domene. RASSF1A kan indusere cellesyklus arrest ved å engasjere Rb-familien cellesyklus sjekkpunkt [9]. Disse og andre resultater sterkt at RASSF1A er en viktig menneskelig tumor suppressor protein opptre på ulike nivåer av tumorprogresjon [6].
Et annet gen er
RBSP3
også kalt
HYA22
og
CTDSPL
. Det finnes i to spleise former (A, 265 aminosyrer og B, 276 aminosyrer) som kart til AP20 region og tilhører et gen familie av små C-terminal domene fosfataser som kan styre RNA polymerase II transkripsjon maskiner [10]. Ekspresjon av genet ble sterkt redusert i flere SCLC og NSCLC-cellelinjer.
RBSP3
viste veksthemming med regulerte transgener i kultur og undertrykkelse av svulstdannelse i SCID-mus. Det ble demonstrert at transient ekspresjon av både A- og B-formene resulterte i drastisk reduksjon av fosforylert form av RB-protein antagelig som fører til en blokk av cellesyklus ved G1 /S-grensen. Etter dette funnet genet ble omdøpt (RB protein serin fosfatase fra kromosom 3). Alle disse funksjonene er i samsvar med klassiske kjennetegn på et TSG
Interessant, både
RASSF1 Hotell og
RBSP3
kunne samarbeide i cellesyklus arrest. Tidligere ved å hemme cyclin D1 [ ,,,0],9] og det sistnevnte ved dephosphorylating RB [10]. Dette støtter hypotesen om at TSGs i disse to regionene kan virke synergistisk [4], [5]. Videre to andre TSGs fra disse regionene kan føre til økende mutasjon frekvenser i tumorer (
MLH1
fra AP20 og
G21 /NPRL2
fra LUCA) [11], [12], [13].
det er velkjent at kreften er et resultat av genetiske og epigenetiske endringer og punktmutasjoner er en av de viktige mekanismer for utvikling av kreft [14], [15].
Tidligere andre, og vi oppdaget en rekke enkelt-basen endringer /mutasjoner i
RASSF1A Hotell som ble antatt å være SNPs [8], [16], [17]. Videre
RBSP3
mutasjoner ble påvist i alle 14 svulster i forskjellige opprinnelse uttrykker genet [10].
For å studere de tilsynelatende høye mutasjonsfrekvenser fra TSG (e) i disse regionene i 3p21. 3, vi gjennomført en omfattende mutasjon analyse av
RASSF1A product: [18], [19] og
RBSP3 /HYA22 product: [10] i flere kreftformer. Her viser vi at svært hyppige single-basen mutasjoner forekommer i disse genene i flere krefttyper. Mutasjonene ble ikke Cytidine-spesifikk som forventes hvis generert av AID [20] eller annen APOBEC familie [21], [22] enzymer. Disse mutasjonene var ikke på grunn av RNA redigering og dukket
de novo
under celledeling.
Resultater
Bioinformatikk analyse av EST cDNA kloner avslører høy mutasjonsfrekvens på
RASSF1 Hotell og
RBSP3
Først undersøkte vi offentlig tilgjengelige EST sekvensdata for
RASSF1A Hotell og
RBSP3 plakater (for
RASSF1A
tiltredelse No. NM_007182;
RBSP3A
, aksesjonsnr AJ575644, og for
RBSP3B
, aksesjonsnr AJ575645). Sekvenser med homologi under sperregrensen (se Materialer og metoder), dvs. som inneholder flere forskjellige uoverensstemmelser til kommenterte gener og ukjente nukleotider (N) ble ikke vurdert. Sekvenser lukke til slutten av leser ble også ekskludert. Dataene som er presentert i tabell 1 viser at
RASSF1A Hotell og
RBSP3
gener ble mutert til svært høye priser. For
RASSF1A
vi betraktet bare 17 kloner (mutasjonsfrekvens per 100 bp, MF = 0,22). Seks av disse ble oppnådd fra cancervev og alle av dem inneholdt mutasjoner (MF = 0,42). Elleve sekvenser var fra normalt vev (fire kloner med en mutasjon) og MF = 0,1, dvs. mutasjonsfrekvenser var statistisk signifikant forskjellig (p = 0,025).
Åtti en prosent av
RBSP3
sekvenser (63 av 79) inneholdt mutasjoner /uoverensstemmelser. MF for
RBSP3
ESTs var 0,63. Igjen var det mye høyere i kloner isolert fra kreft (MF = 1,05) enn fra normalt vev (MF = 0,45). Denne forskjellen var også signifikant (P 0,001). Forskjellen var enda mer uttalt for mutasjoner skiftende aminosyresekvenser (MF 0,72 versus 0,24) og lignende for RASSF1A kloner (MF 0,33 versus 0,1).
Antall tilgjengelige (og muterte) EST sekvenser var signifikant høyere for både
RASSF1A Hotell og
RBSP3
, men på grunn av svært strenge kriterier mange ble ekskludert fra analysen.
Viktigere, vi har også oppdaget hypermutations i andre eksoner av
RASSF1A
, delt med
RASSF1C plakater (nylig vist seg å være en TSG med et annet vev spesifisitet enn
RASSF1A
, se [23]. MF for eksonene 3-6 var 0,43 og for mutasjoner skiftende aminosyrer MF = 0,25 og derfor
RASSF1C
er også hypermutated.
En lignende bioinformatiske analyse ble gjort for insulingenet (333 bp, komplett ORF). Ingen mutasjoner ble oppdaget i mer enn 1000 sekvensert kloner isolert fra cellelinjer og somatiske vev. i 20 tilgjengelige
p16 /INK4a plakater (eksoner 1-3, 447 bp) kloner sekvensert fra kreft og normale celler fant vi ingen mutasjoner og i 6 kloner for
GPR14 plakater (1170 bp) bare en mutasjon ble funnet i kreftceller (MF = 0,01). I våre forsøk som er beskrevet nedenfor (se neste avsnitt og avsnitt «forskjellige mutasjoner frekvenser i andre gener») i 31 sekvensert
GPR14
kloner ingen mutasjoner ble funnet noe som indikerer at denne mutasjonen er ganske sjelden. Mutasjonen frekvens for GPR14 var statistisk signifikant forskjellig i forhold til både RASSF1A og RBSP3 (P = 0,01).
Hyppige mutasjoner i
RASSF1A
i menneskelige karsinom, kreft og hematopoietiske cellelinjer
Under analyse av
RASSF1A
vi har isolert flere muterte kloner inkludert en dobbel mutant [16]. Denne høye frekvens av mutasjoner var overraskende siden for
RASSF1A Hotell og andre kandidatgener i AP20 og Luca regioner mutasjonen frekvensene ble rapportert å være lav til ingen [6], [19]. Samtidig mange polymorfismer ble registrert for
RASSF1A
og i mange tilfeller var det ikke klart om det var en ekte enkeltnukleotidpolymorfi eller somatisk mutasjon i kreftceller fordi kontroll normale celler ikke var tilgjengelig [8]. Viktigere, i alle disse studiene single-strand konformasjon polymorfisme (SSCP) og direkte sekvensering fra PCR produktene ble brukt. Innblanding av stroma, blodkar, lymfocytter og andre normale celler vil hindre deteksjon av mutasjoner ved hjelp av disse fremgangsmåter (se M /M). Tumor heterogenitet skaper ytterligere problemer for å gjenkjenne mutasjoner. Derfor bestemte vi oss for å re-undersøke mutasjonsstatus av
RASSF1A
i flere krefttyper, inkludert primære svulster og kreft cellelinjer. Først
RASSF1A
cDNA ble isolert fra en RCC biopsi (T356) og den omkringliggende normalt ser nyre parenchyma (N356). Flere cDNA kloner ble sekvensert. I seks kloner avledet fra normal nyre parenchyma, ble ingen mutasjoner funnet. Men av syv kloner fra tumorvevet, ble mutasjoner detektert i tre (P = 0,14). Alle var A til G erstatninger. For å utelukke RNA redigering, genomisk DNA fra samme pasient ble isolert og de to første eksoner (DAG domene) av
RASSF1A
ble forsterket av PCR. Flere kloner avledet fra normalt og svulstvev ble deretter sekvensert: alle seks kloner fra svulsten biopsi viste mutasjoner, mens av de fjorten analyserte kloner fra normalt vev bare én ble mutert (P 0,001). De observerte mutasjoner i cDNA fra tumorceller ble ikke laget av RNA-redigering fordi de mutasjoner ble detektert også på genomisk DNA-nivå. Normal celle forurensning og høy uttrykk for
RASSF1A
i normale celler, i forhold til kreftceller, kan forklare de forskjellige forhold mellom mutert og normal
RASSF1A
kloner fra cDNA og genomisk DNA. Mest overraskende ble det faktum at, med unntak av to genomiske kloner fra tumorbiopsi med delesjon av C ved posisjon 254 (aksesjonsnr NM_007182), alle andre detekterte mutasjoner var i forskjellige stillinger.
Som en kontroll vi forsterkes
GPR14
fra samme pasient og sekvensert 10 kloner av kreft og fra omkringliggende normalt vev. Ingen mutasjoner ble funnet beviser at høy mutasjonsraten er spesifikk for
RASSF1A
genet.
For å sjekke om forskjellige mutasjoner i samme svulst oppstått på grunn av svulsten heterogenitet eller en annen mekanisme (r) , vi isolert og sekvensert
RASSF1A
kloner (bare ekson 1 og 2; 391 bp) fra genomisk DNA fra fire RCC-cellelinjer. I TK164 alle tre, og i KRC /Y (2 + 2) alle fire sekvensert kloner inneholdt mutasjoner. I TK10, blant 22 kloner, ble ni mutert. Viktigere, de fleste kloner inneholdt forskjellige mutasjoner. Kun en klon ble sekvensert fra Caki1, og det ble mutert.
sekvensert også dette genet fra genomisk DNA fra fire lymfoide cellelinjer (BL2 og RAMOS er Burkitt cellelinjer, og IARC171 og MutuIII er lymfoblastoide cellelinjer) og resultatene var meget lik RCC-cellelinjer (tabell 2). Til sammen blant 84 sekvensert kloner 55 inneholdt mutasjoner som i de fleste tilfeller avvek. MF i
RASSF1A
i disse forsøkene var mellom 0,14 og 0,70.
I alle videre forsøk, vi analysert genomisk DNA (ekson 1 og 2 for
RASSF1A Hotell og hele
RBSP3
transgenet i Pete vektor) hvis ikke spesielt nevnt.
Mutasjoner i
RASSF1A
kan genereres
de novo
for å skille mellom muligheten for at forskjellige mutert
RASSF1A
gener ble mutert på en gang ( «burst av mutasjoner») eller ble stadig generert over tid, utførte vi eksperimenter med enkeltceller. I dette eksperimentet BL2 celler, (som tidligere viste den høyeste frekvensen av mutasjonen: 10 kloner med 25 mutasjoner), ble fortynnet og belagt i brønner med en forventet frekvens på 0,3 celler per brønn. Tre tilfeldig utvalgte brønner (betegnet som BL2-cl.1, 2 og 3) som inneholder enkeltceller ble utvidet og videre analysert. DNA ble isolert fra disse kloner etter 10 dager (ca. 10 avdelinger, 10
3 celler)
Resultatene ble som følger:. For BL2-cl.1, fem av 10 sekvensert kloner ble mutert (mutasjon frekvens per 100 bp (MF), var 0,14), for BL2-cl.2, fem av 13 kloner (MF = 0,15, to kloner inneholdt T43T mutasjoner med kodon endret fra ACA til ACG) og for BL2-cl.3, tre av 17 kloner ble mutert (MF = 0,07, to kloner inneholdt N70G mutasjoner). Til sammen 16 enkelt basepar mutasjoner ble oppdaget, var alle overganger og bare fem av dem viste mutert G eller C. Dette eksperimentet viser tydelig at mutasjoner i
RASSF1A
locus kan genereres
de novo
under celledeling.
Den fullstendige listen over 129 mutasjoner (111 mutasjoner var annerledes) funnet i eksoner 1 og 2 i
RASSF1A
i alle forsøkene er vist i tabell S1 A. Se også tabell 2 og 3 og figur 1
A
. Til sammen 144 kloner ble sekvensert (56,3 KB), og den gjennomsnittlige frekvensen av mutasjoner var 0,23 /100 bp for transkriberte sekvenser, og 0,17 /100 bp av kodende sekvenser. Blant dem var det fire nukleotid endringene som skjedde i ikke-kodende 5 «, tre stopp (tull) og fem rammeskifte (slettinger) mutasjoner. Av de resterende 127 mutasjoner, 82 var missense og 35 synonymt.
Plassering av mutasjoner påvist i
RASSF1A Hotell og
RBSP3
er vist i A og B henholdsvis. Eksempler på mutasjoner er vist i C. For
RASSF1A
bare mutasjoner i kodende sekvenser av eksoner 1 og 2 er vist. Mutasjoner i hele kodende del av RBSP3 er vist. Red «X» markerer stoppe nonsense mutasjoner eller slettinger. «Z» betegner synonyme mutasjoner.
RBSP3
er også hypermutated i ulike kreft
Under tidligere analyser av småcellet lungekreft (SCLC) celle linjen N417, to RCC, en brystkreft (BC) og to eggstokkene karsinom (OC) biopsier som alle uttrykte
RBSP3
, vi har oppdaget mutasjoner i
RBSP3
cDNA i alle seks tilfeller [10 ; se tabell S2A].
For å teste om hyperfunksjon er karakteristisk bare av
RASSF1A
gen eller et mer generelt fenomen, vi på samme måte analyserte nylig identifiserte flere tumorsuppressorgenet
RBSP3
ligger i AP20, 3p21.3 telomeric region [10].
Ved hjelp av RT-PCR, ble cDNA isolert fra to av hver RCC, BC og OC biopsier og SCLC cellelinje N417. Flere kloner ble sekvensert. Resultatene presentert i tabell S2A, tabell 3 og figur 1B, viste at nesten alle isolerte kloner led mutasjoner. Som revers transkriptase anvendt i RT-PCR har et betydelig høyere feilrate enn andre polymeraser som brukes i PCR, forsøkte vi å reprodusere den observerte høye mutasjonshastighet på det genomiske DNA-nivå, som i tilfellet med
RASSF1A
. Uheldigvis var det vanskelig å utføre dette eksperimentet på det genomiske
RBSP3
grunn av den store størrelse av genet (mer enn 120 kb), mange små exoner (minst 9), og høyt GC-innhold (nå 100 % i enkelte regioner). Men dette problemet ble løst ved hjelp av klonet
RBSP3
i SCID-mus.
RBSP3
avdekket høy mutability i SCID-mus på genomnivå
SCLC cellelinje ACC -LC5 og RCC cellelinje KRC /Y ble transfektert med
RBSP3A Hotell og
RBSP3B
skjøting isoformer i Pete vektor og stabile cellekloner ble isolert. Fire av disse kloner (AHA1 og AHB1 for ACC-LC5 og KHA4 og KHB9 for KRC /Y) ble inokulert i SCID-mus (se M /M).
Cell kloner KHA4 og KHB9, som inneholder
RBSP3A
eller
RBSP3B
ble dyrket
in vitro
parallelt med svulster i SCID-mus. Etter 8 uker DNA ble isolert fra dyrket svulster og cellelinjer, og
RBSP3A Hotell og
B
gener ble forsterket av PCR fra Pete vektor og klonet. Igjen multiple kloner ble sekvensert og resultatene fra forsøket er vist i tabell 4 og tabell S2B. Kun 30% av
RBSP3
KHA4 og KHB9 plasmid kloner ble mutert
in vitro
, sammenlignet med 85% muterte kloner etter vekst i SCID-mus. Denne forskjellen ifølge Fischer test er statistisk signifikant (P 0,001).
I sammendraget, i
RBSP3
eksperimenter vi identifisert 89 mutasjoner blant hvorav 79 individuelt forskjellig (se tabell S2A og S2B). Den gjennomsnittlige hyppighet av mutasjoner var 0,10 /100 bp for transkriberte sekvenser. Denne frekvensen er mer enn 0,11 /100 bp av kodende sekvenser (se tabell 3 og figur 1B). Blant dem, syv nucleotide skjedd endringer i ikke-kodende områder og fem rammeskifte (slettinger) mutasjoner. Av de resterende 77 mutasjoner, 68 var missense og 9 synonymt.
Dermed mutasjonsfrekvens var 2,5 ganger mindre enn for de to første eksoner av
RASSF1A plakater (se ovenfor). Den betydelige forskjellen i mutasjonsfrekvenser kan forklares med forskjeller i nukleotid sammensetningen av gener, eller det kan reflektere iboende forskjeller i hyper priser av genene. Det kan også være viktig at for
RBSP3
hele genet ble sekvensert mens for
RASSF1A
bare sin 5 «ende.
RASSF1A Hotell og
RBSP3
forsterket av PCR fra
E.coli
DNA ikke viser høy frekvens av mutasjoner
Vi har utført PCR oppformering av
E. coli
DNA inneholdende plasmider (det vil si total DNA isolert fra
E.coli
inneholdende blanding av genomisk og plasmid-DNA) med disse to genene. For hvert gen ti og fire ng DNA ble anvendt. Dessverre lavere mengde
E. coli
DNA ikke produsere tilstrekkelig mengde av PCR-produkter for videre kloning. Ti kloner i hvert eksperiment ble sekvensert og ingen mutasjoner ble detektert. Disse resultatene indikerer at den observerte hyper frekvensen av
RASSF1A Hotell og
RBSP3
kan ikke forklares med PCR-polymerase feil.
Søk etter grunnleggeren mutasjoner i
RASSF1A
i enkelt celle kloner
hoved~~POS=TRUNC med dette eksperimentet var følgende. Hvis en mutasjon har sin opprinnelse i cellen og ikke i røret
in vitro
deretter i cellepopulasjonen vokst fra en celle noen fraksjon (avhengig av hvor mange alleler som er tilstede i én enkelt celle) av plasmidklonene bør inneholde samme (dvs. en grunnlegger) mutasjon. For å utføre dette eksperimentet vi isolert 15 encellede KRC /Y kloner som beskrevet i avsnittet «Mutasjoner generert de novo». I dette tilfelle vi vokste cellene i tre uker for å oppnå mer DNA og generere flere muterte kloner. KRC /Y-celler ble anvendt i stedet for BL2 celler som det var lettere å oppdage at vi har en celle i brønnen. Vi kan imidlertid naturligvis ikke utelukker at i noen av de 15 utvalgte brønner var det mer enn en celle.
RASSF1A
exoner 3-5 ble testet i dette forsøket (se M /M) som de var lettere isoleres enn eksoner 1 og 2, og inneholdt mer sekvensinformasjon (516 nt nt vs. 391). Videre, ifølge EST sekvens data denne delen av
RASSF1A
har høyere MF. Fra hver PCR-reaksjon 10 plasmid-kloner ble utvalgt, og DNA ble isolert. Imidlertid, på grunn av forskjellige tekniske problemer (ingen eller omarinnsats, dårlig kvalitet eller DNA-sekvensering, etc.) vanligvis bare seks-syv plasmid kloner ble videre analysert. Helt 98 plasmid-kloner ble sekvensert (tabell 5). Ett grunnlegger mutasjon ble detektert i alle cellekloner og i 46 (47%) av plasmidklonene. Det var en endring av A til G (nt26735, aksesjonsnr AC002481) akkurat på grensen av intron 2 og exon 3. Denne mutasjonen ødela spleiseakseptoren nettstedet AG /G og dermed inaktivert genet. Ettersom dette grunnlegger mutasjon dukket opp i alle single celle kloner sannsynligvis det oppsto før vi begynte å gjøre dette eksperimentet. Førti andre grunnlegger mutasjoner spesifikke for hver celle klon ble også registrert (se tabell 5 og tabell S1B). Interessant i ett tilfelle var det mulig å konstruere et tre som viser hvordan grunnlegger mutasjoner ble akkumulert. Først var det bare en mutasjon enn to og deretter flere uavhengige mutasjoner (figur 2).
Synonymt mutasjon Pro122Pro ble forårsaket av nucleotide endring ATC → AAC. Mutasjon GTC → GTA heller ikke resultere i noen aminosyre endring (Val174Val).
Ulike mutasjoner frekvenser i andre gener
Lignende sekvense eksperimenter ble utført med insulin og albumin gener isolert fra KRC /Y-cellelinje (se M /M). I motsetning til
RASSF1A Kjøpe og
RBSP3
resultater, bare én av 21 sekvensert insulin genomiske kloner (999 bp inkludert komplett ORF) og én av 19 albumin cDNA kloner (700 bp, eksoner 12-15 ) ble mutert (MF for begge genene var mindre enn 0,01). Men i begge tilfeller kan vi ikke utelukke muligheten for polymorfismer. I tillegg ble to flere gener testet med hensyn til mutasjoner i genom-DNA.
GPR14 plakater (G protein-koblet reseptor 14, 1018 bp) og transkripsjon forlengelse faktor A (SII)
TCEA1 plakater (1066 bp) ble PCR forsterket (se M /M) fra DNA til KRC /Y-celler og 11 kloner for hvert gen ble sekvensert. Alle kloner inneholdt normale kopier av genet. Ingen mutasjoner ble funnet i andre 3p21.3 kandidat gener:
BLU plakater (15 kloner ble sekvensert),
101F6
(6 kloner),
PL6
(6 kloner) etter KRC /Y stabile kloner som inneholder disse genene ble inokulert i SCID-mus. Videre, for allerede mutert mut
FUS1 product: (10 kloner) og mut
P53 plakater (6 kloner) ingen ekstra mutasjoner ble funnet (data ikke vist).
Mutasjoner i
RASSF1A
,
RBSP3A Hotell og
RBSP3B
ikke generert av AID eller APOBEC relaterte mekanismer
det er nylig vist at aktiveringen-indusert cytidindeaminase ( AID) er ansvarlig for somatiske hypermutations i aktiverte B-celler. Videre hypermutations generert av dette enzymet i onkogener kan føre til malignitet i hematopoetiske celler [24]. Selv om mye gjenstår å bli lært om AID, har flere mål sekvensmotiver for mutasjoner blitt identifisert, nemlig WRC, RGYW og DGYW forårsaker C /G mutasjoner. Den store familien av APOBEC gener, også vist nylig å mutere gener på DNA-nivå [21], [22], hovedsakelig rettet mot RCW motivene forårsaker mutasjoner i C /G. Derfor sjekket vi om disse motivene var målrettet eller hyppigere i
RASSF1 Hotell og
RBSP3
sekvenser i forhold til stabil insulin genet. Frekvensen av WRC motivet per 100 bp varierer 12,3 til 14,3 for
RASSF1 Hotell og
RBSP3
gener, og insulingenet inneholder 16,5 slike motiver per 100 bp. Andre motiver viste samme fordeling (også høyere i insulin genet), argumenterer mot involvering av disse enzymene i hypermutating
RASSF1 Hotell og
RBSP3
gener som er beskrevet her. Faktisk APOBEC og AID enzymer forårsake mutasjoner nesten utelukkende i C /G nukleotider, mens vi observerte mutasjoner av alle 4 nukleotider (figur 3). Resultatene faktisk viste at mutasjoner i A /T var enda hyppigere enn i C /G. Vi prøvde å finne en anerkjennelse motiv. Vi studerte alle mutasjoner (figur 3A) eller en undergruppe av mutasjoner (Tall 3B og 3C), men ingen åpenbare motivene er ennå identifisert.
For
RASSF1A
alle mutasjoner ble analysert. For
RBSP3
mutasjoner funnet i GIT (
B
) og i menneskelig kreft (
C
) ble analysert separat. Boble grafer viser hvor stor andel av erstatninger skjer på hver av de fire baser i
RASSF1A Hotell og
RBSP3
, avhengig av avstanden fra det muterte nucleotide (No. 0). N, noe nukleotid, B = C, G eller T; D = A, G eller T; S = G eller C; V = A, C eller G; W = A eller T.
Flere studier er nødvendig for å løse dette spørsmålet da dette mønsteret kan være forskjellig i normale celler og kreftceller og kan være avhengig av nukleotid sammensetningen av et gen. Disse små forskjeller i mønstre kan maskere anerkjennelse motiv.
RASSF1A Hotell og
RBSP3
mutanter fra RCC biopsi og kreft cellelinje lunge har betydelig redusert veksthemmende aktivitet
Vi har testet en
RASSF1A
genet, isolert fra en RCC biopsi som inneholdt to mutasjoner (Cys65Arg og Val211Ala), veksthemming etter celledyrkningsforhold etter transfeksjon inn KRC /Y og prostatakreft LNCaP celler . I KRC /Y celler det muterte genet hadde signifikant redusert vekst undertrykkelse aktivitet (figur 4A) mens i LNCaP det hadde nesten ingen undertrykkende aktivitet (samme som tom vektor, se [16], [17]).
A. Vekst av stabilt transformerte KRC /Y RCC-celler med villtype og mutant
RASSF1A plakater (Cys65Arg og Val211Ala) uten doksycyklin (genet er slått på) blir presentert i A. På dag seks, antallet celler med wt
RASSF1A
var 3 × 10
5 og antall celler med mutert
RASSF1A
var 5 × 10
5 (1,7 ganger mer enn wt). På dag 10, antall celler med vekt
RASSF1A
var 6 × 10
5 og antall celler med mutert
RASSF1A
var 1,8 × 10
6 (3 ganger mer enn wt). Effekten av uttrykk for villtype og mutant
RBSP3A Hotell og
RBSP3B
på kolonidannelse effektivitet i KRC /Y celler er vist i B. mutanter ble isolert fra N417 SCLC cellelinje (His139Tyr) og ovarialt svulst biopsi T4 (tre mutasjoner: Asn31Asp, Pro79Ser og Glu87Lys) og KRC /Y cellelinje (tre mutasjoner: Lys35Met, Asp103Gly og Leu181Pro). Antallet blasticidin-resistente kolonier sammenlignet med den tomme pete var: 90% for mutant fra N417, 15% for mutant fra T4 biopsi og 25% for mutant fra KRC /Y. Antallet kolonier for wtRBSP3A var 5-10% i forhold til Pete koloniene.
I et annet eksperiment, brukte vi
RBSP3
kloner isolert fra N417 SCLC cellelinje med en His139Tyr mutasjon . Igjen ble observert signifikant nedgang i veksten suppressor aktivitet (figur 4B) .Clearly, ikke alle mutasjoner er funnet i denne studien vil inaktivere
RBSP3 Hotell og
RASSF1
gener, og dette kan være sant, spesielt for mutanter isolert fra normale celler og noen av disse kan være polymorfismer. Faktisk ulike mutanter av
RBSP3
hadde signifikant forskjellig veksthemming aktivitet (figur 4B).
Konklusjoner
Etter sekvense 327
RASSF1A Hotell og
RBSP3
kloner, vi har oppdaget 364 mutasjoner med frekvenser nå 0,70 per 100 bp. Interessant mange kloner inneholdt mer enn 1 mutasjoner (se tabell S3A, B, C). Bare én SNP ble oppdaget i
RASSF1A
ti kloner (exon1α – AAG → CAG, K21Q) og det ble ekskludert fra listen av mutasjoner [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi? locusId = 11186]. Ingen SNP ble funnet i RBSP3 sekvenser.
Frekvensen av mutasjoner var lik andre rapporterte tilfeller av somatiske hypermutations funnet i Rho /TTF, MYC og BCL6 i stor celle lymfomer (MF var fra 0,12 til MYC til 0,69 for BCL6). Men det var betydelig lavere enn for immunoglobulin-gener (12,7 mutasjoner per 100 bp, se [25]. Imidlertid, for første gang, har vi funnet høy frekvens av somatiske mutasjoner i forskjellige vev, inkludert ikke-hematopoietiske og i tumorsuppressorgener i motsetning til den tidligere rapporter der onkogener ble undersøkt.
som AccuPrime ™
pfx
DNA polymerase skaper maksimalt én feil i 3 × 10
6 bp, våre resultater viste at de observerte hyper frekvensene i forsøkene kunne ikke forklares ved feilaktig utførelse av polymeraser. i vårt eksperiment med SCID-mus når AccuPrime ™
pfx
DNA polymerase og 25 sykluser ble brukt, 85% av
RBSP3
kloner inneholdt mutasjoner.
Under veksten av de samme cellelinjer
in vitro
, 30% av
RBSP3
kloner (også 25 sykluser og AccuPrime ™
pfx
DNA polymerase) var mutant .
i forsøk med
RASSF1A plakater (391 bp av de første og andre eksoner), 65% av kloner inneholdt mutasjoner (eksperimenter med normale celler er ikke inkludert).
