Abstract
hotspot akt1
E17K mutasjon i pleckstrin homologi domene akt1 forekommer i ca 0,6-2% av menneskelige lungekrefttilfellene. Nylig har vi vist at akt1
E17K forvandler immortaliserte humane bronkiale celler. Her ved bruk av en transgen Cre-induserbar murine belastning i villtypen Rosa26 (R26) locus (
R26-akt1
E17K
mus) vi vise at akt1
E17K er en
bona-fide
onkogen og spiller en rolle i utviklingen av lungekreft
in vivo
. Faktisk, rapporterer vi at mutant akt1
E17K induserer bronkial og /eller bronchiolar hyperplastic lesjoner i murine lungeepitelet, som fremgangen til frank karsinom ved svært lav frekvens, og akselererer tumordannelse indusert av kjemiske karsinogener. I konklusjonen, akt1
E17K induserer hyperplasi av mus lungeepitelet
in vivo Hotell og samarbeider med uretan å indusere fullt ondartede fenotype
Citation. Malanga D, Belmonte S, Colelli F, Scarfo M, De Marco C, Oliveira DM, et al. (2016) akt1
E17K Er onkogene i Mouse Lung og samarbeider med kjemiske karsinogener på Induksjon lungekreft. PLoS ONE 11 (2): e0147334. doi: 10,1371 /journal.pone.0147334
Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIA
mottatt: 30 mars 2015; Godkjent: 01.01.2016; Publisert: 9. februar 2016
Copyright: © 2016 Malanga et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC 2012-14, IG_12969) og Minis Istruzione Università e Ricerca (MIUR PRIN, prot 2010W4J4RM_001 ; PONa3_00239, PON01_02782) til GV. HF ble støttet av Västra Götalandsregionen under LUA /ALF avtalen og av Assar Gabrielssons og Magnus Bergvalls Foundations
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall, blir forbundet med en 5 års verdensomspennende overlevelse på mindre enn 15% [1,2]. Mutasjons aktivering av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) veien er den viktigste sykdomsfremkallende arrangementet i ikke tobakk-indusert adenocarcinoma (ADC), mens den vei som drives av v-Ki-ras2 /Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (KRAS) er involvert i tobakk-mediert lunge kreft [3-6]. Dessverre, aktiverende mutasjoner i EGFR er vanligvis ikke tilstede i lunge plateepitelkarsinom (SCC), [7], og dermed målrettet terapi er den nest vanligste typen NSCLC ineffektiv. Nyere studier viser 2-4% rente av p110 α-katalytisk subenhet av PI3K (PIK3CA) mutasjoner [8-10] og 1% rente av akt1 mutasjoner [11,12] i SCC har antydet at målretting disse genene kan vise en vellykket terapeutisk alternativet [7,13-15].
AKT kinaser (akt1, akt2, akt3) representerer den primære nedstrøms endepunktet av phosphoinositide 3-kinase (PI3K) sti, regulerer spredning, overlevelse, metabolisme og invasjon. Akt1 og akt2 ofte aktiveres i human kreft [16-18] etter tapet av lipid fosfatase PTEN, aktive mutasjoner og /eller kopiere nummer variasjon i EGFR eller HER2 tyrosin kinase reseptorer, aktive mutasjoner i KRAS, i PIK3CA [19,20]
, [21], eller i seg selv akt1 [22]. I lungekreft en somatisk mutasjon i pleckstrin homologi (PH) domenet akt1 som resulterer i glutaminsyre til lysin substitusjon i rest 17 (E17K) ble rapportert med samlet frekvens av 0,6-2% [7,11,12,23-25 ].
akt1
E17K viser økt affinitet for PI (4,5) P2, forbedret plasma membran rekruttering og konstitutiv aktivering [22,26]. Endogen akt1
E17K mutante proteinet påvist i lungecancerceller viser forbedret membran lokalisering [11], noe som resulterer i aktivering av nedstrøms signalisering [11,22].
Rollen til mutanten akt1
E17K i epitel tumorigenesis fortsatt uklart fordi studier i cellemodeller i bryst og lungeceller har produsert uharmoniske resultater [27-30]. I tillegg, ingen mus belastning som modellerer akt1
E17K mutasjon har blitt generert så langt.
Disse betraktningene bedt oss om å ta rollen som akt1
E17K i transformasjonen av lunge epitelceller
in vivo
. Heri, viser vi at akt1
E17K fremmer hyperplasi i mus lunge og samarbeider med andre genetiske skader å indusere full malignitet.
Materialer og metoder
Vector Design og generasjon av transgene mus
For å generere
R26-akt1
E17K
transgene mus human akt1 cDNA ble forsterket av PCR fra humane mononukleære blodceller ved PCR ved bruk av primere 5′-ATGAGCGACGTGGCTATT- 3 «og 5′-TCAGGCCGTGCCGCTGGC-3». PCR-produktet ble klonet inn i en shuttle-plasmid (pBluescript) ved anvendelse av standard kloningsteknikker. Mutant akt1
E17K cDNA ble generert av Quick Change Site-Direct mutagenese (Stratagene) og sub-klonet inn i pROSA26 vektoren [31-33] for å få den rettet mot konstruere PR26-akt1
E17K, som besto av fem « og 3 «homologi armer ROSA26 locus, FRT /FRT-flankert neomycin motstand (Neo) kassett og loxP /loxP-flankert trippel polyadenylation (TPA) sekvens. Se figur 1 for detaljer.
A. Skjematisk fremstilling av targeting konstruere brukes til betinget knock-in i
R26
locus. Den menneskelige
akt1
E17K
cDNA innledes med en loxP-flankert transkripsjonen stopp kassett, ble saman inn i R26 locus. Cre-formidlet fjerning av stopperen kassetten forbinder Rosa26 ekson 1 til eksogen cDNA slik at ekspresjon av transgenet. B. Southern blot av EcoRV-spaltet genomisk DNA avledet fra mESCs transfektert med konstruksjonen som bærer målrettingen mutant akt1. Felt 1: DNA fra ikke-målrettede mESCs, kjørefelt 2 og 3: DNA fra DNA fra to forskjellige
R26-akt1
E17K
mESCs stammer. Endogen allelet tilsvarer 11,5 kb band (
WT
); mutant allel tilsvarer 4,3 kb band (
REC
). C. Relativ mRNA uttrykk for menneskelig akt1
E17K av Q-RT-PCR i målrettede mESCs og i tilsvarende celler transfektert med Flp (pFlpE-IRES-Puro) eller Cre recombinase (pcre-IRES-Puro). Dataene er fra duplikate eksperimenter som gjennomsnitt ± SD. *** P 0,001. D. Genotype analyse av PCR på halespissen DNA av genmodifiserte mus som angitt.
30μg av R26-akt1
E17K plasmid ble linearisert med SfiI restriksjonsenzym (New England, Biolabs) og electroporated inn mus embryonale stamceller (Mesc). G418-resistente Mesc kloner ble isolert og screenet for riktig målretting av det geometriske sted ved hjelp av PCR (primere F1 og R1, henholdsvis: 5′-AGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTT-3 «, 5»-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3) amplifisering av et 3,9 kb fragment. PCR positive G418-resistente kloner ble deretter sortert ved Southern blot sondering for 5 «rekombinasjon veikryss. Når identifisert, målrettet Mesc kloner ble transfektert med Flp-uttrykkende plasmid (pFlpE-IRES-puro) for fjerning av Neo kassetten. Deretter Neo-slettede Mesc kloner ble isolert, screenet ved hjelp av PCR (primere F2 og R2, henholdsvis: 5»-CGGCCTCGACTCTACGATACCGTCGATCC-3 «, 5′-R2 GGATCGAGATCTGATAACTTCGTA-3») og injisert inn i blastocyster B6, som deretter ble overført til pseudo -pregnant kvinner til å produsere kimære dyr på Embryonic Stem Cell Facility av IRGS (Ariano Irpino, Avellino, Italia). De genererte chimeras ble avlet for å etablere germline overføring av menneske allel. Genotyper av
R26-akt1
E17K
mus ble bestemt ved PCR ved bruk av genomisk DNA isolert fra hale tips med følgende primere: 5’ARMF, 5′-AACTGCAGACTTGTGGGATAC-3 « ; 3’ARMR, 5»-ATATTAGTCCACCTCACTCCT-3 «; mE17KR5 5»-GCCAACCCTCCTTCACAATA-3 «.
R26-akt1
E17K
linjen ble parret med
Ttf1-Cre
linjen (en gave fra Dr. Mario De Felice, IRGS, Ariano Irpino, Italia ), for å generere
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre;
mus.
Ttf1
-Cre mus ble genotypet ved å bruke de følgende primere: FP, 5′-CCTGATGGACATGTTCAGGGACA-3 «: RP, 5′-GCCAGATCTCCTGTGCAGCATGT-3».
R26-akt1
E17K
mus ble back-krysset på B6 bakgrunn. I alle forsøkene kullsøsken ble brukt som kontroller.
Dyreforsøk ble godkjent av den lokale etiske komité «Comitato Etico per la Sperimentazione Animale» (CESA) av IRSG og i samsvar med forskrifter og retningslinjer i Italia og EU. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere dyrs lidelser (S1 ANKOMMER sjekkliste). Mus ble plassert i en svært kontrollert mikrobiologisk miljø for å garantere SPF forhold. De ble holdt i bur IVC, under konstante betingelser for temperatur (22 ± 2 ° C), fuktighet (55% ± 10 UR) og lys /mørkesyklus på 12/12 timer. Dyrene hadde fri tilgang til bestrålt standard diett og vann. Mus ble genotypet ved PCR hale DNA [34]. Slettingen av loxP-flankert transkripsjonelle stopp-sekvenser ble bestemt ved PCR ved anvendelse av de følgende primere:.
TRF, 5′-GGATCGACGGTATCGTAGAGTCGAGGCCG-3 «;
L2R 5′-GCCAATGAAGGTGCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3′
uttrykk for akt1
E17K i mESCs transfektert med pcre-IRES-puro ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR.
Southern blot
En standard protokoll for Southern blot var anvendes. Genomisk DNA (30 pg) ble spaltet med EcoRV. En 500bp probe på 5 «siden av målrettede innstikkstedet (fra CTTGAAAGTGGAGTAACTAC til TCAGAAGCTTTGAACTAGAA i ROSA26 locus) ble merket med DIG-dUTP, ved hjelp av PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Sveits). Dette probe identifiserer en 11,5 kb fragment i villtype ROSA26 locus og en 4.3kb fragment i målrettet ROSA26 locus.
Western Blot og antistoffer
Hele vev proteinekstrakter ble forberedt med NP-40 buffer ( 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40) inneholdende proteaseinhibitorer (SigmaFast, Sigma-Aldrich). Western blot-analyse ble utført ved standardmetoder [11]. Anti-fosfor-AKT (Ser473) (# 4058), anti-akt1 (# 2938), anti-fosfor-FoxO1 (Ser256) (# 9461), anti-FoxO1 (# 2880), anti-fosfor-gsk3-α /β (Ser21 /9) (# 9331), anti-gsk3-α (# 9338), anti-gsk3-β (# 9332) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danver, MA).
Kvantitativ revers transkripsjon real-time PCR (Q-RT-PCR)
Totalt RNA ble fremstilt som beskrevet [35]. RT-PCR ble utført på RNA ekstrahert ved Trizol (Invitrogen) og retro-transkribert med Superscript II (Invitrogen). Q-RT-PCR ble utført ved hjelp av strøm SYBR Grønn PCR Master Mix i ABI Prism 7900 termo (Applied Biosystems, Foster City, California). Genekspresjon ble normalisert til GAPDH mRNA innhold. De relative mengder av mRNA eller DNA som ble beregnet ved den komparative syklusen terskel (CT) metoden [36]. Følgende primere brukes i Q-RT-PCR
AKT1R26 frem 5′-CACACCACCTGACCAAGATG-3. «;
AKT1R26 reversere 5′-AATCAAGGGTCCCCAAACTC-3′
Virus infeksjon av mus
kontroll
R26 en
nd
R26-akt1
E17K
mus ble infisert med 10
6 eller 10
7 pfu av adenovirus uttrykke Cre (Ad-Cre) (Vector Biolabs, Philadelphia, PA). Mus mellom 6 og 12 ukers alder ble bedøvet med isofluran og Ad-Cre ble administrert intranasalt. Mus fikk 120 mL av Ad-Cre, i to doser på 60 mikroliter hver, med en pause mellom de to dosene, slik at musene å gjenopprette en normal pusting. Kontroll mus fikk lik mengde buffer fosfat saltløsning (S1 ANKOMMER sjekkliste).
Experimental Karsinogenese
R26 eller R26-akt1
E17K
kullet ble enten infisert med Ad-Cre (10
6-10
7 PFU) eller behandlet med oppløsningsmiddel alene før mottak av intra-peritoneal injeksjon med en enkelt dose på 1 mg /g kroppsvekt av uretan, en etyl-ester av karbaminsyre brukt i stor utstrekning i murine modeller av karsinogenese [37], oppløst i steril 0,9% saltoppløsning. Musene ble overvåket ukentlig og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Ingen mus måtte avlives før den spesifikke eksperimentelle endepunktet (6, 9 og 18 måneder, henholdsvis) av helsemessige årsaker. Musene ble avlivet etter 6, 9 og 18 måneder ved halshugging (S1 ANKOMMER sjekkliste). Lungene ble fjernet og oppblåst med 10% nøytral bufret formalin. Lungevev ble oppsamlet og fiksert med 10% formalin og innstøpt i parafin ved hjelp av standard fremgangsmåter. Lunge seksjonering ble utført for å omfatte 1,5 mm i lungen parenchyme; frontal seksjonene var samlet på 15 nivåer med 100 mikrometer avstand) av sagittal avstanden til tilstrekkelig dekke både perifere og sentrale regioner. Snittene ble montert på lysbilder og farget med hematoxylin annonse eosin og ble evaluert ved lysmikroskopi av veterinær patologer og menneskelig patolog (OP, HF og CM). For hver svulst lysbildet med maksimal lesjon diameter ble identifisert og registrert under mikroskopet.
Histologisk analyse og immunhistokjemi
Lung vev ble samlet og fiksert med 10% formalin, og i parafin ved hjelp av standard prosedyrer. Seksjoner (5 um) ble montert på lysbilder og farget med hematoxylin og eosin skal vurderes ved lysmikroskopi av veterinær (OP og HF) eller menneskelige (CM) patologer. En kombinert resultatet av hyperplastiske lesjoner ble beregnet ved tilsetning av en poengsum å måle antallet epitel-lag (lag resultater) til en poengsum måleprosentandel av hyperplasi til stede i hele seksjonen (Global hyperplasia score). Lag-stillingen ble definert som følger: Score 1, tilstedeværelse av 1-2 laget (-lagene), score 2, tilstedeværelse av 2-3 lag, score 3, tilstedeværelse av 4 lag. Global hyperplasi resultatet ble definert som følger: Score 1, da hyperplasi var til stede i 1-20% av de totale deler analysert (3 seriesnitt /mus); scorer to, da hyperplasi var glad i 21-60% av totalt antall seksjoner analyseres (3 seriesnitt /mus); scorer tre, da hyperplasi ble funnet i 61-100% av totalt antall seksjoner analyseres (3 seriesnitt /mus).
farging med anti-fosfor-AKT ble utført med standard protokoller bruker Vectastain Universal Hurtigsett og DAB peroxydasesubstrat Kit (Vector Laboratories, Burlingame) i henhold til produsentens instruksjoner. Antigen henting ble utført med mikrobølgeovn behandling i antigen avsløring løsning (VectorLaboratory, Burlingame, CA) i 10 min. Kanin anti-fosfor-AKT (Ser473) (1: 1000, # 4058) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology
farging for Ki67 ble utført med standard protokoller ved hjelp av Bond ™ Polymer Begrens Detection (Leica Biosystems, Buffalo Grove. , IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Kanin anti-Ki67 (1: 100, PA5-19462) ble kjøpt fra Fisher Scientific (Thermo Fisher Sientific, Pittsburgh, PA). Farging for p21 ble utført med standard protokoller som bruker EnVision ™ Detection Systems Dako, i henhold til produsentens instruksjoner. Kanin polyklonale Ab-5; anti-P21 /WAF1 antiserum (01:50) ble kjøpt fra onkogen Forskning Products (Cambridge, MA). Ki67 og p21 positivitet ble bestemt ved å telle positive kjerner i 10 felt på X400 forstørrelse
Laser fangst mikrodisseksjon (LCM)
mikrodisseksjon ble utført ved hjelp av laser Microdissector Leica LMD6 LMD7 (Leica Microsystem, Milan). 5-mikrometer svulst vev seksjoner på glassplater ble satt inn i Laser Microdissector for disseksjon av lungesvulster. Utvalgte områder ble tatt med infrarød laser pulser på Media CapSure Macro LCM Caps.
Direkte
Kras
sekvense
microdissected prøvene ble lysert ved SB LysePrep Kit (Silicon Biosystem, Bologna) ifølge til produsentens instruksjoner. Aliquoter av lysis-løsning (2,5 mL) ble anvendt som templat for DNA-amplifikasjon med følgende primere: mKrasF-TCCTAC AGGAAACAAGTA og mKras R-TTATTTATGGCAAATACA. Forsterkningen program som ble benyttet var: 95 ° C /5 min; 35x (95 ° C /30 s, 52 ° C /30 s 72 ° C /30 s) for denaturering, gløding og forlengelse; 72 ° C /7 min for å avslutte forlengelse, etterfulgt av avkjøling til 15 ° C. PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler og renset ved QIAquick PCR-rensesett (Qiagen). Purified PCR produktene ble analysert på 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). For alle analysene ble data justert til konsensus sekvens hentet fra BLAST GenBank database.
immunfluorescens farging
Deparaffinized Seksjonene ble hydrert i avtagende etanol gradient løsninger og skylles i vaskeløsning (TBST, 0,05 mol /l Tris-buffret saltvann med Tween 20). Antigen gjenfinning ble utført med citratbuffer pH 6 i 30 minutter ved 98 ° C, etterfulgt av vasking i fosfat-bufret saltløsning (PBS; pH 7,4). Seksjoner ble inkubert med antistoffer mot SP-C (geitepolyklonalt antistoff anti-SP-C, 1: 200 diluition, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA) eller CC-10 (geitepolyklonalt antistoff anti-CC-10, en : 200 diluition, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA) i 60 min, etterfulgt av inkubasjon med sekundære Alexa Fluor 488-konjugert anti-geit IgG antistoffer (1: 400 fortynning, Santa Cruz Biotechnology) i 60 min. Cellene ble kontra med DAPI (2 mikrogram /ml, Santa Cruz Biotechnology), montert ved hjelp av anti-fade montering medium (DakoEnvision System, Inc, CA, USA) og observert ved Fluorescensmikroskopi (Leica Microsystems)
. statistisk analyse
data presentert er gjennomsnitt ± SD av
n
uavhengige analyser eller replikeres som angitt i teksten. Kontinuerlige variabler ble analysert ved t-test eller ANOVA test, mens kategoriske variabler ble analysert ved χ
2 eller Fishers eksakte tester. Betydning ble beregnet ved Log-rank (Mantel-Cox) test (GraphPad Prizm 5 Software, San Diego, California).
Resultater
Mutant akt1
E17K fremmer hyperplasi av bronkiene og bronchioli
Vi ga en transgen musestamme (
R26-akt1
E17K
) at betinget uttrykker human mutant akt1 i lungene ved bruk av en knock-in system (Cre betinget
Rosa26
,
R26
) som havner loxP-flankert transkripsjonen stop sekvenser oppstrøms av mutant akt1 cDNA (fig 1A). Murine ESCs var målrettet og screenet ved hjelp av Southern blot for å identifisere kloner som bar det rekombinante allelet (fig 1B) og for Cre-indusert ekspresjon av transgenet (figur 1C). Cre-responsive
R26-akt1
E17K
mESCs ble deretter brukt til å generere kimære mus. Germline overføring av banket inn allelet ble bekreftet ved PCR (fig 1D)
For å uttrykke mutant akt1 i lungeepitelet vi brukte to forskjellige systemer. Intranasal innføring av en Adenovirus bærer Cre rekombinase (Ad-Cre) eller parring av
R26-akt1
E17K
mus med
Ttf1-Cre
mus [38,39]. Bruken av
Ttf1-Cre
mus tillatt ekspresjon av transgenet i bronkialepitelet [39]
, [40], mens instillasjon av Ad-Cre viser fordelene ved å tillate den somatiske aktivering av transgenet i lappet områder og for ikke å velge på forhånd celletype der transgenet uttrykkes.
i det første settet med eksperimenter, vi krysset
R26-akt1
E17K
mus med
Ttf1-Cre
. Fig 2A viser sletting av loxP kassett i lunge vev av
R26-AKT
E17K
; Ttf1-Cre
mus; Fig 2B viser real-time RT-PCR uttrykk for mutant akt1 i lungene og figur 2C viser økt nivå av fosforylert AKT og /eller AKT substrater (GSK3α /p, FOXO1) i lungene fra
R26-AKT
E17K
; Ttf1-Cre
mus sammenlignet med
R26-Ttf1-Cre
kullsøsken. Vi målte akt1-ekspresjon ved RT-PCR i ytterligere fem vev (hale, muskel, nyre, milt, hjerte og lever) avledet fra R26-AKTE17K; Ttf1-Cre og R26-Ttf1-Cre kull mus, og resultatene er vist i S1 fig. Som vist er ingen ekspresjon observert i vev som er forskjellig fra lungene.
A. PCR-analyse av lunge DNA fra
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre Kjøpe og kontrollkullsøsken. ΔStop TPA: Lox-P flankert transkripsjonstermineringsstoppsignal. B. Relativ mRNA uttrykk for menneskelig akt1 av Q-RT-PCR på RNA fra lungene fra
R26; Ttf1-Cre
,
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre
. Data er presentert fra replikere analyse som gjennomsnitt ± SD. C. Representant immunoblot analyse av Pakt, total akt1 og nedstrøms signalproteiner i totale proteinekstrakter fra hele lungene av
R26; Ttf1-Cre Hotell og
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre
mus, henholdsvis. D-E. Representant H E farging av lungene fra
R26; Ttf1-Cre Hotell og
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre
, henholdsvis. Forstørrelse som angitt. F-G. Representant Pakt farging av lungene fra
R26;. Nkx2
1-Cre Hotell og
R26-akt1
E17K
; Nkx2
.
1-Cre
, henholdsvis. Forstørrelse som angitt.
Mus av 2 (n = 10), 6 (n = 8) og 12 (n = 11) måneders alder ble avlivet som endepunkter.
Ttf1-Cre
mus viste ingen tegn på sykdom opp til 12 måneders alder (n = 7). Omvendt, histo-patologiske analyser avslørte tilstedeværelsen av hyperplastiske lesjoner i lungene av alle 12 måneder gamle
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre
mus (fig 2D og 2E). Disse musene viste moderat hyperplasi av bronkial og /eller terminal bronkialepitelet med polariserte kjerner. Alveolær epitel var normalt om atelectasis ble observert hos noen mus. Farging med anti-pS473 vist økte nivåer av AKT-aktivering i hyperplastiske lungene av
R26-akt1
E17K
; Ttf1-Cre
mus sammenlignet med kontroll eller
Ttf1-Cre
mus (fig 2F og 2G).
Vi aktiveres også mutant akt1
E17K transgen ved intranasal administrasjon av Ad-Cre (10
6, 10
7 pfu) i 6-12 uker gammel
R26-akt1
E17K
mus. Etter 6, 9 og 18 måneder (n = 8, 8 og 7, henholdsvis) ble musene avlivet og lungene ble analysert. Vi observerte ikke lunge unormalt i
R26-akt1
E17K
mus behandlet med løsemiddel alene (PBS) (n = 7) (figur 3A). Omvendt, nesten alle
R26-akt1
E17K
musene moderat bronkial og /eller terminal bronchiolar hyperplasia 9 måneder etter Ad-Cre administrasjon (Fig 3B og 3C).
AD. Representant H E farging av lungeepitelet av
R26-akt1
E17K
mus behandlet med løsemiddel alene (ikke smittet) eller infisert med Ad-Cre (9 og 18 måneder gamle , henholdsvis). Forstørrelse som angitt.
For ytterligere å karakterisere lesjoner påvist i transgen
R26-akt1
E17K
mus, evaluert vi lunge hyperplasi ved å analysere antall av epiteliale lag i bronkialepitelet og andelen av hyperplasia på hele området av 3 seriesnitt hentet fra representative
R26-akt1
E17K
mus etter 6 (n = 3) og 9 (n = 3) måneder fra Ad-Cre administrasjon (mus kode # 7a- # 12a). Som kontroller vi gjort bruk av det samme antall
R26-akt1
E17K
mus behandlet med løsemiddel alene (mus kode # 1a- # 6a), henholdsvis. Kvantifisering av epitel-lag og av hyperplastiske områder ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er oppsummert i Tabell 1. Representative bilder av resultatet tildelt for antallet lag er vist i S2 Fig.
hyperplastiske forandringer var klassifisert på grunnlag av antall epitel-lag, og prosentandelen av hyperplasi. Evaluering av epiteliale lag, scorer 1: 1-2 lag med epitelceller, score 2: 2-3 lag med epitelceller, scorer 3: 4 lag epitelceller (n = 6 mus /gruppe, 3 seriesnitt /mus ). Evaluering av omfanget av hyperplasia, scorer 1: hyperplasi i 1-20% av totalt antall seksjoner analysert; scorer 2: hyperplasi i 21-60% av totalt antall seksjoner analysert; scorer 3: hyperplasi i 61-100% av totalt antall seksjoner analysert (n = 6 mus /gruppe, 3 seriesnitt /mus). Lesjoner ble klassifisert i henhold til en kombinert poengsum skyldes summen av resultatet av lag og score på prosentandelen av hyperplasi observert (p 0,05; t-Student).
Blant kontroll mus Layer poengsum var en for 4 av 6 mus og 2 for 2 av 6 mus. Globalt hyperplasia stillingen 1 for 5/6 og 2 for 1/6 mus. Motsatt av
R26-akt1
E17K
mus Layer Poengsummen ble en for 1/6 mus og 2 for 5/6 mus og Global hyperplasi stillingen 1 for 2/6 , 2 for 2/6 og 3 2/6 for mus. Til slutt fant vi ut at
R26-akt1
E17K
mus presentert en kombinert poengsum av hyperplasi på 3,8 ± 0,4 som var betydelig høyere enn i kontrollmusene (2,5 ± 0,3) ( n = 6 /gruppe; p. 0,05)
Deretter undersøkte vi om hyperplasic lesjoner observert var proliferativ eller alderdom relatert ved immonostaining av Ki67 og p21. Resultatene er oppsummert i tabell 2 og representative bilder av farging for Ki67 og p21 i mus lungene er vist i S3 fig. Vi har funnet at det gjennomsnittlige antall Ki67-positive kjerner i transgene K26-AKTE17K mus (11,1 ± 1,2, n = 5) var mer enn 2 ganger høyere sammenlignet med kontrollmus (4,6 ± 0,49, n = 3). Derimot ble det ikke observert noen signifikant forskjell av p21 farging. Disse resultatene tyder på at hyperplastic lesjoner forårsaket av akt1
E17K i lungen av transgene mus er et resultat av økt celledeling.
Det er verdt å merke at etter 18 måneder fra behandlingen, to av syv
R26-akt1
+ /E17K
mus behandlet med Ad-Cre utviklet et enkelt nodule hver, som ble diagnostisert som bronchio-alveolar adenokarsinom med papillær mønster bestående av ledninger og reir av epitelceller omgitt av glissen fibrovascular stroma (fig 3D). Farging analyse viste høye nivåer av Pakt i hyperplastisk og neoplastiske lesjoner av
R26-akt1
E17K
mus infisert med Ad-Cre sammenlignet med lunger fra ikke-infiserte mus (fig 4A -4C).
Pakt farging av lunge vev fra
R26-akt1
E17K
mus behandlet med løsemiddel alene (A) eller infisert med Ad-Cre etter 9 og 18 måneder fra smitte, henholdsvis (B, C).
i konklusjonen, ser det ut til at den muterte akt1
E17K allel induserer moderat hyperplasi av bronkiene og /eller terminal bronchioli at i langsiktig og ved lav frekvens, kan utvikle seg til utilslørt carcinoma.
Mutant akt1
E17K samarbeider med kjemiske karsinogener
i humane celler, akt1
E17K fremmer spredning og migrasjon når det uttrykkes i bronchial celler udødeliggjort av den Adeno 12 /SV0 hybridvirus [30]. For å undersøke om akt1 mutasjoner er i stand til å samarbeide med andre onkogene treff også
in vivo
, vi gjort bruk av etylkarbamat (uretan), en kjemisk forbindelse som er tilstede i røyk som har vært mye brukt til eksperimentelt modellere flertrinns lunge kreft [41].
R26 eller R26-akt1
E17K
kullsøsken ble enten infisert med Ad-Cre (10
6-10
7 PFU) eller behandlet med løsemiddel alene før de blir utsatt for uretan (1 mg /g) og analysert etter 6 eller 9 måneder. Mangfold og størrelse av svulster /lunge ble funnet å være betydelig høyere i
R26-akt1
E17K
mus infisert med Ad-Cre. Å være relativt motstandsdyktig mot uretan,
R26-akt1
E17K
mus som ikke hadde vært tidligere utsatt for Ad-Cre utviklet knuter i en av seks mus i 6 måneder, og i en av 4 mus på 9 måneder etter uretan administrasjon, henholdsvis (figur 5A). Omvendt, nesten alle
R26-akt1
E17K
mus som hadde blitt smittet med Ad-Cre før av uretan administrasjon, presenterte lunge knuter både etter 6 (n = 4) og 9 (n = 6) måneders behandling. Gjennomsnittlig antall svulster utviklet av mutante mus behandlet med uretan og infisert med Ad-Cre var 3 /mus på 6 måneder og 7 /mus på 9 måneder; omvendt, mus behandlet bare med uretan utviklet 0,15 svulst /mus på 6 måneder og 1,6 svulster /mus på 9 måneder (figur 5A). Spesielt, størrelsen av tumorene utviklet av mutante mus ved infeksjon med Ad-Cre var avhengig av dosen av Ad-Cre administrert (figur 5B).
A. Lungetumoren mangfaldet i
R26-akt1
E17K
infisert med Ad-Cre (6 og 9 måneder etter behandling, henholdsvis). Hvert punkt representerer en mus; barer representerer gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01, * p 0,05. B. Diameter på lungesvulster generert av uretan i
R26-akt1
E17K
mus behandlet med økende doser av Ad-Cre. Barer representerer bety diameter på svulst ± SD. * P 0,05. C, D. Representant H E farging av lungelesjoner utviklet i
R26-akt1
E17K
mus behandlet med løsemiddel eller Ad-Cre, som angitt, 9 måneder etter uretan administrasjon . E, F. Fosforylert AKT farging av lungelesjoner utviklet i
R26-akt1
E17K
mus behandlet med løsemiddel eller Ad-Cre, som angitt, 9 måneder etter uretan administrasjon. Forstørrelse som angitt.
Svulster generert av uretan i
akt1
E17K
bakgrunn ble diagnostisert som bronchio-alveolar adenomer /adenokarsinomer som presenteres oftere papillær mønster (fig 5C og 5D). En siste observasjon var at, i motsetning svulster som genereres i kontroll mus som viste liten eller moderat farging for Pakt, de som genereres i
R26-akt1
E17K
mus presentert en markert økning i Pakt farging (fig 5E og 5F). Til slutt, vi analysert
Kras
status i uretan-behandlede mus. DNA ble ekstrahert fra microdissected formalinfikserte parafin-innleiret tumorer av utvalgte uretan-behandlede mus (2 mus behandlet med uretan alene og 4 mus behandlet med uretan pluss Ad-CRE). Den region som spenner kodon 61 i ekson 3 av
Kras
genet ble amplifisert og underkastet Sanger DNA-sekvensering. Sekvensanalyse av tumorer viste nærvær av en A G overgang i kodon 61 som fører til Q61 erstatning med R. Se S4 Fig for representative kromatogrammene. Disse resultatene indikerer at akt1
E17K kan samarbeide med onkogene hendelser forårsaket av uretan i musen lunge (dvs.
Kras
gevinst på funksjons mutasjoner), og dermed akselerere progresjon til utilslørt svulster.
I musen, Clara celler linje bronchiolar epitel og uttrykke Clara celleassosiert protein 10 (CC10) mens alveolære type II (AT2) celler bor i alveolene og uttrykker overflateaktivt protein C (SPC) [42-44].
Derfor, for å karakterisere de cellene som utgjør de lungelesjoner indusert av akt1
E17K i mus, utførte vi indirekte immunfluorescens for SP-C og CC10 på FFPE- lunge seksjoner som stammer fra
R26-akt1
