Abstract
Thiosemicarbazones (TSC-ene) er en interessant klasse av ligander som viser et variert utvalg av biologisk aktivitet, inkludert anti-fungal, anti-virus og anti-kreft effekt. Våre tidligere studier har vist potent
in vivo
anti-tumor aktivitet av nye TSC-ene og deres evne til å overvinne motstanden mot klinisk brukes kjemoterapeutika. I denne studien ble 35 nye TSC-ene av 6 forskjellige klasser designet ved hjelp av en kombinasjon av retro-fragmenter som vises i andre TSC-ene. I tillegg, di-substitusjon ved terminalen N4 atom, som tidligere ble identifisert til å være kritisk for potent anti-kreft-aktivitet, ble bevart ved inkorporering av et N4-baserte piperazin eller morfolin ring. Den anti-proliferative aktivitet av de nye TSC-ene ble undersøkt i en rekke kreft og normale celletyper. Spesielt er forbindelsene 1d og 3c viste den største lovende som anti-kreftmidler med potent og selektiv anti-proliferativ aktivitet. Struktur-aktivitetsforhold studier viste at de chelatorer som benyttet «myke» donoratomer, slik som nitrogen og svovel, resulterte i potent anti-kreft-aktivitet. Faktisk
N
,
N
,
S
donor atom sett var avgjørende for dannelsen av redoks aktive jernkomplekser som var i stand til å formidle oksidasjon av askorbat. Dette ytterligere understreker den viktige rollen av reaktive oksygenarter generering i å mediere potent anti-kreft-aktivitet. Betydelig, denne studien identifiserte potent og selektiv anti-kreft aktivitet av 1d og 3c som garanterer videre undersøkelse
Citation. Serda M, Kalinowski DS, Rasko N, Potůčková E, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R, et al. (2014) Exploring the Anti-Cancer aktivitet av Novel Thiosemicarbazones generert gjennom en kombinasjon av Retro-Fragments: Disseksjon av kritiske struktur-aktivitetsforhold. PLoS ONE 9 (10): e110291. doi: 10,1371 /journal.pone.0110291
Redaktør: Ashley I. Bush, Universitetet i Melbourne, Australia
mottatt: 7 august 2014; Godkjent: 10 september 2014; Publisert: 16 oktober 2014
Copyright: © 2014 serda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering:. Forfatterne satte pris på økonomisk støtte fra Twing og DoktoRIS PhD-stipend, NCN (DEC-2011/01 /N /NZ4 /01166, 2013 /09 /B /NZ7 /00423 og N405 /068 440), og Nasjonalt senter for forskning og utvikling, Warszawa (Organomet No: PBS2 /A5 /40/2014 tilskudd). Dette arbeidet ble også støttet av et prosjekt Grant fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia til DRR [Grant 632778]; og DSK [Grant 1048972]; en NHMRC Senior Principal Stipendiat til DRR [Grant 571123]; og en Helen og Robert Ellis Fellowship til DSK fra Sydney Medical School Foundation of The University of Sydney. EP og TS setter også pris på støtten fra en tsjekkisk Science Foundation Grant [13-15008S]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Jern er et vesentlig element som er nødvendig for en rekke cellulære prosesser, så som cellulær proliferasjon [1], [2], [3]. Faktisk er den jernholdige enzym, ribonukleotid redutase, er involvert i det hastighetsbegrensende trinn i DNA-syntese og er ansvarlig for omdannelsen av ribonukleotider til sine motstykker deoksyribonukleotid- [4], [5]. Viktigere, har endringer i jernmetabolismen av kreftceller i forhold til deres normale motstykker markert potensialet av jern-chelaterende behandling for å virke som en ny behandling avenue. Kreftceller demonstrere et høyere behov for jern enn normale celler, og dette understrekes av den økte ekspresjon av transferrin reseptor 1 (TfR1), som tar opp jernet fra den jerntransportproteinet, transferrin (Tf), på celleoverflaten [6] , [7], [8]. I tillegg er ekspresjonen av jern-avhengig enzym, ribonukleotidreduktase, vesentlig høyere på tumorceller enn normale celler [9]. Disse forhold medfører at tumorceller mer følsomme for jern-chelaterende
Selv om jern-chelatorer (
f.eks
, desferrioksamin, DFO). Har blitt klinisk anvendt for behandling av jernoverbelastningssykdom [1], [3- ], roman thiosemicarbazone (TSC) chelatorer har vært mye undersøkt som potensielle anti-kreftmidler [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Selv om de molekylære mekanismer som er involvert i aktiviteten av TSC-ene ikke er blitt fullstendig belyst, har et antall virkningsmekanismer blitt rapportert [3], [15], [21], [22], [23]. Dette inkluderer:
(
en
)
hemming av cellejernopptaket fra Tf [10], [13], [18];
(
2
)
mobilisering av jern fra celler [10], [13], [18];
(
3
)
hemming av ribonukleotidreduktase aktivitet [24], [25];
(
4
)
oppreguleringen av metastase suppressor protein, N-myc nedstrøms regulert gen 1 [26], [27], [28], [29]; og
(
5
)
formasjon redokse metallkomplekser som produserer reaktive oksygenforbindelser (ROS) [10], [15], [21], [23 ], [30]. Denne sistnevnte mekanismen er betydelig, særlig som studier har demonstrert den viktige rolle ROS generering i å øke den selektive aktivitet av chelatorer mot tumorceller [10], [15], [21].
TSC, 3- aminopyridin-2-karboksaldehyd thiosemicarbazone (Triapine, fig. 1), har blitt undersøkt i 20 fase i og II kliniske studier som en ny cancer kjemoterapeutisk [11], [31], [32], [33], [34 ], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]. Selv om kliniske forsøk med Triapine har generelt vist begrenset anti-tumor aktivitet [36], [37], [38], [40] Andre studier har vist positive resultater i lokalavansert livmorhals og vaginal kreft når det gis sammen med cisplatin og radiochemotherapy [33], [34]. Kjente bivirkninger observert på Triapine administrasjon omfatter methemoglobin dannelse og hypoksi [35], [39], [41] og disse problemene har nødvendiggjort utvikling av andre mer aktive og selektive TSC-ene med potent anti-kreft aktivitet.
flere klasser av TSC-ene er blitt utviklet som potensielle anti-proliferative midler (Fig. 1), et antall som viser markert og selektive anti-tumor-aktivitet både
in vitro product: [10], [15] , [21], [42] og
in vivo product: [12], [21], [26], [42]. For eksempel, en fem dagers behandling med di-2-pyridylketone 4,4-dimetyl-3-thiosemicarbazone (Dp44mT, Fig. 1) ved 0,4 mg /kg hos mus reduserte veksten av en murin M109 lungekarsinom til 47% av kontroll [21]. I tillegg Dp44mT viste potent og selektiv anti-tumor aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
mot en rekke menneskelige tumorxenografter [42] og var i stand til å danne redokse metallkomplekser som genererer ROS [15], [21], [30]. Selv om denne TSC viste stort potensial, det demonstrert hjertefibrose ved høye, ikke-optimale doser [42]. Således var nødvendige for nærmere undersøkelser i Dp44mT analoger og har resultert i utviklingen av di-2-pyridylketone 4-cykloheksyl-4-metyl-3-thiosemicarbazone (DPC, Fig. 1) [12], [26]. DPC har vist selektiv
in vitro Hotell og
in vivo
anti-tumor aktivitet av både intravenøs [12], [26] og muntlig ruter [12] og blir nå evaluert videre for inngang i kliniske studier. Nylig har andre TSC-ene også blitt vist å ha en ny anvendelse som fotodynamisk terapi forsterkere [43].
Vi har tidligere undersøkt en rekke kinolon-baserte TSC-ene som påviser
in vitro anti-
proliferativ aktivitet [16]. I dagens etterforskning, syntetisert vi 35 nye TSC-ene på 6 klasser som ble designet av den kombinasjon av aktive fragmenter til stede i tidligere rapporterte analoger [16], [44]. Tidligere studier viste at di-substitusjon på terminalen (N4) nitrogen er avgjørende for effektiv anti-kreft-aktivitet [12], [21]. I foreliggende studie har vi bevart di-substitusjon på N4-atomet gjennom bygging av en N4-baserte piperazin eller morfolin-ring, et fragment som er tilstede i flere aktive TSC-ene [45], [46]. Den anti-proliferativ aktivitet og selektivitet av disse nye TSC-ene ble undersøkt
in vitro
mot humane cancercelletyper og normale humane dermale fibroblaster (NHDF) celler. De serie som viste evne til å danne redokse jernkomplekser og megle oksidasjon av askorbat viste potent anti-proliferativ aktivitet, fremhever betydningen av ROS generasjon i sin anti-kreft aktivitet.
Materialer og metoder
De reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), ACROS Organics (Geel, Belgia) eller Princeton Chemicals Ltd (Luton, Bedfordshire, UK). Silikagel 60 (0,040-0,063 mm; Merck, Darmstadt, Tyskland) ble brukt for kolonnekromatografi. Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført på aluminiumoksyd-støttet silikagel 40 F
254-plater (Merck). Platene ble belyst under UV (254 nm) og evaluert i joddamp. Smeltepunktene ble bestemt på et Optimelt MPA100 instrument (Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA) og er ukorrigerte. Høyoppløselig-massespektrometri ble utført for alle nye forbindelser på en Finnigan MAT95 spektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland), eller på en Mariner ESI-TOF spektrometer (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) (HRMS) analyse.
Alle
1H og
13C-NMR spektra ble registrert på et Bruker AM-400 spektrometer (399,95 MHz for
1 H, 99,99 MHz for
13C, BrukerBioSpin Corp., Coventry, UK) . Kjemiske skift er angitt i ppm mot den indre standard, Si (CH
3)
4. Lett utskiftbare signalene ble utelatt når diffuse. Synteser ble utført på en CEM-DISCOVERY mikrobølgeovn reaktor (CEM Corporation, Matthews, NC, USA) med temperatur og trykkontroll.
Logg
P
calc verdier ble beregnet ved hjelp av ChemDraw 12 (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) ved å utføre Crippens fragmentering [47], Viswanadhan fragmentering [48] og Broto metode [49] og deretter beregne gjennomsnittlig log
P
calc.
Syntese av thiosemicarbazide Forløpere (a-f)
Generell metode I.
N
alkyl eller
N
aryl piperazin ( 6 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av 1,1′-tiokarbonyldiimidazol (6 mmol; 1,068 g) i 25 ml diklormetan, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur. Det organiske oppløsningsmiddel ble fraskilt og ekstrahert 3 ganger med vann, deretter tørket over vannfritt magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert for å gi rå piperazinderivater. Disse urene produkter ble anvendt i det neste trinn uten ytterligere rensing. Disse mellomprodukter ble tilsatt til en oppløsning av hydrazinhydrat i 25 ml etanol ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble tilbakeløpskokt i 3 timer og avkjølt for å oppnå et hvitt bunnfall som ble oppsamlet
via
filtrering som det endelige produkt (Fig. 2). Alle oppnådde tiosemikarbazider ble krystallisert fra metanol. Se Fil S1 for strukturelle karakterisering detaljer og krystallstrukturen (fig. S1 i File S1) og data (tabell S1 i File S1) 4-etylpiperazin-en-carbothiohydrazide (a).
Generelt fremgangsmåte II.
Karbondisulfid (CS
2) (0,2 mol, 12,06 ml) ble tilsatt dråpevis i løpet av 15 min til
N
-methylcyclohexylamine (0,2 mol, 26,3 ml) i NaOH -løsning (0,8 M, 250 ml). Reaksjonsblandingen ble intensivt omrørt i 20 min og deretter natriumkloracetat (0,2 mol) ble tilsatt til oppløsningen og omrørt i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert med konsentrert HCl (20 ml) for å gi den carboxymethylthiocarbamate mellomproduktet som et hvitt bunnfall. Den oppnådde carboxymethylthiocarbamate mellomprodukt (0,08 mol) ble deretter omsatt med hydrazin-hydrat (0,08 mol) i vann (10 ml). Denne reaksjonsblandingen ble forsiktig tilbakeløpskokt i 2 timer for å gi hvite krystaller av tiosemikarbazid (fig. 3). Sluttproduktet ble krystallisert fra metanol-vann (1/1,
v /v
).
Utarbeidelse av TSC Derivater
De hetero TSC analoger ble syntetisert ved omsetning av det respektive hetero keton eller karbaldehyd og tiosemikarbazid i henhold til mikrobølgebestråling. Ekvimolare mengder av det passende tiosemikarbazid (0,5 mmol) og karbonyl-forbindelse (0,5 mmol) ble oppløst i 4 ml EtOH med tilsetning av 0,1 ml eddiksyre som katalysator (fig. 4). Den resulterende blanding ble varmet opp i en mikrobølgereaktor ved 83 ° C /30 min (maks. Mikrobølgeeffekt 50 W). Etter avkjøling ble det utfelte faste stoffet ble filtrert og vasket med eter. Det endelige produktet ble renset ved hjelp av krystallisering (fra etanol eller metanol) eller kolonnekromatografi. Se Fil S1 for strukturelle karakterisering detaljer, krystallstrukturen (Fig S2 i File S1.) Og data (tabell S1 i File S1) på
Z Anmeldelser –
N
«- (di (pyridin -2-yl) metylen) -4- (pyridin-2-yl) piperazin-1-carbothiohydrazide (1d), og isosbestic kurver (fig. S3 i File S1).
HPLC-renhet data
Den endelige renhet TSC-ene ble bestemt ved hjelp av følgende generelle vilkår: Gynkotek HPLC System (Gynkotek); Pump T580; Autosampler GINA50 (Gynkotek); Detector DAAD UVD340U; Kolonne: Hilic Kinetex 100 Å (Phenomenex, Torrance, CA, USA); Strømning: 0,5 ml /min (0-1 min), 0,5 til 1,2 ml /min (1-3 min), 1,2 ml /min (3-7 min), 1,2 til 0,5 ml /min (7-8 min) 90% CH
2 Cl
2, 10% CH
3OH; UV 250 nm; Programvare: Chromeleon (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Se Fil S1 for HPLC renhet data (Tabell S2 i File S1).
Cell Culture
Den menneskelige kreftcelletyper (neuroepithelioma (SK-N-MC), tykktarmskreft (HCT116 med vill -type p53 (p53
+ /+)), Burkitt lymfom (Raji) og cervikal carcinom (HeLa)) celler og normale humane dermale fibroblaster (NHDF) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). HCT116 null p53 (p53
– /-) celler ble hentet fra Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Center og Institute of Oncology, Polen
SK-N-MC celler ble dyrket i minst viktig medium. (MEM, Life Technologies, Grand Island, New York, USA) inneholder 10% (v /v) serum fosterets storfe (FBS, Life Technologies), 1 mM natrium pyruvat (Life Technologies), 1% (v /v) ikke- essensielle aminosyrer (Life Technologies), 2 mM L-glutamin (Life Technologies), 100 U /ml penicillin (Life Technologies), 100 mikrogram /ml streptomycin (Life Technologies) og 0,28 mg /ml Fungizone (Bristol Myers Squibb Pharmaceuticals, Montreal , Canada). De HCT116 og NHDF-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich) supplert med 12% (volum /volum) varme-inaktivert FBS (HCT116, Life Technologies) eller 15% (v /v) FBS (NHDF; life Technologies), 100 mikrogram /ml gentamicin (Polfa Warszawa SA, Warszawa, Polen), 100 mikrogram /ml streptomycin (Polfa) og 100 U /ml penicillin (Polfa). De Raji og HeLa-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640, Sigma-Aldrich) med tilsetning av 10% (volum /volum) varme-inaktivert FBS (Life Technologies) og kosttilskudd er beskrevet for SK-N- MC celler ovenfor. Alle cellelinjer ble dyrket under standardbetingelser ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 og ble subdyrket hver 3-4 dager etter behov.
Proliferation Assay
cellene ble sådd ut i 96-brønners plater (SK-N-MC: 1,5 x 10
4 celler /brønn; HeLa: 5,0 x 10
3 celler /brønn; Raji: 3,0 x 10
3 celler /vel; HCT116: 3,5 x 10
3 celler /brønn; NHDF: 3,0 x 10
3 celler /brønn) 24 timer før tilsetningen av de nye forbindelsene. Analysene ble utført ved bruk av en 72 h (SK-N-MC, Raji, HeLa) eller 96 h (HCT 116, NHDF) inkubasjonsperioden med agenter ved 37 ° C. Disse seeding og vekstbetingelser ble anvendt, slik at cellene ikke kom til konfluens i løpet av inkuberingsperioder. I tillegg ble DFO og Dp44mT inkludert som positive kontroller i alle eksperimentene som deres aktivitet er godt beskrevet [21], [42], [50].
chelator-lagerløsninger ble fremstilt i DMSO og fortynnet i media slik at den endelige [DMSO] målt: 0,05%. Resultatene ble uttrykt som en prosentandel av kontrollen, og den resulterende IC
50-verdier ble beregnet ved bruk av GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). IC
50 ble definert som den konsentrasjonen som er nødvendig for å redusere absorbansen til 50% av den ubehandlede kontroll. Hver enkelt forbindelse ble testet i triplikat i et enkelt eksperiment, med hvert forsøk blir gjentatt tre ganger. Etter inkubering av HCT 116 og NHDF celler med de testede forbindelsene, 20 mL av CellTiter 96 Aqueous One Solution – MTS (Promega, Madison, WI, USA) oppløsning ble tilsatt til hver brønn (med 100 ul DMEM uten fenolrødt) og inkubert i 1 h /37 ° C. Den optiske tetthet av prøvene ble analysert ved 490 nm.
MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid) ble anvendt for å evaluere den anti-proliferative effekter av chelatorer i SK-N-MC og Raji celler. Etter inkubering med de undersøkte forbindelser, 10 ul av MTT (5 mg /ml i PBS, Sigma-Aldrich) ble tilsatt til hver brønn. Etter en 2-timers (SK-N-MC) eller 4 timer (Raji) inkubering ble platene sentrifugert, og cellene ble lysert med 100 ul 10% SDS-50% isobutanol i 0,01 M HCl (SK-N-MC ) eller DMSO (Raji). Absorbansen ble målt ved 570 nm. Den anti-proliferative effekter av disse nye agenter på HeLa-celler ble estimert ved hjelp av krystallfiolett-farging (0,5% krystallfiolett-løsning i 10 min). Til slutt ble brønnene skyllet med vann og cellene ble lysert med 2% SDS. Den optiske tetthet av prøvene ble analysert ved 595 nm.
Merking av Transferrin med
59Fe
jerntransportprotein, Tf (Sigma-Aldrich), ble merket med
59Fe (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA) for å danne
59Fe
2-Tf etter standardmetoder [6], [7]. Ubundet
59Fe ble fjernet ved passasje gjennom en Sephadex G25 kolonne og ble etterfulgt av uttømmende dialyse [6], [7].
Effekt av chelators på å mobilisere Cellular
59Fe
for å undersøke muligheten av de nye chelatorer for å mobilisere
59Fe fra SK-N-MC-celler,
59Fe effluks-eksperimenter ble utført ved anvendelse av etablerte teknikker [50], [51]. Monolaget av SK-N-MC-celler ble prelabeled i 3 timer ved 37 ° C i MEM inneholdende
59Fe
2-Tf (0,75 uM). Cellene ble deretter vasket fire ganger med iskald PBS og inkubert i ytterligere 3 timer ved 37 ° C med medium alene (kontroll) eller et medium inneholdende chelateringsmiddel (25 uM). Etter denne inkubering, det overliggende medium som inneholdt den frigjorte
59Fe ble skilt fra cellene ved bruk av en Pasteur pipette. Radioaktivitet ble målt både i celler og supernatant ved anvendelse av en γ-scintillasjonsteller (Wallac Wizard 3, Turku, Finland). I disse studiene, ble de nye ligander i forhold til de tidligere karakteriserte chelatorer DFO og Dp44mT, som deres evne til å mobilisere celle
59Fe har blitt omfattende undersøkt i disse celler [10], [12], [17], [18 ], [50].
Effekt av chelators på å forebygge Cellular
59Fe opptak
evne chelatorer for å hindre cellulært opptak av
59Fe fra
59Fe
2-Tf ble undersøkt ved bruk av standard fremgangsmåter [10], [14], [17], [18], [50]. Et monolag av SK-N-MC-celler ble inkubert med medium inneholdende
59Fe
2-Tf (0,75 uM) og chelateringsmidlet (25 uM) i 3 timer ved 37 ° C. Mediet ble deretter fjernet, og cellene ble vasket fire ganger med iskald PBS. Cellene ble deretter inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med den generelle protease, pronase (1 mg /ml, Sigma-Aldrich), for å fjerne membranbundet
59Fe. Cellene ble fjernet med en plastsparkel og sentrifugert ved 14 000 rpm /1 min til egne internalisert fra membranbundet
59Fe. Cellepelleten ble resuspendert i 1 ml PBS og internalisert
59Fe ble målt på en γ-scintillasjonsteller. Internalisert
59Fe opptaket ble beregnet som en prosentdel av kontrollen (bare medium). Igjen ble de nye ligander sammenlignet med DFO og Dp44mT som deres evne til å hemme cellulær
59Fe opptak har blitt grundig karakterisert ved anvendelse av SK-N-MC-celler [10], [14], [17], [18], [ ,,,0],50].
askorbat oksidasjon Assay
evnen hos jernkomplekser av de nye ligander for å mediere oksydasjon av den fysiologiske substrat, askorbat, ble undersøkt ved hjelp av etablerte metoder [10], [18 ], [22], [52], [53]. Askorbinsyre (100 pM) ble fremstilt umiddelbart før hvert forsøk, og ble inkubert i nærvær av Fe
III (10 uM, som FeCl ^
3), chelateringsmidlet (1-60 pM) og et 50-gangers molart overskudd av citrat (500 uM). Absorbansen ved 265 nm ble målt etter 10 og 40 minutter, og forskjellen i absorbans ved disse tidspunkter ble beregnet. Resultatene av disse forsøk ble uttrykt som jernbindende ekvivalenter (IBE) på grunn av den forskjellige denticity av de chelatorer undersøkt. De chelatorer, Dp44mT, DFO og etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ble anvendt som kontroller som evne av deres jernkomplekser for å oksidere askorbat har blitt grundig karakterisert v [10], [15], [52], [53].
Statistisk analyse
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD på minst 3 eksperimenter. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism v6 (GraphPad Software, Inc.) gjennomføre en enveis ANOVA med Bonferroni post-hoc test.
Resultater og Diskusjon
Drug Design
molekylære egenskaper som molekylvekt (MW) og beregnet oktanol-vann fordelingskoeffisient (log
P
calc) er viktige faktorer i den vellykkede utviklingen av legemiddelkandidater [54], [55]. Generelt gjennomsnittlig MW og logge
P
calc av legemidler som er lansert på markedet er 300-450 Da og 2-4, henholdsvis [56], [57]. Vurderer dette, klinisk trialed TSC, Triapine (MW: 195 Da; logge
P
calc: 0,761), representerer en interessant bly molekyl med en betydelig reserve i MW og logge
P
calc for modifisering.
Identifisere funksjonelle fragmenter for drug design er et komplekst problem som involverer ulike tilnærminger, inkludert de med en eksperimentell og teoretisk grunnlag. Sistnevnte består av en rekke metoder blant disse er de som er å identifisere fordelaktige sub-strukturer, stillaser og /eller linkere på basis av tidligere rapporterte forbindelser. Alternativt er fragmentering av organiske molekyler til mindre andeler en viktig metode i retrosynthetic analyse og har inspirert ulike pseudo-retrosynthetic tilnærminger [58]. Dette har identifisert fragmenter som kan være nyttig for drug design. For eksempel, di-2-pyridyl [12], [15], [21], [59], kinolinyl [60], piperazinyl [60], [61], [62], morfolinyl [63] og kinoksalinyl [ ,,,0],64] motivene er vanlige fragmenter i andre legemidler mot kreft, som har blitt innlemmet i utformingen av de nye TSC-ene rapportert her.
i denne studien, er den viktigste begrunnelsen for vår tilnærming var at den nylig syntetiserte TSC-ene bør bevare potent anti-kreft aktivitet av sine TSC forløpere, og samtidig beholde riktig MW og logge
P
calc verdier vise betydelige løftet som narkotika kandidater for legemiddelutvikling. Vi har anvendt en kombinasjon av retro-fragmenter som vist i andre TSC-forløpere [15], [16], [21], [44], [59] og andre anti-kreftmidler [60], [61], [62] , [63], [64]. I tillegg ble di-substitusjon ved terminalen N4-atomet bevart gjennom bygging av en N4-baserte piperazin eller morfolin-ring (fig. 5), en del som er observert i flere potente TSC-ene [45], [46].
Syntese av Novel ligander
thiosemicarbazide forløpere, af (fig. 5), ble syntetisert fra kommersielt tilgjengelige reagenser i en to-trinns prosess som ga moderat til høy avkastning (47- 95%). Behandling av bis (imidazol) tioketon med den passende piperazin, etterfulgt av omsetning med hydrazinhydrat gav
N
substituerte piperazin-baserte tiosemikarbazider i høyt utbytte (Fil S1). Den endelige thiosemicarbazone serien, 1-6 (fig. 5), ble syntetisert i moderat til høyt utbytte (58-96%) av Schiff-base-kondensasjon av det passende keton /aldehyd med de fremstilte tiosemikarbazider. Renheten av thiosemicarbazones ble bekreftet ved HPLC og var mer enn 95% (se tabell S2 i File S1)
Anti-proliferativ aktivitet av romanen Thiosemicarbazones mot en rekke kreftcelle-typer
evnen av de nye thiosemicarbazone serie 1-6 for å hemme cellulær proliferering av tumorceller ble undersøkt i en rekke kreftcelletyper (tabell 1), inkludert human p53 villtype og null tarmkreft (HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /-, henholdsvis), Burkitt lymfom (Raji), human cervical carcinom (HeLa) og neuroepithelioma (SK-N-MC) cancerceller. Evnen av disse nye midler til selektivitet mål-kreftceller ble bedømt ved å undersøke deres effekt på cellulær proliferasjon av en dødelig celle-type, nemlig normale humane dermale fibroblaster (NHDF) celler. Den anti-proliferative aktivitet av serien 1-6 er vist i tabell 1, og er også representert som fargekart (se fig. S4 i File S1). Effektene av disse nye ligander ble deretter sammenlignet med de følgende chelatorer som ble brukt som positive kontroller:
(
1
)
DFO, som er klinisk anvendt for behandling av jern overbelastning sykdom [1], [3] og
(
2
)
Dp44mT, en chelator med potent anti-proliferativ aktivitet
in vitro
og
in vivo product: [15], [21].
Som forventet fra våre tidligere studier [10], [14], [17], [18], [ ,,,0],50], kontroll chelator, DFO, viste dårlig anti-proliferative effekter i alt kreft og normale celle-typer, med IC
50 verdier i området mellom 4,74 til 25 um (tabell 1). I motsetning til dette viste Dp44mT selektiv og potent anti-kreft-aktivitet med IC
50 verdier på 0,002 til 0,04 pM, men var betydelig mindre effektive i dødelige NHDF celler (IC
50: 15,38 uM; Tabell 1).
i betraktning utviklingen av nye terapeutiske midler mot kreft, er det bemerkelsesverdig at en mangel på ekspresjon av tumor suppressor protein, p53, i noen tumorer hjelpemidler utviklingen av neoplastiske celler og fremmer motstandsdyktighet mot kjemoterapeutika [65], [66] . Således tilveiebringes anvendelsen av midler som er aktive mot både p53 tumorer villtype og null er avgjørende, spesielt i betraktning den høye forekomst av p53-mutasjoner i avansert kreft [42], [67]. Således vi først undersøkte anti-proliferativ aktivitet av de nye TSC 1-6 serie mot human HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- tykktarmskreftceller (tabell 1). Betydelig, anti-proliferative effekter av de fleste av de nye TSC-ene viste det samme generelle mønster av aktivitet mot HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- celler, uavhengig av p53-status (tabell 1). Det ble observert en bemerkelsesverdig unntak i aktivitet mellom disse to celletyper for forbindelse 3e, som viste en 100 gangers reduksjon i anti-proliferativ effekt når man sammenligner HCT116 p53
+ /+ (IC
50: 0,05 uM) og HCT116 p53
– /- celler (IC
50: 5 uM; Tabell 1). Imidlertid samlet, den anti-proliferative aktivitet av TSC-ene var generelt uavhengig av p53-status (tabell 1), som vist for andre forbindelser i denne klassen [16], [42]. Derfor er dette en viktig egenskap av TSC-ene som kan forklare deres markant aktivitet som har blitt observert med tilhørende midler på tvers av en rekke kreftcelletyper [42].
Av alle seriene av TSC-ene syntetisert i dette studie, disse analoger avledet fra di-2-pyridyl (1a-e) demonstrerte det mest potente anti-proliferativ aktivitet i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler, noe som resulterer i IC
50 verdier i området fra 0.0008-0.04 um (tabell 1). Mens analogene avledet fra kinolin-2-yl (2a-f) og 8-hydroxyquinolin-2-yl (3a-f) viste moderat anti-proliferative effekter (IC
50: 0,026 til 3,55 og 0,004 til 9,25 uM, henholdsvis). I motsetning til dette, slike chelatorer avledet fra 7-hydroxyquinolin-8-yl (4a-f), kinoksalin-2-yl (5a-f) og salicylsyre (6a-f) grupper viste dårlig anti-kreft-aktivitet (IC
50: 1.02- 25 mm) i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler (tabell 1)
En lignende generell trend i anti-proliferativ aktivitet av. nye TSC-ene til de som ble observert i HCT116 p53
+ /+ og p53
– /- celler ble også observert i Raji, HeLa og SK-N-MC-celler (tabell 1). Faktisk er de chelatorer som inneholder di-2-pyridyl-del (1a-e) var de mest potent anti-kreft (IC
50: 0,0003 til 2,21 uM) analoger undersøkt. Tilsvarende til de HCT116 data, forbindelser fra serie 2 vises generelt moderat anti-proliferativ aktivitet (IC
50: 0,04 til 5,14 uM) i Raji, HeLa og SK-N-MC-celler, mens serie 3, 4, 5 og 6 generelt viste moderat til dårlig anti-proliferative effekter (tabell 1).
Bare en svak til moderat korrelasjon (
R
2 = 0,01 til 0,6) var tydelig mellom den anti-kreft aktivitet av serien 1-6 og deres log
P
calc verdier, noe som tyder på at andre faktorer i tillegg til deres evne til tverrgående cellemembranen ved passiv diffusjon var kritiske i sine anti-proliferative effekter.
anti-proliferativ aktivitet av de nye Thiosemicarbazones mot Normal, Mortal celler
er viktig for en agent å være nyttig som et anti-kreft legemiddel, det må fremvise fortrinnsrett anti-proliferativ aktivitet mot tumorceller i løpet av normal, dødelige celletyper. Derfor var selektiviteten av de nye TSC-ene undersøkt i dødelige celler, nemlig NHDF celler. Av alle de undersøkte analoger, 1b, 1d, 2b, 2f og 3c viste den største anti-proliferativ aktivitet i de fleste kreftcelletyper (Tabell 1). Derfor, for å undersøke selektiviteten av de 5 beste TSC-ene som er identifisert ovenfor, nemlig 1 b, 1d, 2b, 2f og 3c, er en «terapeutisk indeks» ble beregnet ved å dividere NHDF cellen IC
50 ved IC
50 av den neoplastiske HCT116 p53
+ /+ eller HCT116 p53
– /- celletyper (tabell 2). Spesielt, selektivitet indeksen for Dp44mT sammenligne NHDFs til HCT116 p53
+ /+ eller HCT116 p53
– /- celletyper ble markert, blir 7690 og 3076, henholdsvis
Av. de 5 mest potente anti-kreft TSC-ene som her er beskrevet (tabell 1), den største terapeutiske indekser ble identifisert for 1d og 3c, og var 18-2650 (tabell 2). Denne høye selektivitet mot kreftcellene var på grunn av det faktum at både 1d og 3c viste potent anti-kreft-aktivitet (IC
50: 0,002 til 0,017 uM) i HCT116-celler, men deres cytotoksisitet ble sterkt redusert i NHDF celler (IC
50: 0,16 til 10,6 mm).
