Abstract
Bakgrunn
Kjemoterapi-indusert reduksjon i tumorbelastning er en funksjon av apoptotisk celledød, orkestrert av intracellulære kaspaser. Imidlertid er effektiviteten av disse behandlinger kompromittert av mutasjoner som påvirker spesifikke gener, kontrollere og /eller regulere apoptotisk signalering. Derfor er det ønskelig å identifisere nye veier for celledød, noe som kan fungere i tandem med eller i fravær av effektiv apoptotisk maskineri. I denne forbindelse, støtter nyere bevis på eksistensen av en ny celledødsreaksjonsveien betegnet autophagy, som blir aktivert ved vekstfaktor mangel eller eksponering for gentoksiske forbindelser. Den funksjonelle relevansen av denne veien i form av dens evne til å fungere som en stressrespons eller en virkelig død effektormekanisme er fortsatt i spørsmålet; men rapporter tyder på at autofagi er en spesialisert form for celledød under visse betingelser.
metodikk /hovedfunnene
Vi rapporterer her samtidig induksjon av ikke-kanoniske autofagi og apoptose i humane kreftceller ved eksponering til et lite molekyl forbindelse som utløser intracellulær hydrogenperoksyd (H
2o
2) produksjon. Mens stanse av beclin1 verken hemmet kjennetegnene ved autofagi eller induksjon av celledød, Atg 7 eller Ulk1 knockdown betydelig avskaffet legemiddelindusert H
2o
2-mediert autofagi. Videre gir vi bevis for at aktivert ekstracellulære regulert kinase (ERK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK) er oppstrøms effektorer kontrollerende både autofagi og apoptose i respons til økt intracellulær H
2o
2. Interessant, inhibering av JNK-aktivitet reverseres økningen i Atg7 ekspresjon i dette systemet, noe som indikerer at JNK kan regulere autofagi ved å aktivere Atg7. Av notatet, lite molekyl sammensatt utløst autofagi og apoptose i primære celler avledet fra pasienter med lymfom, men ikke i ikke-transformerte celler.
Konklusjon /Betydning
Med tanke på at tap av tumor suppressor beclin 1 er assosiert med neoplasi, kan evnen til dette lille molekylet sammensatte å engasjere både autophagic og apoptotiske machineries via ROS produksjon og påfølgende aktivering av ERK og JNK har potensielle translasjonsforskning implikasjoner
Citation. Wong CH, Iskandar KB, Yadav SK, Hirpara JL, Loh T, Pervaiz S (2010) Samtidig Induksjon av Non-Canonical Autophagy og apoptose i kreftceller ved ROS-Dependent ERK og JNK aktivering. PLoS ONE 5 (4): e9996. doi: 10,1371 /journal.pone.0009996
Redaktør: Gian Maria Fimia, INMI, Italia
mottatt: 03.12.2009; Godkjent: 07.03.2010; Publisert: 02.04.2010
Copyright: © 2010 Wong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd til SP fra National Medical Research Council, Singapore, Biomedical Research Council, Singapore, Ministry of Education (MOE-Tier 2), Singapore, og forskningsmidler fra Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er nå godt etablert som kjemoterapi-indusert reduksjon i tumorbelastning er en funksjon av apoptotisk celledød, orkestrert av intracellulære caspase proteaser. Imidlertid er effektiviteten av noen av disse behandlinger avstumpet ved mutasjoner som påvirker spesifikke Effektor genene som kontrollerer og /eller regulerings apoptotisk signalering, for eksempel epigenetisk stanse av kaspase 8, nedregulering av pro-apoptotiske proteiner Bax og Apaf-1, så vel som oppregulering av anti-apoptotiske proteiner av BCL-2 og IAP familier. Derfor har det vært en økning av aktivitet rundt identifisering av nye veier for celledød, noe som kan fungere i tandem med eller i fravær av effektiv apoptotisk maskineri. I denne forbindelse har nyere bevis fremhevet at det foreligger en ny, caspase-uavhengig reaksjonsvei, betegnet autophagy, som aktiveres som respons på vekstfaktor mangel eller ved eksponering for genotoksiske forbindelsene [1]. Mens juryen er fortsatt ute på den funksjonelle relevansen av denne veien i form av dens evne til å fungere som en stressrespons eller en virkelig død effektormekanisme, synes siste bevis for å støtte at autofagi er en spesialisert form for celledød under visse betingelser [ ,,,0],2], [3], [4].
blant de forskjellige effektor mekanismer som er involvert i kontroll og regulering av celledødsreaksjonsveier, inkludert apoptose og autofagi
, er den cellulære redoks status. Redoks-status av cellen er bestemt av balansen mellom satsene for produksjon og nedbrytning av reaktivt oksygen og /eller nitrogenforbindelser (ROS; RNS) [5], slik som superoksid anion (O
2
-) , hydrogenperoksid (H
2o
2), hydroksyl-radikal (OH), nitrogenoksid (NO) og hypochlorus syre (HOCl) [6]. Vi har tidligere vist at tumorcellerespons til døden stimuli er en funksjon av cellulære redoks status, og stimuli, spesielt dødsinduserende stoffer, som induserer en signifikant økning i intracellulær H
2o
to lette død utførelse [7 ], [8], [9], [10] [11], [12], [13], [14], [15].
Interessant ROS har også vist seg som sterke signaler for aktivering av mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) familie av signaleringsproteiner bestående av c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 og ERK [16]. MAPK familiemedlemmer er aktivert i en 3-lags kinase kaskade bestående av MAPK kinase kinase (MAPKKK), MAPK kinase (MAPKK) og MAPK [17]. Vedvarende aktivering av JNK er direkte knyttet til en økning i intracellulær produksjon ROS [18], og en mulig mekanisme kan være gjennom inaktivering av MAPK fosfataser (MKP) [6]. Av notatet, en økning i intracellulær ROS samt aktivering av MAPK er vist ved autophagic utførelse [19], [20].
Autophagy har blitt godt anerkjent som søppeltømming av cellen, blir hovedsakelig involvert i lagring av plasmamembranen og langlivede organeller i autophagosomes, som til slutt smelter sammen med lysosomer for nedbrytning og resirkulering av næringsstoffer [21], [22]. Enda viktigere, vedvarende autophagy i respons til cellulære spenningstilstander tjener som en potent død signal [23], [24], [25], som når det gjelder terapi-fremkalt autophagy, utløste en spesifikk ikke-apoptotisk død vei ved eksponering overfor kjemoterapeutiske stoffer [26]. Sistnevnte danner grunnlaget for identifisering av type II celledød, preget av overdreven autophagosome formasjon [27], [28]. Paradoksalt basal nivå av autofagi indusert av stress som hypoksi og vekstfaktor abstinens tips mobil skjebne mot overlevelse [29], [30], [31].
Aktivering av den kanoniske autophagy veien er kritisk etter kontroll av BH-3 bare Bcl-2-protein interaksjon, Beclin1 [32]. Spesielt, har nyere bevis raknet en roman autophagic celledød sti der Beclin1 er helt unnværlig [33]. Dette kan være av avgjørende betydning som gjennomføring av ikke-kanoniske autofagi i kreftceller som bærer en Beclin1 knockout fenotype, kan representere en ny og effektiv strategi for å indusere kreft celledød [34].
Her rapporterer vi mekanismen av celledød indusert i humane tumorceller ved en ny lite molekyl forbindelse, 1,3-dibutyl-2-thiooxo-imidazolidin-4,5-dion (C1). Eksponering av human kolorektal karsinom og en rekke andre tumorcellelinjer til C1 resulterte i celledød med morfologiske og biokjemiske egenskaper er forenlige med ikke-kanonisk autofagi og apoptose. Videre viser vi den befruktende involvering av tidlig ROS produksjon og ERK og JNK aktivering oppstrøms av autophagic og apoptotiske veier. Dette er en roman rapport fremhever samtidig induksjon av Beclin1 uavhengig autofagi og apoptose i tumorceller ved et lite molekyl sammensatt, noe som kan ha store kliniske implikasjoner, vurderer den relativt høye forekomsten av Beclin1 tap i humane kreftformer.
materialer og metoder
reagenser og kjemikalier
den pan-caspase-hemmer, ZVAD-FMK, og caspase 3 og 9 hemmere (DEVD-FMK og VEHD-FMK) ble hentet fra Alexis Biochemicals ( Lausen, Sveits). JNK-inhibitor (SP600125), ERK-inhibitor (PD98059), bovin katalase, Earles Balanced Salt Solution (EBSS) medium, rapamycin, dietylditiokarbamat (DDC), E64D, pepstatin-A, 3-metyladenin, C2-ceramid, N-acetyl- -cysteine, krystallfiolett, og MTT ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Superoxide dismutase (SOD) ble kjøpt fra Calbichem (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) ble oppnådd fra Upstate (Millipore, MA).
tumorcellelinjer
HCT116 kolorektal karsinom-celler ble generøst tilveiebragt av dr Bert Vogelstein (The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) og vedlikeholdes i McCoy 5A (Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) supplert med 10% føtalt bovint serum FBS), 1% L-glutamin og 1% S-Penicillin (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA) i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2. HeLa cervikal karsinom, A549 småcellet lungekarsinom, M14 melanom, SHEP1 og SHSY5Y neuroblastom-cellelinjer ble oppnådd fra ATCC og holdt i DMEM (Hyclone) supplert med 10% FBS. MCF-7, T47D, og MB-MDA231 brystcancercellelinjer var fra ATCC og dyrket i RPMI (Hyclone) supplert med 10% FBS. HK-6, C666-1 nasopharyngeal carcinoma cellelinjer, ressurssterke av Dr. Lo Kwok-wai (The Chinese University of Hong Kong) og Dr. Hsieh Wen-sønn (Johns Hopkins Singapore), ble opprettholdt i RPMI supplert med 10% FBS .
Transfeksjon med pGFP-rLC3 og siRNA
for transient uttrykk, celler ble transfektert med 8 mikrogram pGFP-LC3 eller pCINeoEV eller pCIneo + Cat plasmider i Optimem1 ™ medium (Invitrogen Corporation, Carlsbad , CA) ved hjelp av Superfect transfeksjon reagens (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. For knockdown av genekspresjon, 50 nM siRNA (beclin- en siRNA eller JNK1 /2 siRNA eller ERK1 /2 siRNA eller Atg7 siRNA eller ULK-en siRNA) ble transfektert inn i cellene i Optimem1 ™ medium ved hjelp av Dharmafect1 reagens ( Dharmacon) i henhold til produsentens instruksjoner.
Celleviabilitet og tumorkolonidannende analyser
Celleviabilitet følgende legemiddeleksponering ble bestemt av MTT analyse som beskrevet tidligere (14). For kolonidannende analyser, ble 10.000 celler sådd ut i petriskåler og dyrket i 2 uker. Platene ble deretter farget med krystallfiolett løsning (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) og kolonier ble scoret manuelt som beskrevet tidligere [35].
propidiumjodidfarging for DNA-fragmentering
Celler ble behandlet med C1 for de angitte tidspunkter som er beskrevet i figur sagn før propidiumjodidfarging for DNA-innhold analyse som beskrevet tidligere (14). Histogram data indikerer prosentandelen av celler med sub-diploid DNA er vist og er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige observasjoner.
flowcytometrisk analyse av intracellulær ROS
Celler ble lastet med 5 mikromol /L redoks-følsomt fargestoff 5- (og 6-) -chloromethyl-2-, 7-dichlorofluorescin diacetat (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) som beskrevet tidligere (14) og analysert ved hjelp av strømningscytometri (Coulter EPICS Elite ESP). Påvisning av intra-mitokondrie O
2
– ble utført ved å laste celler med MitoSox ™ RED MITOCHODNRIAL O
2
– indikatoren (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) som beskrevet tidligere og analysert av flowcytometri ( Coulter EPICS Elite ESP). Minst 10.000 hendelser ble analysert.
Isolering av mitokondrier
HCT116-celler behandlet med C1 til 6, 12 og 24 timer ble utsatt for mitokondriell ekstraksjon som beskrevet andre steder (14). De mitokondriale Pelletene ble lysert i standard 1xRIPA lyseringsbuffer og supernatanten ble benyttet som de cytosoliske fraksjoner.
Immunofluorescensanalyse av pGFP-rLC3 og akridinorange
Analyse av LC3 ble utført ved anvendelse av pGFP-rLC3 transfekterte celler ved immunofluorescens-mikroskopi. Etter transfeksjon med pGFP tom vektor eller pGFP-rLC3, ble celler inkubert med C1 i 6 til 24 timer og gjort synlige ved et fluorescerende mikroskop (Eclipse TE2000-S, Nikon) ved hjelp av eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjonsbølgelengde på 525 nm. For visualisering av lysosomer, ble celler behandlet i 6 timer og deretter farget med 2,5 pg /ml akridinorange (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) i 10 minutter ved 37 ° C, og analysert med hensyn på begge, grønn og rød flurorescence, ved hjelp av fluorescens mikroskopi som nevnt ovenfor.
elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC
Celler ble fiksert over natten i 2,5% glutaraldelhyde i 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,2), før de blir post-fiksert i 1% OSO4 i 1 time. Deretter ble cellene dehydrert i etanol serie og innleiret i Spurr harpiks s. Ultra tynne snitt ble farget med uranylacetat og føre citrate og observert under et JEOL JEM-1230 transmisjonselektronmikroskop.
Cvtotoksisitetsmålinq for primære celler fra lymfom vev
Primær svulstvev fra pasienter med T eller B-celle lymfom ble innhentet fra samtykkende pasienter ved Rikshospitalet i samsvar med godkjent IRB-protokollen. Vev ble hakket og silt gjennom MACS separasjonsfilter (Miltenyi Biotec) for å oppnå en enkelt cellesuspensjon. -Lymfocytter ble oppnådd etter Ficoll-Hypaque-sentrifugering. Celleviabilitet av primær lymfom /200 ul /brønn i 96-brønners plater ble bestemt ved MTT-assay etter eksponering for 25 og 50 ug /ml av C1 i 24 timer. MTT-analysen ble vurdert som beskrevet i det foregående avsnitt.
Western blot-analyse
Hele celleproteinekstrakter ble isolert ved anvendelse av 1 x RIPA-lysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl , 0,25% deoksykolsyre, 1% NP-40, 1 mM EDTA og proteaseinhibitorer (Calbiochem, San Diego, CA). like mengder av protein fra de totale cellelysatene (30 og 120 ug /felt) ble separert ved natriumdodecylsulfat (10%, 12% eller 15%) polyakrylamid-gel-elektroforese-geler (SDS-PAGE; BioRad Laboratories), overført til PVDF-membran (BioRad Laboratories) ved hjelp av våt-overføring (BioRad Laboratories) og blottet med primære antistoffer som er spesifikke for Bax, P62, LC3 , caspase 9, β-aktin, GAPDH, ULK1 (Santa Cruz Biotechnology), Beclin1, ATG7, ATG12, ATG5, cytokrom C, JNK, p-JNK, c-juni, pc-juni, Bud (Cell Signaling Technology), caspase 3 (Upstate, Millipore Corporation), caspase 8, Smac, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (BD Pharmingen) og Catalase (Calbiochem) og undersøkt med respektive sekundær isotype spesifikke antistoffer merket med pepperrot peroksidase (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL). Bundet immunkomplekser ble oppdaget ved hjelp WEST PICO Chemiluminescence substrat (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL).
Syntese og analyse av lite molekyl sammensatt C1
lite molekyl sammensatt 1,3- dibutyl-2-thiooxo-imidazolidin-4,5-dion, heretter kalt C1, ble syntetisert som følger: oksalylklorid ble tilsatt til 1,3-dibutyl-2-tiourea (10 mM) i vannfri eter i en rundbunnet kolbe under omrøring. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 til 2 timer ved omgivelsestemperatur og deretter helt over i mettet NaHCO
3. Produktet ble ekstrahert med 3 x ethylacetat. Etylacetatlaget ble deretter vasket med destillert vann og deretter saltvann. Etylacetatet ble deretter tørket med vannfritt Mg
2SO
4 og fjernet under redusert trykk. Rensingen ved flashkromatografi (etylacetat: heksan) ga det gule oljeprodukt. Det oljeaktige produkt ble størknet i et kjøleskap. Forbindelsen ble deretter analysert ved
1H NMR,
13C NMR og MS, og resultatene er presentert som følger:
Name: 1,3-dibutyl-2-thiooxo-imidazolidin-4,5-dion; Farge: Oransje; FT-IR (i CH
2 Cl
2): 2875-2960 cm
– (Alifatisk CH), 1770 (C = O), 1410 (C = S);
1H NMR (CDCh i
3): δ = 0,95 9 (t, J = 7,3 Hz, 6H, 4′-CH
3), 1,34 (sext, J = 7,7 Hz, 4H, 3 « -CH
2), 1,67 (kvint, J = 7,2 Hz, 4H, 2-CH
2) 3.93 (t, J = 7,5 Hz, 4H, 1′-CH
2);
13C-NMR (i CHCI
3): δ = 13,54 (C4 «), 19,90 (C-3»), 29.72 (C-2 «), 41,83 (C-1»), 155,35 (C- 4,5), 180,63 (C-2); Masse m /z (%): 242 (100) [M
+], 209 (26) [M + -HS], 187 (22); MF C
11H
18N
2o
2S beregnet 242,34, funnet 243,34
Utbytte:. 95%
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført på minst 3 ganger, med mindre annet er angitt. Eksperimentelle forskjeller ble testet for statistisk signifikans ved hjelp av Student
t
-test.
P
verdien av 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
C1 induserer celledød og MOMP i humane tumorceller
Eksponering av tumorceller. til økende konsentrasjoner (25-200 ug /ml) av C1 resulterte i en doseavhengig reduksjon i cellelevedyktighet ved 24 timer med en LD50 på ca. 100 ug /ml (figur 1B). Videre viste kolonidannelsesbestemmelsen en betydelig reduksjon i klonogene evne ved 25 og 50 ug /ml og et fullstendig opphør av kolonidannelse ved 100 ug /ml (figur 1C). Resultatene viste også at inkubasjon av celler med C1 utløst mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP) som gjenspeiles av translokasjon av cytokrom c og Smac, og gjensidig translokasjon av Bax og bud til mitokondriene (figur 1D). I tillegg oppnås det bevis for effektiv behandling av kaspaser 3, 8 og 9, og spaltning av caspase 3 underlaget PARP i totale cellelysater fra celler etter C1-behandling, som ble reddet i nærvær av zVAD-FMK (figur 1E, F ). Analyse av cellesyklusen viste 20% av cellene med sub-diploid DNA-innhold (sub-G1 populasjon) etter 24 timers behandling, noe som betydelig høyere (52%) ved inkubering i 48 timer og blokkert i nærvær av det pan-caspase inhibitor (figur 1G). Forbløffende nok zVAD bare delvis gir beskyttelse skjema C1-indusert celledød (figur 1 H). Disse data indikerte at C1-indusert celledød kan innebære caspase-uavhengig veier. For å undersøke dette, evaluerte vi først virkningen av nekrose inhibitor, necrostatin, videre C1-indusert celledød. Resultatene viste at mens necrostatin effektivt å kunne oppheve tumornekrosefaktor-α-indusert celledød (Supplementary fig S1A), hadde det ingen virkning på C1-indusert celledød, og derved utelukker involvering av nekrose i denne modellen (figur 1I).
(A) Kjemisk struktur og molekylvekten av forbindelsen C1. (B) Celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av C1 (25 ug /ml til 100 ug /ml) i 18 timer og celleoverlevelse ble bedømt ved MTT-assay. (C) Etter eksponering for C1 som i (B), ble 10,000 celler sådd ut på 100 mm petriskåler for vurdering av kolonidannelse. (D) Celler ble behandlet med C1 (100 ug /ml) i 6, 12 og 24 timer, og sub-cellulære fraksjoner ble underkastet Western blot-analyse. (E) Lysater fra celler behandlet med C1 (100 ug /ml) for ble probet for behandling av caspaser 3, 9 og 8. (F, G, H) Celler ble behandlet med C1 (100 ug /ml for 18 timer) i tilstedeværelse eller fravær av zVAD-FMK (50 uM) i 12 og 24 timer og (f) lysater ble probet for PARP-spaltning og (G) cellecyklus-profiler ble oppnådd ved PI farging og (H) overlevelse ble vurdert ved MTT-assayet . (I) Celler ble pre-inkubert med Necrostatin-1 (50 M i 1 time) før det utsettes for C1 (100 ug /ml for 18 timer), og overlevelse ble vurdert ved MTT-assay.
induksjon av Beclin1 uavhengig autofagi av C1
Deretter ble utført elektron mikroskopisk analyse av celle morfologi etter eksponering for C1. Intriguingly, eksponering av cellene for C1 (100 ug /ml i 24 timer) resulterte i dannelse av autophagosomes og autophagic vakuoler (figur 2A). I tillegg ble den økt ekspresjon av MAP1 LC3II (heretter referert til som LC3II) observert i en tidsavhengig måte (figur 2B). Legg spesielt merke, identifiserte vi for første gang LC3II berikelse i de tunge membranfraksjoner følgende medikamentell behandling (figur 2C). Dette kan indikere tilstedeværelse av mitokondriell engulfment av autophagic vakuoler. Dessuten, celler transfektert med LC3-GFP vises et diffust mønster, mens eksponering for C1 resulterte i en grønn farging punktformet, en indikasjon på LC3II opphopning innenfor de autophagosomal membraner (figur 2D). I tillegg ble det observert en signifikant økning i ekspresjonen av Atg7 og Atg5 sammen med en tilsvarende reduksjon i Atg12 uttrykk ved eksponering (6-24 timer) av celler til C1, noe som indikerer Atg5-Atg12 konjugasjon (figur 2E).
(A) HCT116-celler behandlet med C1 (100 ug /ml) i 24 timer, fiksert og sett under et elektronmikroskop (forstørrelse x 40 000). Piler indikerer tilstedeværelse av autophagosomes. (B) Lysater fra celler behandlet med C1 (100 ug /ml) ble probet for LC3II. (C) Western blotting-analyse av LC3II innenfor cytosolisk og mitokondrielle fraksjoner av celler etter eksponering til C1. (D) Cellene ble transient transfektert med GFP-vektor eller LC3-GFP i 48 timer, utsatt for C1 i 24 timer og deretter analysert ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Piler peker til den punktformet flekk indikerer LC3 II aggregering inn autophagosomes. (Mag: 40000 ×). (E) Etter C1 eksponering ble cellelysater undersøkt for Atg7, Atg5 og Atg12.
Neste vi undersøkt om det var tilstrekkelig autophagic fluks ved eksponering for C1. Autophagic fluks er avgjørende for hvorvidt autophagic last og montering endelig kommer lysosomene og er senere degradert. En av måtene å bestemme autophagic fluks er forbehandling med lysosomale hemmere, E64D og pepstatin A, før tillegg av stimulans. Lysosomale hemmere øke LC3 II formasjon, dels ved å blokkere autophagosomal-lysosomal fusion. Derfor, undersøkte vi effekten av lysosomale inhibering på C1-indusert LC3II formasjonen. Våre resultater viste at inhibitorene økte LC3II omsetning i cellene ved tidlige tidspunkter (6 timer), men det var ingen ytterligere økning ved lengre inkubasjon (24 timer) med forbindelsen (Supplementary figur S1E). Vi sjekket for uttrykket nivået av p62 /SQSTM1, en markør for autophagic flux [36]. Nivåene av p62 redusert på C1 behandling på tidlige tidspunkter som indikerer effektiv autofagi, men nivåene økt senere (12-24 timer; Supplerende Figur S1F), som kan innebære muligheten for avvikende autophagic forandring. Sistnevnte observasjon ble videre støttet av bevis for lysosomal brudd, analysert ved acridinoransje, som rød fluorescens i sure avdelinger som lysosomene og grønt i nøytral pH. En økning i grønn flurorescence med en tilsvarende reduksjon i antallet røde flurorescence ble observert i celler som ved eksponering for C1, noe som indikerer brudd av lysosomene (Supplementary figur S1F).
For å vurdere rollen til Beclin1 i C1-indusert autofagi, RNAi-mediert stanse av
Beclin1
ble utført. Slå ned på
Beclin1
verken hemmet LC3II opphopning indusert av C1 og heller ikke kunne redde celler fra død utløser aktivitet av lite molekyl forbindelsen (figur 3A). Spesielt,
Beclin1
lyddemping effektivt kunne oppheve serum sult-indusert LC3II formasjon, noe som viser den klassiske rollen Beclin1 i sult-indusert autofagi (Supplementary figur S1C). I motsetning til
Beclin1
stanse, si
Atg7
resulterte i en betydelig reduksjon i LC3II opphopning indusert ved C1 eksponering mens apoptotiske signal (PARP cleavage) forble uendret (figur 3B). Samlet utgjør disse dataene gir sterke bevis for at eksponering av HCT116 cellene C1 utløser ikke-kanoniske autofagi, men innebærer mellomkomst av ubiquitin E1 enzym Atg7. Bekreftende disse funnene er resultatene oppnådd med genet knockdown av UNC-51 som kinase (ULK1 pattedyr-homolog av gjær Atg1), som på samme måte hemmet LC3II formasjon i denne modellen (figur 3C). Videre
a priori
behandling av celler med 3-MA (5 eller 10 mM) hadde praktisk talt ingen effekt på LC3 II opphopning indusert ved C1 (figur 3D). Viktigere, forbehandling av HCT116-celler med ZVAD-FMK, caspase 3-inhibitor eller caspase 9 inhibitor endret ikke akkumuleringen av LC3II I indusert av C1, noe som indikerer at signalene som regulerer apoptose ikke påvirke autophagic signalveien (figur 3E). Enda viktigere, stanse av Atg7 betydelig beskyttet HCT116-celler fra C1-indusert reduksjon i celle levedyktighet, noe som indikerer at autophagic signal kan være en effektiv celledød trigger (figur 3F). Som Beclin1 ikke var involvert i C1-indusert autofagi, knockdown av Beclin1 naturligvis ikke endre celledød respons (figur 3F). Men ULK lyddemping også hadde ingen signifikant effekt på celledød (figur 3F), og dermed argumentere for kompenserende effekten utøves av andre prominente
ATG
gener.
(A), (B) og (c) Cellene ble transient transfektert med siRNA mot Beclin1, eller ATG7 eller ULK1 i 48 timer etterfulgt av eksponering til C1 (100 ug /ml) i 24 timer. Helcellelysater ble deretter undersøkt for LC3II. (D) Cellene ble preinkubert med 3-MA (5 eller 10 mM) i 1 time før eksponering til 100 ug /ml av C1 i 18 timer. Lysates ble deretter immuno-strøket med anti-LC3. (E) Celler ble forbehandlet med ZVAD-FMK (50 uM), caspase 3-inhibitor (50 uM) eller caspase 9 inhibitor (50 uM) før tilsetning av 100 ug /ml av C1 i 18 timer. Lysatene ble deretter immuno-blottet med anti-PARP og anti-LC3 antistoff. (F) Celler ble transfektert med siRNA mot Beclin-1 eller Atg7 eller ULK1 og deretter eksponert for 100 ug /ml av C1 i 18 timer. Celleviabilitet ble vurdert av MTT analyse som beskrevet i materialer og metoder.
For å dokumentere at autofagi-induserende effekten av dette lite molekyl forbindelsen ikke var begrenset til tykktarmskreft cellelinje, LC3II formasjonen var vurderes i 9 andre menneskelige kreftcellelinjer med varierte opprinnelse. Faktisk ble det observert en økning i LC3II formasjon i alle cellelinjene som ble testet, men ved forskjellige medikamentkonsentrasjoner (Figur 4A). Det bør bemerkes at, i likhet med HCT116-celler, disse cellelinjene ble også følsomme for apoptose-induksjon ved C1 (data ikke vist). For ytterligere å undersøke den translatoriske Betydningen av disse resultatene oppnådd med etablerte cellelinjer, vi neste testet effekten av C1 på ikke-transformerte celler (MCF-10A og MRC-linjer), så vel som på primære celler oppnådd fra pasienter med lymfomer. I motsetning til kreftceller, har ikke-transformerte celler som ikke viser noen tegn til autophagy i respons til C1, sammenlignet med HCT116-celler og MDA-MB-231-celler (Figur 4B). Videre er en representativ prøve fra en pasient med kliniske lymfom tydelig fremkalt sterk LC3II formasjon som respons på eksponering for legemidlet (figur 4B). Enda viktigere, eksponering av primære celler avledet fra lymfompasienter (n = 12) viste doseavhengig følsomhet for C1, mens celler fra ikke-kreft lymfeknuter var relativt refraktære til behandlingen (figur 4C). Disse dataene klart fastslått at det lille molekylet forbindelsen C1 utløst og celledød i en rekke kreftcellelinjer og i primærceller, skåner ikke-transformerte celler.
(A) Primære kulturer av lymfom og godartede vev var dyrket i 6-brønns plater og utsatt for C1 25 og 50 ug /ml i 24 timer og celleoverlevelse ble bestemt ved MTT-assay. (B) Primære lymfomceller, MDA-MB-231 brystkreftceller, MCF10a mammary epitelceller, HCT116 kolorektal celler og MRC-5 humane lungefibroblaster ble behandlet med C1 ved forskjellige doser i 18 timer. Cellelysater ble deretter være immun-strøket med anti-LC3 med GAPDH som lasting kontroll. (C) Tumorceller fra forskjellige linjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av C1 i 24 timer og de totale cellelysatene ble undersøkt for LC3 II og β-aktin.
Intracellulær ROS styrer C1-indusert autophagy og apoptose
Etter å ha klarlagt evne C1 samtidig indusere autofagi og apoptose i kreftceller, setter vi ut for å undersøke molekylære mekanismen (e) bak denne biologisk aktivitet. Først vurderte vi effekten på intracellulær ROS produksjon ved hjelp av to ulike fluorescerende prober (MITOSOX ™ rød og CM-DCHF-DA). Faktisk, eksponering av celler til C1 resulterte i en betydelig økning i intracellulær ROS produksjon målt ved H
2o
2-sensitve sonde CM-DCHF-DA, så vel som en økning i intra-mitokondriell O
2
– produksjon (figur 5A). Pre-inkubasjon av celler med ROS åtseldyr N-acetylcystein (NAC; 200 mm) eller H
2o
2 åtseldyr, katalase (7000 enheter /ml), fullstendig blokkert økningen i CM-DCHF-DA fluorescens, sterkt tyder på at ROS-artene som er involvert er H
2o
2 (figur 5B). Bekreftende disse funnene ble overekspresjon av human katalase funnet å oppheve C1-indusert ROS produksjon, vurderes av CM-DCHF-DA farging (figur 5A). Interessant, katalase pre-inkubering, så vel som transient overekspresjon av plasmid inneholdende humant katalase-genet også hemmet C1-indusert PARP-spaltning, en markør for caspase 3 aktivering (figur 5B). En tilsvarende inhiberende effekt av katalase (eksogent tilsetning samt overekspresjon) og NAC ble observert på LC3II opphopning indusert av C1 (figur 5C). Disse dataene sterkt implisere intracellulær H
2o
2 som oppstrøms stimulus som styres både autofagi og apoptose i denne modellen.
I alt 1 × 10
6 celler ble inkubert med 100 mikrogram /ml C1 i 3 timer og (Ai) intra-mitokondrie O
2
– ble bestemt ved hjelp av fluorescerende fargestoff MitoSox ™ RED mitokondrie~~POS=TRUNC O
2
– Indicator og intracellulær H
2o
2 ble oppdaget av DCHF-DA lasting og analysert av flowcytometri. (Ai) Celler ble pre-inkubert med katalase (7000 enheter /ml) eller NAC (200 pM) i 1 time før behandling med C1 (100 ug /ml i 3 timer) og intracellulær H
2o
2 var fast bestemt. (Aii) Cellene ble transient transfektert med 8 mikrogram pCINeoEV eller pCIneo + CAT i 48 timer (AIII) og behandlet med C1 (100 mikrogram /ml i 3 timer) og intracellulær H
2o
2 ble bestemt (Aii ). Celler ble pre-inkubert med katalase (7000 enheter /ml i 1 time) eller ble transient transfektert med pCINeoEV eller pCIneo + CAT før eksponering til C1 (100 mikrogram /ml i 24 timer), og totale cellelysater ble immunblottet for (B)
